全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
全耐药鲍曼不动杆菌分子分型和分子流行病学调查
欧阳萍 1 黄晶 2 雷连成 1 尹立子 1 林花 2 吕爽 1 韩文瑜 1
(1吉林大学畜牧兽医学院 ,长春 130062; 2吉林大学第一医院检验科 ,长春 130021)
　　摘 　要 : 　重复片段引物 PCR和随机扩增多态性 DNA (RAPD)技术对临床分离全耐药不动杆菌分子分型 ,并进行流行病
学调查。从 ICU病房感染多重耐药不动杆菌患者的标本分离不动杆菌 ,碱裂解法提取全基因组 ,重复片段引物 PCR (Rep2
PCR)和随机引物扩增 (RAPD) ,对 8株临床分离的全耐药菌基因分型 ,并与生物学分型和质粒分型比较 ,调查医院流行全耐
药菌的基因型。结果显示 , 8株分离菌经两对重复片段引物分型可分为 6种和 4种基因型 ,经随机引物分型为 4种和 3种基因
型 ,经质粒分型可分为 2种基因型 ,生物学分型归属为 1种表型。PCR方法用于全耐药不动杆菌分子分型简便易行 ,重复性
好 ,适合医院感染流行病学调查 ,本医院同一部门出现多种基因型 ,各科室间不存在交叉传染。
关键词 : 　不动杆菌 聚合酶链反应 基因分型 流行病学调查
Typing of M ulti2drug Resistant Acinetobacter baum ann ii by PCR and
Epidem iology Investigation
Ouyang Ping1 　Huang J ing2 　Lei L iancheng1 Yin L izi1 　L in Hua2 　Lv Shuang1 　Han W enyu1
(1 College of Anim al Science and Veterinary M edicine, J ilin University, Changchun 130062;
2 Test Deperm ent of the First Hospita l, J ilin University, Changchun 130021)
　　Abs trac t: 　 It was to type multi2drug resistant bacteria A cinetobacter baum annii by Rep2PCR and RAPD2PCR then app ly the results
in the clinical strain identification and ep idem iological study. Multi2drug resistant A cinetobacter baum annii was isolated from ICU ward
and was determ ined by V ITEK2 automatic m icrobial analyzer. The entire genome of A cinetobacter baum annii was extracted by alkaline
lysis method and was amp lificated by Rep2PCR and RAPD. DNA p roducts clinically isolated from 8 strains of A cinetobacter baum annii
was typed and compared with the antibiotic suscep tibility spectrum s and the results of conventional biotyp ing. W ith aid of Rep2PCR, the
8 strains of the bacterium were grouped into 6 and 4 and 3 types with 2 coup les of repetitive p ieces p rimer in the Pep PCR, 4 and 3
types in RAPD, 2 types in p lasm id typ ing and one phenotype in biotyp ing. There was no cross2infection to exist in the hosp ital, that was
p roved by the multip le genotypes in a single department.
Key wo rds: 　A cinetobacter baum annii　Polymerase chain reaction　Ep iodem iology molecular　Ep idem iology investigation
收稿日期 : 2009205212
作者简介 :欧阳萍 (19842) ,女 ,汉族 ,湖南永州 ,硕士研究生 ,主要从事微生物及免疫学方面的研究 ; E2mail: ouyangp ing125@163. com
通讯作者 :雷连成 (19682) ,男 ,教授 ,硕士生导师 ,研究方向 :分子细菌学及免疫学 ; E2mail: leiliancheng@163. com　　不动杆菌 ( acinetobacter)广泛存在于自然界、医院环境及人体皮肤 ,常在住院病人尤其在老年人和重症监护室引起医院获得性肺炎 ,是重要的医院感染病原菌之一 [ 1 ]。近年来 ,因抗生素的大量应用 ,其耐药性不断增加 ,院内感染率亦不断上升 ,有关鲍曼不动杆菌的多重耐药问题的研究已经有不少报道 [ 2～4 ] ,由于这些菌株大多呈多重耐药 ,给临床治疗带来很大困难 ,也是防止院内感染最为关注的病原菌。因此 ,对 其进行分子流行病学分析具有重要意义。本研究采用重复片段引物 PCR (Rep2PCR)方法和随机扩增多态性 DNA (RAPD)技术 ,将某医院 ICU病房分离的菌株用 PCR方法进行基因分型 ,并与生物分型和质粒分型进行比较 ,了解院内该菌的流行情况。1 材料与方法111 菌株及来源吉林省第一医院 8例 ICU感染多重耐药鲍曼不
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
动杆菌患者的标本分离 ,男 5例 ,女 3例 ,年龄 24～
94岁 ,平均 64岁 ,痰 7株 ,伤口分泌物一株。
112 试剂和仪器
PCR反应试剂、DNA Marker购自大连 TaKaRa
公司 ;药敏纸片为英国 Oxoid公司产品 ;质粒和基因
组提取试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司 ;
V ITEK2全自动微生物分析仪购自法国梅里埃公
司 ;低温高速离心机、PCR扩增仪等。
113 引物设计
根据参考文献 [ 5 ] 设计特异性引物 , 由大连
TaKaRa生物公司合成 ,引物序列及长度见表 1。
表 1　引物序列及其长度
引物名称 引物序列 (5′→3′) 序列长度 ( bp)
ER IC2 AAGTAAGTGACTGGGGTGAGGG 22
RAPD1 AAGAGCCCGT 10
RAPD2 CGGCAGCGCC 10
Rep21 IIIICGICGICATC IGGC 18
Rep22 ICGICTTATC IGGCCTAC 18
114 菌株鉴定和药敏试验
分离菌株使用 V ITEK2全自动微生物分析仪进
行鉴定 ,标准菌株为大肠埃希菌 ATCC25922和铜绿
假单胞菌 ATCC27853。琼脂扩散法测定菌株对阿
莫西林待 16种抗生素的敏感性 ,根据美国临床实验
室标准化委员会 (National Comm ittee for Clinical La2
boratory Standards, NCCLS)要求判断药物敏感性。
115　生物学分型
参照 Bouvet和 Grimont[ 5 ]提供的方法进行生物
学分型。其分型依据是鲍曼不动杆菌对乙酰丙酸、
柠檬酸、L2苯丙氨酸、L2酒石酸、42对羟苯甲酸 5种
碳水化合物同化作用结果 ,可将鲍曼不动杆菌分为
19种生物型。
116　质粒 DNA的抽提
质粒 DNA的提取采用经典的 SDS碱裂解法 [ 6 ]。
具体方法 : 3 m l过夜培养的 LB菌液 , 12 000 r/m in,
4℃离心 2 m in;将菌重悬于 100μl的碱裂解液 Ⅰ
中 ,剧烈振荡 ;加入 200μl新配裂解液 Ⅱ中 ,轻轻颠
倒混匀 6～8次 ,冰浴 5 m in;加入 150μl预冷的裂解
液Ⅲ颠倒混匀 ,冰浴作用 10 m in; 4℃, 12 000 r/m in,离
心 10 m in,上清液移入另一管中 ,加等体积的酚 ∶氯
仿 ∶异戊醇 ( 25∶24∶1) ,反复抽提 2次 ;加 2倍体积
的冷乙醇 , - 20°放置 2 h,离心弃去上清 , 70%乙醇
洗两遍 ,室温放置挥干乙醇后 ,向沉淀加入 30μl TE
缓冲液溶解 ,温和振荡 , - 20°保存备用。
117　基因组 DNA制备
取 3 m l过夜培养的菌液 ,离心后反复冻融 ,加
10 % SDS 30μl,蛋白酶 K25μl ,溶菌酶 30μl, 65℃
水浴至菌液澄清 ,加等体积的酚 ∶氯仿 ∶异戊醇 ( 25∶
24∶1) ,反复抽提 DNA ,向沉淀加入 50μl超纯水溶
解 , - 20℃保存备用。
118　PCR反应体系及条件
11811　ER IC2引物 PCR程序 反应体系总体积 25μl,
10 ×Taq酶缓冲液 215μl,引物 2μl (10 pmol/μl) ,模
板 DNA 2μl, dNTPs 200μmol/L , Taq酶 0125 U ,加
水至 25μl。扩增条件 : 94℃预变性 5 m in, 94℃变性
1 m in, 40℃退火 1 m in, 72℃延伸 2 m in,进行 35个
循环 , 72℃延伸 8 m in结束反应。
11812　RAPD引物 PCR程序 　反应体系同上 ;扩
增条件 : 94℃预变性 5 m in然后变性 1 m in, 25℃
退火 1 m in, 72℃延伸 2 m in, 进行 35 个循环 ,
72℃延伸 5 m in后反应结束。引物 2 PCR程序除
退火温度为 30℃外 ,其余条件均与引物 1 PCR程
序相同。
11813　Rep引物 PCR程序 　反应体系同上 ;扩增
条件 : 95℃预变性 3 m in, 90℃变性 30 s, 45℃退火
1 m in, 65℃延伸 8 m in,进行 30个循环 , 65℃延伸
10 m in后反应结束。
119　PCR产物检测
取扩增产物 10μl,于 15 g /L 琼脂糖凝胶电
泳 ,恒压 100 V , 30 m in 后用凝胶成像仪观察
结果。
2　结果
211　生物学分型及抗生素敏感性
8株鲍曼不动杆菌进行 18种抗菌药物敏感性
试验 ,结果显示 8株鲍曼不动杆菌对 C IP等 16种常
规非发酵抗菌药物均耐药 ,对多粘菌素 B耐药 ,及
盐酸米诺环素均敏感。根据其生物学特性只能分为
一种型 ,结果见表 2。
261
2009年第 10期 欧阳萍等 :全耐药鲍曼不动杆菌分子分型和分子流行病学调查
表 2 8株鲍曼不动杆菌分型及抗生素敏感性
抗生素名称
菌株
1 2 3 4 5 6 7 8
SAM R R R R R R R R
PRL R R R R R R R R
CAZ R R R R R R R R
CTX R R R R R R R R
FEP R R R R R R R R
TIM R R R R R R R R
TZP R R R R R R R R
CRO R R R R R R R R
AK R R R R R R R R
CN R R R R R R R R
IPM R R R R R R R R
MEM R R R R R R R R
LEV R R R R R R R R
C IP R R R R R R R R
SXT R R R R R R R R
MH S S S S S S S S
PB R R R R R R R R
Botyp ing Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
212　质粒分型结果
8株鲍曼不动杆菌都检测到质粒 ,检出率为
100% ,本次共检测到两种质粒 ,根据质粒条带位置及
数目不同 ,不动杆菌分为 2个基因型 ,结果见图 1。
图 1　8株不动杆菌质粒电泳图
213　PCR分型结果
鲍曼不动杆菌 PCR结果 ER IC 2引物将耐药菌
分为 6个基因型 ,见图 2。RAPD1将不动杆菌分为
4个基因型 ,见图 3。RAPD2将不动杆菌分为 3个
基因型 ,见图 4。Rep l和 Rep2将菌分为 4个基因
型 ,见图 5。质粒分型相同 , PCR分型结果不一样 ,
不同 PCR引物间分型结果基本一致 ,见表 3。
361
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
表 3　不动杆菌质粒和 PCR分型结果
菌号 质粒分型 ER IC2分型 Rep1和 Rep2分型 RAPD1 PCR分型 RAPD2 PCR分型
1 R2950 Ⅱ型 E型 b型 (2)型 ③型
2 W3415 Ⅰ型 D型 d型 (2)型 ①型
3 R2939 Ⅰ型 C型 b型 (4)型 ②型
4 R2924 Ⅰ型 A型 c型 (4)型 ②型
5 A3接口 Ⅰ型 A型 c型 (2)型 ①型
6 R2946 Ⅰ型 B型 a型 (1)型 ①型
7 R2970 Ⅰ型 E型 d型 (4)型 ②型
8 3出口 Ⅱ型 F型 b型 (3)型 ②型
3 讨论
鲍曼不动杆菌是一种常见的条件致病菌 ,可为
人体所携带 ,广泛存在于环境和物体表面 ,近年来其
耐药现象越来越严重 ,特别是对β2内酰胺类抗生素
耐药率己达 60%以上 [ 7～9 ]。不动杆菌的耐药性给
治疗带来很大程度的困难 ,不能确定其基因型 ,往往
也给治疗带来严重的困扰。
不动杆菌常用的分型方法较多 ,如药敏表型、
生物学分型、基因分型技术等。大量研究表明基
因差异分型优于其他方法 ,主要包括脉冲场凝胶电
泳 ( PFGE)、限制性片段长度多态性分析 ( RFLP)、
随机扩增多态 DNA ( RAPD )、核糖体分型 ( R ibotyp2
ing)等。PFGE分辨力高 ,是目前细菌基因分型的标
准 ,但此设备价格昂贵 ,一般的实验室不能配备 ,且
此方法费时费力 ,不易推广 [ 10 ]。RAPD一般都采用
经过选择的短引物 ,在低退火温度下与模板进行随
机扩增。Rep2PCR是通过 PCR扩增细菌基因重复
DNA片段来获得菌株特异性图谱的方法 ,肠杆菌科
基因间重复序列 ( ER IC)是常用的一类引物 ,位于染
色体上非编码转录区 ,包含一段高度保守的中央倒
置重复区和位于细菌基因外区域 ,由于不同细菌
ER IC在基因中的位置不同 ,所以分型效果好 ,其分
辩力较随机引物 PCR、核糖体分型等强 ,与 PFGE具
有高度相关性。
本研究应用 PCR方法对 8株鲍曼不动杆菌进
行基因分型 ,同时与生物学分型和质粒分型比较。
研究结果表明 3种分型方法均可对 8株鲍曼不动杆
菌分型 ,分型率可达 100%。重复序列 PCR将 8株
不动杆菌分成 6个和 4个基因型 ,分型率为 6215%
和 50% ,用 RA PD 方法分为 4 个型 , 分型率为
50 % ,质粒分为 2个型 ,分型率为 25 % ,而生物学
分型只有 1种类型 ,分型率为 1215 %。基因型相
同 ,生物学分型相同 ,而生物学分型相同 ,基因型
却不同。 PCR分型率高于生物学分型和质粒分
型。本试验结果均进行 3次以上重复试验 ,重复
性为 100 %。结果表明 , PCR方法用于基因分型
较为简便 ,重复性较好 ,无需特殊仪器和试剂 ,是
医院感染分子流行病学中较理想的分析方法。
本研究发现在调查期内存在鲍曼不动杆菌爆发 ,
重症监护病房不同患者检验出多种不同基因型
的耐药菌 ,说明在该菌本医院内不存在着交叉
传染。
参 考 文 献
1　 D’Agata E, Venkataraman L, Degirolam i P, et al. Clin M icrobiol,
1997, 35 (10) : 2602.
2　 Yang CH, Lee S, Su PW , Yang CS. Chuang LYG. M icrob D rug Re2
sist. 2008, 14 (4) : 281～8.
3　 Patwardhan RB, Dhakephalkar PK, N iphadkar KB, Chopade BA.
Med Res, 2008, 128 (2) : 178～87.
4　 Joshi SG, L itake GM, N iphadkar KB, Ghole VS. Infect Chemother,
2003, 9 (2) : 187～90.
5　 Bouvet PJ, Grimont PA. Ann Inst Pasteur M icrobiol, 1987, 138 (5) :
569～578. (下转第 168页 )
461
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
1. ITGA1; 2. ITGA2; 3. ITGA3; 4. ITGA4; 5. ITGA5;
6. ITGA6; 7. ITGB1; 8. ITGB2; 9. ITGB3; 10. ITGB4; 11. ITGB5
图 5 不同 m RNA相对于 GAPD H的表达水平
因 ITGA2、ITGA3、ITGA6和 ITGB 5的表达。整合素
是由α、β两条链经非共价键连接组成的异源双体
( heterodimer) ,α、β链均为 I型膜蛋白。整合素是
介导细胞与细胞外基质相结合的主要膜蛋白 ,能够
介导细胞的黏附和迁移 ,在组织损伤修复、个体发育
以及肿瘤的发生和转移过程中起重要作用。敲除
Rent1的小鼠死于胚胎早期 [ 7 ] ,整合素参与胚胎发
育 , Rent1缺失的小鼠死于胚胎早期是否与整合素
的高表达有关 ,值得进一步研究。
Rent1是通过引导含有 PTC的 mRNA至 P2body
从而引发 mRNA 降解 [ 3 ] ,含有 PTC 的 mRNA 在
NMD缺失的细胞中稳定性增加 [ 8 ]。整合素在 Rent1
缺失的细胞中高表达是否因为这些整合素基因含有
PTC,答案可能是否定的 ,因为同时在多个整合素中
出现 PTC的可能性非常小。Perlick等 [ 6 ]报道 , Upf1
(Rent1的同源基因 )能够调节约 8%的酵母基因的
表达。Upf1主要不是通过调节这些 mRNA的稳定
性所致 ,而是通过调节转录因子的表达 ,后者再调节
其他 mRNA的转录。因此 ,本试验观察到的整合素
基因表达上调很可能是因为这些基因的转录增
加所致。
用两种不同的细胞粘附试验方法得出了不同的
结果 :用胰酶消化细胞 ,干扰 Rent1的表达 ,并不显
著增加 HeLa细胞对表衬有纤维粘连蛋白 ( FN)的塑
料培养板的黏附力 ;用 EDTA消化细胞 ,干扰 Rent1
的表达 ,能够显著增加 HeLa细胞对表衬有纤维粘
连蛋白 ( FN )的塑料培养板的黏附力。EDTA 是一
种螯合剂 ,因为细胞表面很多和培养皿结合的蛋白
都是带有 Ca2 +或者 Mg2 +的蛋白 ,而 EDTA就是螯合
Ca2 +或者 Mg2 +的 ,从而加速细胞和培养皿的脱离。
而胰酶是一种蛋白酶 ,在特定的位置降解蛋白 ,可以
将细胞膜上和培养皿壁结合的细胞粘附蛋白降解 ,
从而使细胞和培养皿壁脱离。本试验中 ,即使抑制
Rent1表达后整合素表达有所增加 ,用胰酶消化可
能破坏细胞表面的整合素蛋白 ,因此 , HeLa细胞的
粘附能力增加并不明显。由此认为 ,胰酶消化程度
的深浅难控制 ,对细胞粘附试验的影响较大 ,做细胞
粘附试验 ,最好避免用胰酶消化细胞。
参 考 文 献
1　 Isken O,Maquat LE. Genes Dev, 2007, 21 (15) : 1833～56.
2　 KhajaviM, Inoue K, Lup ski JR. Eur J Hum Genet, 2006, 14 ( 10) :
1074～81.
3　 B rogna S, Ramanathan P, W en J. B iochem Soc Trans, 2008, 36 ( Pt
4) : 698～700.
4 　 Kaygun H, Marzluff W F. Nat Struct Mol B iol, 2005, 12 ( 9 ) :
794～800.
5　 Azzalin CM, L ingner J. Cell Cycle, 2006, 5 (14) : 1496～8.
6　 Perlick HA,Medghalchi SM, Spencer FA, et al. Proc Natl Acad Sci
USA, 1996, 93: 10928～10932.
7　 Medghalchi SM, Frischmeyer PA, Mendell JT. Hum Mol Genet,
2001, 10 (2) : 99～105.
8　 Maderazo AB, Belk JP, He F, Jacobson A. Mol Cell B iol, 2003, 23
(3) : 842～51.
(上接第 164页 )
6　 Sambrook J, Russell D W , Huang PT. et al,M loning Cloning. A La2
boratory Manual ( 3 rd ed ) . Beijing: Science Press, 2002 ( in Chi2
nese) .
7　 M’Zali FH, Chanawong A, Kerr KG, et al. Antim icrob Chemother,
2000, 45 (6) : 881～885.
8　 Sm ith CA, Baker EN. Curr D rug largets Infeet D isord, 2002, 2 ( 2 ) :
143～160.
9　 Hawkey PM. Antim icrob Chemother, 2003, 51 ( Supp l 1) : 29～35.
10　Su LH,Leu HS, Chiu YP, et al. Hosp Infect, 2000, 46 (9) : 110～117.
861