全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
陆地棉子叶节高效再生体系的建立
胡根海　王清连　郭敏敏　张金宝　胡存科
(河南科技学院生命科技学院 , 新乡 453003)
　　摘 　要 : 　对 3个陆地棉材料子叶节进行离体培养 ,建立了高效的再生体系。其中 ,启动培养基为 M SB + 215 mg/L 62
BA + 215 mg/LKT,芽分化培养基为 M SB + 013 mg/L 62BA + 013 mg/LKT,通过器官发生途径诱导形成丛生芽 ,芽伸长培养
基 M SB。以上培养基均含葡萄糖糖 30 mg/L。此再生体系每个外植体可获得 2175个以上不定芽 ,嫁接移栽驯化后 ,成活率
接近 95%。
关键词 : 　陆地棉 　子叶节 　丛生芽 　植株再生
Establishment of Effective Regenerative System of
Colyledon Nodes in Upland Cotton
Hu Genhai　W ang Q inglian　Guo M inm in　Zhang J inbao　Hu Cunke
( School of L ife Science and Technology, Henan Institu te of Science and Technology, X inxiang 453003)
　　Abs trac t: 　 In this paper, cotyledon nodes acted as the exp lants in vitro of three Gossypium hirsu tum L1 varieties were cultured,
and multip le shoot were obtained by organogenesis method1 An effective regenerative system was established in which cotyledon nodes
were started in the start 2 up medium (MSB + 215 mg/L 62BA + 215 mg/LKT) , bud were differentiated in the differentiation medium
(MSB + 013 mg/L 62BA + 013 mg/LKT) and bud elongated in the bud elongation medium (MSB) 1 Results showed that 30 mg/L glu2
cose was served as carbon resource in all medium1 Cotyledonary nodes p roduced maximum number of shoots ( 2175 shoots/exp lant)
and buds can be grafted1 A s the grafted seedlings were transp lanted and domesticated, survival rate can reach nearly 95 % 1
Key wo rds: 　Up land cotten　Cotyledon nodes　Multip le shoot　Plant regeneration
收稿日期 : 2008212208
基金项目 :河南科技学院高层次人才专项 ( 6009)
作者简介 :胡根海 ( 19662) ,男 ,河北邢台人 ,博士 ,副教授 ,从事棉花优异功能基因克隆与转基因育种研究 ; E2mail: hgh1013@ sohu1com　　棉花是我国重要的经济作物之一 ,目前棉花育种的主要途径已从传统的常规育种转向了生物技术育种 ,其中最主要技术手段是转基因。当前棉花转基因主要通过农杆菌介导的体细胞胚再生途径 ,即主要通过愈伤组织诱导分化体细胞胚而再生植株 [ 1～10 ] ,这种方法不仅培养周期长 ,而且产生畸形苗的几率非常高 ,甚至可以达到 90以上 [ 11～13 ] ,并且只适用于“珂字棉”或少数过时品种 ,对当前生产主栽棉花品种无效 [ 14～16 ]。体细胞离体培养获得再生植株是获得转基因棉花的必要前提 ,因此 ,生产主推良种棉花的遗传转化和再生仍然是一个严峻的挑战 ,问题的瓶颈主要是棉花体细胞培养植株再生具有较强基因型依赖性、体细胞胚发生的效率较低和体细胞的变异频率高。 如何提高良种遗传转化和简化植株离体培养过程 ,而且避免或降低变异的发生是当前棉花转基因研究热点。目前已有资料显示美国和印度的研究人员已经开始着手茎尖、子叶节等器官进行棉花不受基因型限制的直接芽发生再生植株的研究 [ 17, 18 ] ,国内也仅有一篇针对新疆棉花的报道 [ 19 ]。本试验以黄淮棉区生产上正在推广棉花良种的子叶节为材料摸索一种不依赖基因型的、直接诱导多芽发生的植株再生的方法 ,期望为黄淮棉区生产上推广的优良品种转基因植株再生找到一条简化、行之有效的途径。1　材料与方法111　材料
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
以百棉 1号 ,百棉 2号和珂字 312作为供试材
料 ,由河南科技学院棉花育种与生物技术实验室
提供。
112　方法
11211 　无菌苗获得 　将棉花种子剥去壳后 ,用
011% HgC I灭菌 5 m in,再用灭菌纯水冲洗 4次 ,然
后取出接种于 20 m l 1 /2 MSB培养基中。
11212　子叶节外植体 　取 3～5 d苗龄的无菌苗在
距子叶 11 0～11 5 cm的下胚轴处切下 ,将 2片子叶
从中间分开 ,去除顶芽 ,切除子叶的大部分 ,仅仅保
留大约 1 cm2 ,以下胚轴的形态学下端竖直向下插
入培养基中。
11213　子叶节外植体芽诱导启动 　培养基中分别
添加不同浓度的 62BA和 KT。培养容器为玻璃三角
瓶 ,用封口膜封口。培养温度为 ( 28 ±1) ℃,光照强
度 2 500 lx,光照时间 16 h以上。试验重复 3次 ,每
次 6瓶 ,每瓶 4个外植体。当子叶节形成瘤状突起
时转入芽分化培养基 ,诱导芽的形成。当形成丛生
芽时 ,将丛生芽转接入伸长培养基 ,在培养期间观察
和记录各种培养基上外植体生长状况 ,子叶节产生
芽的外植体数及诱导芽的个数。诱导率 = 多芽再
生总外植体数 /总外植体数 ×100% ,丛生芽平均数
= 丛生芽总数 / 出芽外植体数。取 3 次重复试验
的平均值作为结果。
11214　诱导丛生芽的嫁接成活 　选用生产上推广
良种 ,小营养钵育苗 ,棉苗第一片真叶全展开时 ,用
刀截断第一片真叶以上的茎 ,从中间将茎劈开备用 ;
选长度为 1 cm左右的丛生芽 ,从基部切下 ,并把基
部削成 V形 ,将处理过丛生芽接穗接入砧木 ;包扎
后转入光照培养箱中培养 , 7 d后观察结果。
11215　再生植株的驯化 　从光照培养箱中 ,取出嫁
接成活的幼苗 , 28℃恒温培养室炼苗约 5 d后 ,大田
移栽 ,遮阴保湿 , 2周后统计成活率。
2　结果与分析
211　芽启动培养基的筛选
取培养 5 d百棉 1号无菌苗的子叶节 ,转接至
不同浓度和激素的芽启动培养基 , 24 d后将外植体
转接到芽分化培养基 , 14 d统计再生芽数 ,结果见
表 1。
表 1　启动培养基对出芽率的影响
培养基
(mg/L)
接种外
植体数
出芽外
植体数
出芽
数
丛生芽
平均数
诱导
率 ( % )
无激素对照 24 4 4 1 17
62BA (110) 24 12 24 2 50
KT(110) 24 13 30 2130 54
62BA (110) + KT(110) 24 12 26 2117 50
62BA (210) + KT(210) 24 24 50 2108 100
62BA (215) + KT(215) 24 24 66 2175 100
62BA (510) + KT(510) 24 20 45 2125 83
由表 1数据可以看出 ,单独使用 62BA或 KT均
能诱导棉花产生不定芽 ,但是诱导效果不及组合激
素使用效果好。在组合使用 62BA和 KT时 ,随着浓
度的增加 ,不定芽的启动诱导呈加强趋势 ,在 62BA
(215 mg/L ) + KT ( 215 mg/L )时启动诱导效果最
佳 ,过高的浓度激素对芽启动呈现抑制作用。
212　基因型对棉花子叶节丛生芽诱导的影响
取 5 d苗龄的 3个棉花品种的无菌苗 ,截取子
叶节 ,将子叶节的下胚轴一端竖直向下插入启动培
养基中 MSB + 62BA (215 mg/L) + KT (215 mg/L) ,
24 d后转接到芽分化培养基 MSB + 62BA (013 mg/
L) + KT (011 mg/L )中 , 14 d后再转接至芽伸长培
养基 MSB 中 , 20 d后观察统计大于 1 cm 的再生
芽数。
表 2　基因型对出芽率的影响
品种 接种外植体数
出芽外
植体数
出芽
数
丛生芽
平均数
诱导
率 ( % )
百棉 1号 26 26 50 1192 100
珂字 312 26 24 30 1125 92
百棉 6号 32 32 70 2119 100
从表 2中看出 , 3个品种的外植体出芽数除珂
字 312略低外 ,百棉 6号 ,百棉 1号均为全部出芽 ,
方差分析也表明 3个品种出芽率、诱导率没有显著
性差异 ,所以试验结果显示子叶节出芽率不存在基
因型差异。
213　启动时间对棉花子叶节丛生芽的影响
取 5 d苗龄的 3个棉花品种的无菌苗 ,截取子
叶节 ,将子叶节的下胚轴一端竖直向下插入启动培
养基中 MSB + 62BA (215 mg/L) + KT (215 mg/L) ,
7、14、20、24 d后转接到芽分化培养基 MSB + 62BA
011
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2009年第 6期 胡根海等 :陆地棉子叶节高效再生体系的建立
(013 mg/L) + KT ( 011 mg/L )中 , 14 d后再转接至
芽伸长培养基 MSB中 ,再于 20 d后观察统计大于 1
cm的再生芽数。
表 3　启动时间对出芽率的影响
启动天数 接种外植体数 出芽外植体数 出芽数 丛生芽平均数
7 34 18 20 1111
14 32 30 32 1107
20 26 26 90 3146
24 30 30 88 2193
从表 3看出 ,启动诱导时间过短、过长均不利于丛
生芽的形成。启动天数过少 ,激素可能并没有发挥应
有的作用 ;天数过多培养基褐化 ,产生一些有毒物质 ,
导致部分丛生芽黄花死亡。数据显示 20 d的启动诱导
比较合适 ,因为此时培养基刚刚开始褐化 ,丛生芽还没
有黄花死亡 ,而此时启动诱导已经达到最大量。
214　丛生芽的嫁接成活
棉花丛生芽生根比较困难 ,试验进行了嫁接移
栽观察 ,结果长度为 1 cm左右的丛生芽嫁接成活率
接近 95%。
3　讨论
311　子叶节外植体获取时间的探讨
子叶节的获取时间是转基因能否成功的关键 ,
目前棉花体细胞胚诱导的外植体下胚轴一般是取培
养 5 d左右的无菌苗 [ 20, 21 ] ,大豆是利用子叶节外植
体获得转基因最成功的例子 ,其子叶节取得时间一
般为 5～6 d[ 22, 23 ]。本试验借鉴大豆子叶节转基因
成功的经验 ,在无菌苗取得时间上 ,参考农杆菌介导
转基因的最佳时间 3～5 d ,对 5 d左右的无菌苗进
行了子叶节处理 ,结果显示 ,子叶节能正常长出不定
芽 ,说明截取 5 d棉花的子叶节是可以的。
312　激素水平对棉花子叶节出芽率的影响
Sookg和 M iller的激素平衡学说指出生长素和
细胞分裂素的浓度比值调控植株发育和形态建成 ,
当生长素与细胞分裂素的比值较高时 ,易于诱导根
的分化 ;反之 ,易诱导芽的分化。已有的研究证明细
胞在脱分化形成分生组织过程中需要较高水平内源
细胞分裂素和生长素的激发诱导 ,并且较高水平细
胞分裂素对维持分生组织的发育也是必需的。由表
1可以看出 ,不添加任何激素的对照只有很少量外
植体产生了不定芽 ,而且生长缓慢 ;在 62BA 和 KT
浓度都较低时 ,出芽率偏低 ,可能由于激素水平太
低 ,不足以刺激植物细胞分裂分化。随着激素浓度
的升高 ,芽诱导率升高 ,但是当激素浓度过高时 ,培
养基褐化严重 ,同时外植体出现黄化 ,出芽也很快黄
化 ,可见过高的激素会抑制出芽。单独使用 62BA
和 KT都能诱导出芽 ,但是效果不如组合使用高 ,同
时单独使用 KT还会出现子叶节下部愈伤化 ,不利
于以后的芽伸长和嫁接实验操作。试验结果认为 ,
215 mg/L 62BA + 215 mg/L KT具有较好的启动效
果 ,出芽率最高 ,也不会黄花死亡。
313　基因型对子叶节多芽启动的影响
启动诱导在不同陆地棉品种中存在差异较小。
试验所用 3个品种中珂字 312略低。虽然诱导多芽
存在品种的差异 ,但是不同品种都是可以诱导的 ,这
与体细胞胚胎诱导相比 ,难度要小的多。子叶节多
芽启动诱导可对不同陆地棉品种都是可用的 ,只是
诱导多芽数量有差别而已。
314　启动时间的探讨
启动诱导时间过短或过长均不利于多芽诱导。
当启动诱导时间过短 ,可能由于激素含量过低 ,造成
多芽启动困难 ,不出芽或仅有个别出芽 ;启动时间过
长 ,可能是由于高浓度激素长时间的作用于子叶节
仅诱导了芽的分化 ,但抑制芽的伸长 ;另外 ,过多的
芽点也会引起芽与芽之间彼此相互抑制最终诱导芽
黄花死亡。可见合适诱导启动时间是 20 d。
315　芽伸长与嫁接
在试验中芽伸长是必要的 ,因为芽过小 ,试验操
作不方便 ,而且容易造成嫁接失败 ; 110 cm以上芽
操作方便。按照王清连等 [ 25 ]的方法嫁接简便易行 ,
比生根后炼苗、移苗移栽成活省时经济。
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