全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-26
基金项目:山东省优秀中青年科研奖励基金(2006BS06012)
作者简介:朱辉(1981-),女,在读硕士,研究方向为分子微生物学;E-mail:hzhu2005@126.com
通讯作者:杜秉海,教授,Tel:86-0538-8242908;E-mail:bhdu@sdau.edu.cn
植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria,简称 PGPR)指自由生活在土壤或附生于植物
根际的一类可直接或间接促进植物生长、增强植物对逆境胁迫抵抗力的微生物[1]。PGPR对植物的生防作
用主要表现在防病和促进生长两个方面,对病害的防治机制包括拮抗、寄生、竞争、捕食等多种方式。目前,
研究较多的拮抗菌有芽孢杆菌、假单胞菌和放射性土壤杆菌等。芽孢杆菌产生的拮抗物质主要有抗生素、
细菌素、细胞壁降解酶类和其它抗菌蛋白及挥发性抗菌物质[2]。
植物 β-1,3-葡聚糖酶是植物病程相关蛋白(pathogenesis related protein,PR蛋白)的一种,能水解真菌
细胞壁中的 β-1,3-葡聚糖结构,对植物病原真菌具有体外抑菌活性[3,4]。真菌细胞壁约占真菌细胞干重的
20%~30%,具有使细胞免受物理伤害和维持细胞形状的功能。几丁质和葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的
枯草芽孢杆菌SC2-4-1葡聚糖酶基因gluB的克隆
及序列分析
朱辉 1 丁延芹 1 田方 1 姚良同 1 杜秉海 1,2
(1山东农业大学生命科学学院,泰安 271018;2山东农业大学农业微生物重点实验室,泰安 271018)
摘 要: β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表明,从辣椒根际筛选的拮抗菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC2-
4-1能产生 β-1,3-1,4-葡聚糖酶。以菌株 SC2-4-1的基因组 DNA为模板,用 PCR方法克隆了该菌的葡聚糖酶基因
gluB,其开放阅读框为711bp,编码237个氨基酸。Blast分析,该序列与已报道的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
ATCC 842的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB相似性为85%。所得基因序列的系统发育分析显示,该基因属于 β-1,3-
1,4-葡聚糖酶基因。DNAMAN软件比对,所得葡聚糖酶氨基酸序列具有催化裂解β-1,3-和 β-1,4-糖苷键的葡聚糖酶
活性位点。
关键词: 枯草芽孢杆菌 葡聚糖酶 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Glucanase Gene gluB of
Bacillus subtilis SC2-4-1
Zhu Hui1 Ding Yanqin1 Tia Fang1 Yao Liangtong1 Du Binghai1,2
(1College of Life Sciences,Shandong Agricultural University,Taian 271018;2Key Laboratory of Agricultural Microbiology,
Shandong Agricultural University,Taian 271018)
Abstract: De ection ofβ-1,3-1,4- glucanase activity reveals that antagonistic bacterium Bacillus subtilis SC2-4-1
screened from the rhizosphere of capsicum can produceβ-1,3-1,4-glucanase. Glucanase gene gluB of the strain was
cloned by PCR with genomic DNA of B. subtilis SC2-4-1 as template. Its open reading frame is 711bp coding 237
amino acids. Blast analysis reveals that glucanase gene sequence is identical toβ-1,3-1,4-glucanase gene gluB reported
from Paenibacillus polymyxa ATCC 842 at 85%level. Phylogenetic analysis of gene sequence reveals that the gene
belonged toβ-1,3-1,4-glucanase gene. Alignment using DNAMAN software showed that amino acid sequence of
glucanase has active site of glucanase catalyzingβ-1,3 andβ-1,4-glycosidic bond.
Keywords: Bacillus subtilis Glucanase Sequence analysis
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
主要成分,几丁质是由 N-乙酰-D-氨基葡萄糖以 β-1,4-糖苷键连接形成的不分支的链状结构,葡聚糖作为
填充物质分布于该网状结构的孔隙之中,其中,β-1,3-葡聚糖是组成真菌细胞壁的主要葡聚糖,β-1,4-键
也是形成葡聚糖的糖苷键之一[5]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶(简称 β-葡聚糖酶)是高效、专一分解 β-葡聚糖的主
要酶,对 β-1,3-葡聚糖和 β-1,4-葡聚糖都有作用。
Wichitra[6]等报道,枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)NSRS89-24产生的 β-1,3-葡聚糖酶能抑制立枯丝核
菌(Rhizoctonia.solani)和稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)的生长。Hong[7]等报道,一株类芽孢杆菌产生的 β-1,3-
葡聚糖酶能破坏植物病原真菌瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)和立枯丝核菌的细胞壁结构。姚乌兰[8]
等报道,多粘类芽孢杆菌 (Paenibaciluspolymyxa)WY110产生的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抗稻瘟病菌活
性。首次从由辣椒根际筛选的拮抗菌 B.subtilisSC2-4-1中克隆出葡聚糖酶基因,并对其序列进行了分析。
1 材料与方法
1.1 菌株和载体
实验中所用菌株和载体,见表 1。
1.2 培养基及主要试剂
细菌培养用 LB培养基。分子生物学试剂
购买于 TaKaRa公司,配制参阅文献[9]。
1.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测
将 B.subtilisSC2-4-1点种在含有 0.2%地衣多糖的 LB平板上,于 37℃培养约 24h后,用 0.1%的刚果
红溶液染色 5min,倒去染色液并用清水冲洗,观察是否出现透明水解圈。
1.4 目的基因的克隆
1.4.1 保守区域的克隆 以 B.subtilisSC2-4-1的 LB培养液提取基因组 DNA,方法参阅文献[10]。根据已
报道的 P.polymyxaWY110的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因引物:上游引物为 5-TTGCGAATGTGTTCTGGGAACC
-3、下游引物为 5-TACTAATTGCTCGTATATTTTACCCA-3,以基因组 DNA为模板进行 PCR扩增[8]。PCR反
应体系(50μl)为 10×PCRbufer(w/Mg)5μl,dNTPs(10mmol/L)1μl,上游引物(10μmol/L)5μl,下游引物(10
μmol/L)5μl,TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl,基因组 DNA0.5μl,DEPCtreatedH2O32.5μl。PCR反应程序为98℃
预变性 5min;94℃变性 30s;56℃退火 50s,72℃延伸 1min,循环次数为 30次;72℃终延伸 10min。扩增产物回
收按上海申能博彩 DNA凝胶回收试剂盒说明书进行。
1.4.2 全长基因的克隆 分析所得保守区域序列,结合已知的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因[11,12]设计兼并引
物,TLP:GTATCGATATGAAGGAGAAGTATTGG,TRP:ATAGATCTCTAATTGCTCGTATATT。PCR反应体系(50μl)
为:10×reactionbufer(20mMMg2+)5μl,dNTPs(10mmol/L)1μl,TLP(20μmol/L)2μl,TRP(20μmol/L)2μl,Taq
PlusⅠ(5U/μl)0.5μl,基因组 DNA0.5μl,DEPCtreatedH2O39μl。PCR反应程序为:95℃预变性 5min;94℃变
性 30s;55℃退火 1min,72℃延伸 1min,循环次数为 30次;72℃终延伸 10min。经 PCR扩增,获得目的基因的
全长。扩增产物回收按上海申能博彩 DNA凝胶回收试剂盒说明书进行。
1.5 DNA序列测定和分析
1.5.1 DNA序列测定 将琼脂糖凝胶电泳回收产物与 pGEM-Teasy载体连接,转化 E.coliDH5α感受态细
胞,采用蓝白筛选法和质粒快速检测法筛选重组子,选取阳性重组子送上海英俊生物技术有限公司进行测序。
1.5.2 基因序列初步分析 测序结果用 DNAMAN软件分析其开放阅读框,将所得序列通过 NCBI的
BLAST(blastn)(htp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列相似性分析。
1.5.3 基因序列系统发育分析 用 clustalX软件进行序列比对,缺口用“-”补齐,然后用 TREECONW建树
程序建立系统发育树。
1.5.4 与已知的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的比对分析 在不同生物体中葡聚糖酶的活性位点是高度保守
表 1 菌株和载体
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2008年第3期
的,2个谷氨酸残基在 β-1,3-和 β-1,4-糖苷键的裂解过程中起催化作用[5],分析所得序列看其保守区域是
否含有谷氨酸残基。将所得葡聚糖酶基因序列推测的氨基酸序列与已知的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的氨基酸
序列在 DNAMAN软件中进行比对。
2 结果
2.1β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测
将 B. subtilis SC2-4-1点种在含有地衣多糖的 LB平板上,培养约 24h后用刚果红溶液染色、清水冲洗。
因刚果红能与地衣多糖反应呈现红色,如果 B. subtilis SC2-4-1能产生 β-1,3-1,4-葡聚糖酶,则能分解其周
围的地衣多糖,出现透明水解圈,而背景被染成红色。刚果红染色、冲洗后菌周围均能出现透明水解圈,结
果见图 1,说明 B. subtilis SC2-4-1能分解地衣多糖,原因是产生了 β-1,3-1,4-葡聚糖酶。
2.2葡聚糖酶基因的克隆
2.2.1保守区域的克隆 以基因组 DNA为模板进行 PCR扩增,PCR产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测显示,
菌株 SC2-4-1在约 600bp处出现单一条带(结果未显示)。
2.2.2全长基因的克隆 以设计的兼并引物进行 PCR扩增,PCR产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测显示,最终
结果与预期的大小一致。PCR产物 1%琼脂糖凝胶电泳见图 2。
图 1 Bacillus subtilis SC2-4-1的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测 图 2 兼并引物扩增产物电泳图
2.3葡聚糖酶基因分析
2.3.1基因序列初步分析 将从 B. subtilis SC2-4-1中克隆到的保守区域序列在 http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST/上进行比对,与已报道的 P. polymyxa WY110的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分基因的相似性为
99%。与 gluB和 bglM比较,并用 DNAMAN软件分析序列的开放阅读框,发现所得基因不完整。以兼并引物
进行 PCR扩增,并将从菌株 SC2-4-1中克隆到的序列提交 GenBank,所得收录号为 EF488178。所得基因
gluB序列全长为 730bp,开放阅读框为 711bp,编码 237个氨基酸,以 ATG为起始密码子,TAA为终止密码
子。Blast分析,gluB与已报道的 P. polymyxa ATCC842的 gluB相似性为 85%,氨基酸序列相似性为 87%。
2.3.2菌株 SC2-4-1的基因的系统发育分析 根据 B. subtilis SC2-4-1gluB的序列,与 GenBank中的 β-
1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列进行比对,把相似性较高的序列用 ClustalX软件进行分析,用邻接法自展 1 000
次,TREECONW建树程序做成系统发育树。在系统发育树中,菌株 SC2-4-1与 P. polymyxa WY110聚在最近
的分支内,说明两者的葡聚糖酶基因亲源关系较近。从树状图(图 3)中可知,所得基因属于 β-1,3-1,4-葡
聚糖酶基因(图 3)。
2.3.3葡聚糖酶基因的比对分析 将从 B. subtilis SC2-4-1中克隆到的 gluB的氨基酸序列,与已知的芽孢
杆菌不同种的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的氨基酸序列在 DNAMAN软件中比对。所得葡聚糖酶氨基酸序列
具有高度保守的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性位点,在已知的具有 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性的 β-1,3-1,4-葡
聚糖酶基因的氨基酸序列的谷氨酸残基处均存在谷氨酸残基(图 4)。因此,所得葡聚糖酶基因序列具有催
朱辉等:枯草芽孢杆菌SC2-4-1葡聚糖酶基因gluB的克隆及序列分析 121
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化 裂 解 β-1,3-和 β-1,4-糖 苷 键 的 β-1,3-
1,4-葡聚糖酶活性位点。
3 讨论
β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表
明,拮抗菌 B.subtilisSC2-4-1能产生 β-1,3-
1,4-葡聚糖酶。以 B.subtilisSC2-4-1的基因
组 DNA为模板,从该菌中克隆到与已报道的
P.polymyxaATCC842的 β-1,3-1,4-葡聚糖
酶基因相似性为 85%的葡聚糖酶基因 gluB。
姚乌兰[8]等报道的 P.polymyxaWY110产
生的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抗稻瘟病菌活
性。用P.polymyxaWY110的抗真菌蛋白处理
病原菌菌丝 12h后,菌丝膨大畸形,透明度降
低,原生质体凝集,而对照菌丝仍光滑、均匀
和透明。本实验中拮抗菌对病原菌菌丝的作
用表现为细胞壁溶解,菌丝畸形、断裂,呈无
规则结构,而正常生长的病原菌菌丝细长,
表面光滑,可见清晰的分支结构,推测其产
生的拮抗物质可能为蛋白类或抗菌肽类物
质(结果另文发表)。从 B.subtilisSC2-4-1中
克隆到的 gluB与 P.polymyxaWY110的 β-
1,3-1,4-葡聚糖酶的部分基因具有 99%的相
似性。以 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的特异性底物地衣多糖检测葡聚糖酶活性,结果显示 B.subtilisSC2-4-1能利
用其周围的地衣多糖产生透明水解圈。通过对所得基因 gluB的系统发育分析和与已知的 β-1,3-1,4-葡聚
糖酶基因氨基酸序列的比对分析,说明所得基因 gluB属于 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因并具有 β-1,3-1,4-葡
聚糖酶活性位点。因此,推测拮抗菌 B.subtilisSC2-4-1产生的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶在其抗真菌活性中起作
用。
参考 文献
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12 RainerB,KnutB,PekkaM.MolGenGenet,1990,222:278~283.
图 3 几个细菌的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列的系统发育分析
基于 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列的系统发育树,自展 1000次,只显示
自展值大于 50%的数值,横线代表核酸的距离,括号内为该基因的收录号
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