全 文 ：生物杖术通报
· 技术与方法 · 刀了口万付 口乙 年增刊
而 的实验和生物信息学开发方法
王晶‘ 朱荣胜‘ 宋万冲, , 张闻博‘ 刘春燕‘, 胡国华, 陈庆山 ‘
’ 东北农业大学农学院 , 哈尔滨 巧 仇 黑龙江省农垦科研育种中心 , 哈尔滨
, 国家大豆工程技术研究中心 , 哈尔滨 东北农业大学理学院 , 哈尔滨
摘 要 而 ! ∀# 是一类约 的内源小分子 , 普遍存在于真核生物体 内 , 它通过与靶基 因互补结
合来调控基因表达 , 从而时生物体的生长、发育等起到重要的调节作用 。 随着生物学技术的不 断发展 ,
研究的越发深入 , 越来越多的 !∀ 被开发 出来。 本文结合了 !∀ 的生理特点 , 从 、 和生物信
息学预测这 个方面归纳总结有关开发 的方法 , 以及由此衍生出来的相关的研究方法 。 通过对这些研
究方法的分类总结 , 不但为 以后的研究工作莫定良好的基础 , 而且有利于新技术的研发 。
关键词 ! ∀ 作用机制 开发 同源性 靶基因预测
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m irc ro RN A 是一类非编码的内源单链小 R N A
分子 , 最早的报道的是在 1993 年由 Le e川等利用遗
传分析的方法在线虫中发现的一个 22nt 可以控制
细胞发育时序的小分子 R N A :lin 4 。 20 0 年 R ei n-
ha rt[ ’〕又发现了另一个具有转录后调节作用 m ic ro R -
N A :le t一7 , 从此便掀起人们了研究 m ic ro R N A 的热
潮 。 成熟的 m ic ro R N A 是由具有茎环结构的前体转
录本(pri 一m ic ro R N A ) 经过一系列剪切形成的 , 通过
碱基配对的方式结合到靶 m R N A (ta rg et m R N A )的
3 ’末端非翻译区 (3 ’一 u n t r a n s l at i o n a l re g i o n , 3 ’ U T R ) ,
从而调控基因表达 , 调控生命活动 。 目前 , m ic ro R -
N A 主要是从 DN A 角度的正向克隆 、 R N A 角度反向
基金项目:黑龙江省“ 十一五 ”科技攻关项目( G A0 6 B1 01 一石 ); 国家高技术研究发展计划(863 计划)项 目(2〕拓从10 104 一3 ) ; 黑龙江省博
士后资助项 目(L R B06 一 12 6)
作者简介 :王晶( 19 85 一 ) , 女 , 东北农业大学农学院生物技术专业在读本科生 , 研究方向为植物生物技术
通迅作者 :陈庆山 , E 一 m a i l : q s h e h e n @ s o h u . e o m ; 胡国华 , E 一m a i l : H u gh 7 5 7 @ vi p . 1 6 3 . e o m
生物技术通推 B io te chn ole gy 200 8 年增刊
克隆和生物信息学的方法识别和鉴定 , 但由于 m i-
er oR N A 片段小且瞬时表达等因素使得m ic ro R N A 的
发掘效率并不是很高 , 并且基于运算的预测也有待
进一步验证 , 所以通过实验和生物信息学结合的方
法使得 而rc ro R NA 的开发研究大大提高了效率。
1 mi rc ro R N A 形成过程及作用机制
1.1 m irc ro RNA 形成过程
通过实验人员对 m ic ro R N A 研究发现 m ic ro R NA
是一类内源的非编码 RN A , 没有开放读码框和蛋白
质编码基因的特点 。 70 % 一 90 % 位于蛋白基因的基
因间隔区 , 部分位于内含子区 , 还有个别在编码区互
补链上 , 以单拷贝 、多拷贝 、基因簇等形式存在 ,并且
在生物进化过程中有很高的保守性 , 且具有发育阶
段性和组织特异性 〔’一’〕, 对生物的生长发育过程具
有很重要的调控内源基因表达的作用 。
成熟的 m iero R N A 是长度在 22nt(21一3 nt 的超
过 80 % )的单链[6], 在植物和动物体内m ic ro R NA 的
形成 过程 大体相 同 。 m ic ro R N A 基 因可能是 由
R NA se l 催化形成具有茎环的结构 mic ro R NA 前体
转录物(p五一 m i R N A ) 占’J 。 在植物中 p件m iR N A 在经
过 D eLI[’一 ‘o ] 的两次切割后形成 m iR NA :m in NA *
双链并在 H A STY (H ST) 和 R A N -G Tp 条件作用下出
核 。 出核后的双链再在解旋酶作用下解旋成两条单
链 , 一条选择性的结合到了 R N A 诱导沉默复合体
(R ISC 也称作 m iR NP )中称为成熟的 m irc ro R N A 参
与以后的作用 , 而另一条链被迅速的降解掉 。 而在
动物中 pri 一而R N A 首先由D ro sh a「11] 作用在远离茎
环端的双链位置切割形成 pre 一mi R N A[ ” , ” ] , 出核后
又在 Di ce r酶作用下从切割成 而RN A :m iR N A * , 以
后的形成过程均与植物相同。
1
.
2 m ic ro R N A 作用机制
由于 m ic ro R N A 与靶基因互补程度的不同 , 可
以将 m ier oR N A 的作用机制大体分为两种 :m ic ro R -
N A 切 割靶 m R N A 和 m ic ro R N A 抑制 转 录后 翻
译[‘4 一 ’‘〕。 通常植物中 m ic ro R NA 和编码蛋白的 m R -
N A 完全或接近完全互补 , 此时与 m ic ro R N A 相关的
核昔酸及其诱导的沉默复合体(R NA 一 ind uc ed si -
le n e in g e o m p le x , m i R I S C
) 联合作用 , 通过 R N A 干扰
途径降解靶 m RN A 。 在大多数动物体内 , m ic ro R N A
则与靶 m ic ro R N A 的 3 ‘ 端非翻译区 (3 ’ U T R ) 不完
全互补 , 而是通过 RI SC 或 RN A 干扰途径明显抑制
转录后翻译水平的基因表达和蛋 白表达 , 而不影响
m R NA 本身。 此外 , 还有一种作用机制是通过转录
后调节的方式激活染色体 ,使组蛋白甲基化 , 从而沉
默染色体 , 这种情况通常在酵母 、植物中发现 , 在动
物中也可能存在但还有待进一步研究 。
目前主要通过信息学的预测方法 、原位杂交、过
量表达 、基因沉默等技术对 m ic ro R N A 功能展开研
究 , 发现 m ic ro R N A 作用遍及生命体的发生 、生长 、
发育、分化 、信号转导 、疾病和死亡等生命过程中的
一系列重要进的过程 。 并且由于 m ier oR N A 序列 、
结构 、丰度和表达方式的多样性 , 使其可能作为 m R -
N A 编码蛋白质的调节因子 , 对基因表达 、细胞周期
调控乃至个体发育产生重要影响 。
2 m i e r o R N A 开发方法
从 20 3 年第一个 m ic ro R N A 被发现 , 短短几年
来 mic ro R NA 开发正 以惊人的速度增长 , 目前可 以
提供 mic ro RN A 的数据库主要有以下 3 个:Th e mi R -
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。 根据The m iR N A R egist叮 在2008
年 4 月报道 m ieroR N A 总数已达到6 396 个 (图 l) 。
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图 1 m ic ro R NA 总l 变化趋势
对 m ic ro R N A 开发主要是基于实验和生物信息
学两种方法 , 两者各有优势 , 互为补充 。 生物信息学
为 m ic ro RN A 研究提供了有益的线索 , 可 以指导实
验的进行 ,但仍需通过实验方法加以确认 , 而实验生
年增刊 王晶等:m ic ro R N A 的实验和生物信息学开发方法 127
物学虽然在研究对象的选择上受到约束 , 不能很快
对大量候选者进行逐个验证 , 却能提供直接而有力
的证据 。 通过两种方法的完美结合为 m ic ro R N A 的
研究提供更为广阔的天地 。
2
.
1 R N A 开发途径
从 R N A 角度开发的实验方法主要是根据 Bart el
Lab pro toeol中 m iero R N A 的 eDN A 文库克隆法 , 构
建富集的 cD NA 文库 。 首先从细胞组织中提取总
R NA 并进行分离回收 18 一 2 5 ni 的 R N A 分子 , 并用
T4 连接酶将人工合成的 5 ’ 和 3 ‘ 接头连接到 R N A
上后 , 用 PCR 进行反转录扩增这些序列构建成 m i-cro RN A 的 cD N A 文库 , 并且根据 m ic ro R N A 的保守
性设计特异引物对其进行克隆、测序并将克隆序列
用 N CBI 中的 Bl as in 软件在该物种基因组数据库中
进行同源性搜索在基因组中进行定位 , 将具有同源
性的基因组序列用 M fo ld 程序进行二级结构预测分
析是否为具有茎环结构的前体以及该茎环结构在其
他物种中的保守性〔” ] , 最后将具有发夹结构的小分
子 R N A 进行 N ortha m 杂交以检测其表达情况 , 最终
将符合 mic ro RN A 标准的小分子 R N A 鉴定为新的m ic ro R N A 。 B a rte l 等采用这种方法在拟南芥[’8 〕和
线虫[” 〕中分别发现 16 和 5 个 m ic ro RN A 基因 。
Th
o m a , 等【‘, 20 ] 则分别在果蝇 、人类和小鼠细胞中得
到 16 、 2 1 和 31个新的 m iero R NA 。
另一种是 R NA 加尾和引物延伸 RT 一 P C R 克隆
法 , 它与前一种类似只是在 cD NA 文库构建过程中
有所不同 。 通过提取部分组织或器官的总 R N A , 并
进行纯化后加 Pl oy (A )尾 , 回收进行反转录成 cD N A
然后直接根据 m ic ro R N A 保守性设计引物对其进行
克隆 、测序 、分析等 , 后续过程与 cD NA 文库克隆法
相同 。 谢胜松等【川通过克隆猪中的 le t7 b 和 le t7 对
这两种方法进行比较研究发现 :构建 cD NA 文库方
法可以获得多个小分子克隆 , 但实验操作复杂且费
用高 , 而 R N A 加尾和引物延伸 RT 一P C R 克隆法可以
对单个 m ic m R NA 进行克隆 , 检测低丰度的 m ic ro R -
NA , 并且能特异区分 3 ’末端碱基不同的亚型 , 但对
序列中间个别碱基不同的亚型不能鉴别 。
2
.
2 D N A 开发途径
从 DN A 角度发掘 m ic ro R NA 的研究主要通过
其保守序列进行同源克隆得到的 。 首先通过 G e-
no m e w al ke ;构建文库 , 然后根据 m ic ro R NA 保守序
列设计引物在文库中进行同源克隆 、测序并将克隆
序列进行二级结构分析寻找到可 以形成茎环结构的
序列 , 并进行同源序列比对进行基因组内定位 , 发掘
靶基因 。 最后 , 在 。D N A 文库中进行二次克隆对发
掘的 m ic ro R N A 进行验证 。 目前从 DN A 角度来直
接克隆的报道的其他方法还很少有报道 。
由于 m ic ro RN A 的组织阶段特异性表达而且表
达风度低 ,序列成份和转录后修饰仁” 一川 , 还受到一
些内源性小 R NA 、 m R N A 、和其他非编码 R NA 降解
产物的干扰厄’。, 25] 等等原因 , 所以通过建立文库的方
法对于寻找 m ic ro RN A 具有一定的局限性 。
N o rt he m 是证明从大小分级的 cD N A 文库中克
隆得到的 m ic ro RN A 的表达情况的常用方法 , 它可
以提供预测 m ic ro R NA 的大小和表达情况 , 但它的
低通量和检测低丰度的 m ic ro R N A 时的灵敏度偏
低;原位杂交也可用于 m ic ro R N A 检测 , 并可测定候
选 m ic ro R N A 的时空特异性表达 , 但是它不能测定
R N A 的大小和末端 , 因此具有有限的利用价值。 实
时荧光定量 PCR (RT 一P C R ) , 可以高精度定量与高
灵敏度检测 m ic ro R N A 前体和成熟 m ic ro RN A 表达 。
基因芯片(m ic ro ar ay)也可用于检测 m ic ro R N A 的表
达 。 su 。 等〔’‘〕用芯片检测了人 、大鼠和小鼠中全部
mic ro R N A 的表达水平 , 发现 5 个 m ic ro R N A 在人的
肾脏中特异表达 。 此外 , 锁定的核昔酸原位杂交
(LNA 一 I S H ) 、基 于细珠的流式细胞术 (bead 一b a s e d
flo
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o m et ry ) 以及 m ic ro R N A 的体外抑制和过表达
技术不同的杂交方法都可用于证明预测的 m ier oR -
NA 的表达 。
2
.
3 生物信息学开发途径
目前 , 通过信息学的方法已经开发出了的许多
生物信息学软件 , 专门用来预测生物体中可能存在
的 m ic ro RN A 基因。 对于全基因组测序完成的物种
主要采用同源性搜索的方法进行基因挖掘 , 而对于
缺乏全基因组草图的物种的 m ic ro R NA 计算开发则
是在已知 m ic ro R NA 基因附近搜索基因簇 。 根据杨
良怀等[川 的研究报告中提到对于 m ic ro R N A 的信息
学开发可以归纳为以下 3 种策略
第 1种是利用同源性搜索已知 m ier 0R N A 基因
的直系同源 (。rt h o l o g ) 和旁系同源 (para log ) [28一”〕。
生物杖术通报 B to tec hn oto盯 2008 年增刊
该策略是基于一些 m ic ro R NA 在很长的演化过程中
具有保守性 , 如折叠的 自由能 、理想茎部的最长长
度 、对称环结构的平均大小以及茎部不同核昔酸的
组成比例等等。 成熟 mic ro R N A 以及 m ic ro RN A 前
体所形成的发夹结构上的序列的保守性有助于进行
基因组规模 miero RN A 搜索 , 如肠i〔33」等使用 m iR -
se ek er 软件 , 在果蝇中预测出 48 个候选 m icr oR N A
基因 , 其中 24 个已被实验确证 , 但由于 m ic ro R N A
前体长度的可变性 , 故这种方法在寻找新基因具有
一定的遗漏性 。
第 2 种是在 已知 m ic ro RN A 附近搜索基 因
簇l’‘〕。 s e i t z 仁”〕等在已知 m iero R N A 基因附近 以已
知 m ic ro R N A 序列为阳性对照 , 以与 m ic ro R N A 无关
的非编码 R NA 序列为阴性对照 , 对待测基因进行筛
查搜索发现 m ic ro R NA 基因似乎以一定组织成簇排
列 , 类似于操纵子族中基因的表现 。 一般的方法很
难检测这些发散的基因序列 , 但这种反方法不适用
于基因组的范围 , 因为这样会产生太多的候选基因
而无法进行下一步的验证 。
第 3种是不依赖于同源性和 m ic ro RN A 基因簇
的基因搜索法[’6洲 。 该方法利用近亲物种中 mi-
cro R NA 基因序列的保守性 、非编码性 、 以及前体可
形成潜在茎环结构等特性来给候选 m ic ro R NA 序列
计分( , e o d n g ) 。 B e re z i k 。, E 等[’8 ]使用 Phylogenetie
shadow ing 鉴定 了 16 个 人 的新 m iero RN A 。 L i m
等〔’9 , 4D] 使用 Mi rs ca 。 软件 , 分别在线虫和人中鉴定
了 30 个和 38 个新 m iero RN A 基因 。 对 m iero RN A
基因预测的软件主要归纳见表 1 。
表 1 基因预测方法
软件 物种 网址 参考文献
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果蝇及昆虫基因组
线虫和脊椎动物
植物和动物
哺乳动物
人类和小鼠
http://toy.lbl.gov:9050/egi 一 b i可m iR seeker.pl
http :/ 罗nes.m ir.ed盯m irs call/
httP ://bioinfo .au .tsingh ua .edu .e耐m iral i,
http : / / bi
. snu. ae . kr/ P rOMi印
htp :/ bio.52.tsingh ua.edu.e丫findtar/ index.html
[38]
赶39 , 4 0 了
2 .4 m ieroR N A 靶基因预测
目前 , 已知的 m ic m R N A 靶基因数量非常有限 ,
不能为预测提供充足的依据 , 而且 m ic ro RN A 作用
规律十分复杂 , 平均每条 mic ro R N A 作用的靶基因
超过 50 条 , 每条基因又可被上百条 micr oR N A 所调
节 , 所以对预测的候选基因的鉴定步骤非常繁琐很
难实现高通量和规模化 。 从已知的 m icr oR N A 与靶
基因的相互作用中 , 人们得出 m ic ro R NA S ‘ 端的 2 -
8 个核昔酸几乎无一例外地与靶 m R NA 3 ’端 uTR
区完全互补 , 并计算了预测的 mi R N A :mi R NA * 双
链的自由能的特点被各种靶基因预测方法广泛采
用 。 同时 , 结合 mic ro R NA 与靶基因形成二聚体的
热力学稳定性 和二级结构分析软件 , 如 M Fo ld 、
R N A F o l d 和 R N Ahybri d , 以及 m iero RN A 的 3 ’端与靶
基因的互补情况等 , 作为其它限制条件来进行 m i-cro RN A 靶基因预测 , m ic ro R N A 靶基因预测软件以
及一些方法(表 2 ) 。
几种实验方法已经用于验证预测的靶基因 , 其
中最常用的是构建荧光素酶报告基因载体。 在这个
载体的报告基因编码区的下游含有靶基因的 3 ’ U T R
区和推测的结合位点 , 用该载体转染表达 而R N A
的细胞后 , 如果野生型载体中报告基因的活性低于
带有突变结合位点的载体中报告基因的活性 , 可证
明这个 mi R N A 确实作用于该靶基因。 另外 , 还可通
过抑制 mi R NA 、或增加 mi R N A 浓度来研究 。
目前 , 对于 mi R NA 的开发研究还不是非常成
熟 ,许多方法也正在 日臻完善 , 这其中存在一些问
题 ,如 m ic ro R N A 的生理过程和生理功能研究还不
十分透彻 , m ic ro R N A 与 m R NA 作用的具体作用机
制还在实验研究中。 利用实验的方法主要是通过构
建文库克隆 , 利用这种方法进行大规模开发存在着
效率低 、工作量大 、成本高等缺点 , 而且具有一定的
盲目性 。 然而利用生物信息学开发的方法则是以来
m ic ro R N A 本身的结构特点进行搜索 , 缺乏一定可靠
年增刊 王晶等:m ic ro RN A 的实验和生物信息学开发方法 12 9
性 , 还需要实验进一步验证 。 对于 m icr oR N A 的研
究既可以从传统的实验角度进行正向开发 , 也可以
从调控 目的基因的角度反向研究 , 同时又亚待新方
法的开发研究 。 m ic ro R N A 作为新发现的非编码
RN A , 参与生命活动重要过程的调控作用 , 所以对
m ic ro RN A 研究将为生命科学研究开辟了全新的思
路 , 并为分子生物学研究提供了更新的方法 。 随着
研究技术 日新月异的发展必将有越来越多的方法应
运而生 , 给我们带来更多的惊喜。
表 2 靶基因预测的软件或方法
预测的软件或方法 物种 网址
m iR an da
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参考文献
[4 ]
[45」
[46 ]
〔47 一 4 8 〕
[49〕
[50〕
[51〕
[52 〕
[53〕
〔54 ]
〔55子
m iRNA tar getpredietionsatEM BL
果蝇 , 脊椎动物
所有哺乳动物
所有哺乳动物
脊椎动物
所有哺乳动物
所有哺乳动物
线虫和果蝇
所有哺乳动物
所有哺乳动物
线虫 、果蝇和小鼠
人 、 鼠 、家犬
果蝇
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m irB as e
R ef. 2 7
所有动物
脊椎动物、昆虫 、线虫
果蝇 、线虫
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参 考 文 献
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