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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
拮抗菌株 Kc-t99 的鉴定及其抑菌活性研究
任大明1 张晓轩1 董丹2 刘伟成2 刘德文2
(1沈阳农业大学生物技术学院，沈阳 110161;
2北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097)
收稿日期:2010-12-31
基金项目:北京市自然科学基金项目(6101001) ，北京市科技计划项目(D0706005040231) ，公益性行业(农业)科研专项(200903049-07)
作者简介:任大明，男，教授，研究方向:酶工程与微生物;E-mail rendaming@ 126． com
张晓轩，男，硕士研究生，研究方向:微生物生物化学与分子生物学;E-mail zxxzhangxiaoxuan@ 163． com
通讯作者:刘伟成，男，研究员，研究方向:真菌病害及其生防微生物;E-mail liuwc@ 126． com
摘 要: 通过传统分类与分子生物学技术相结合的方法对从京郊菜园土壤中分离筛选的拮抗菌株 Kc-t99 进行鉴定，并
采用生物测定的方法评价其抑菌活性。结果表明，菌株 Kc-t99 的形态学特征和生理生化特性与枯草芽孢杆菌基本一致，其
16S rDNA序列与 GenBank中已鉴定的枯草芽孢杆菌的 16S rDNA序列同源性高达 98． 06%，据此初步确定其为枯草芽孢杆菌。
抑菌试验表明该菌株对供试的 5 种病原真菌和 4 种细菌均具抑菌活性，其中对甘蓝枯萎病菌、黄瓜角斑病菌和桃褐腐病菌抑
制作用显著。
关键词: 拮抗芽孢杆菌 分类鉴定 抑菌活性 病原真菌 细菌
Studies on Taxonomy and Microbiostatic Activity of
Antagonistic Strain Kc-t99
Ren Daming1 Zhang Xiaoxuan1 Dong Dan2 Liu Weicheng2 Liu Dewen2
(1College of Biological Science and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161;
2 Institute of Plant and Environment Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097)
Abstract: The taxonomic status of the antagonistic strain Kc-t99，isolated from the soil in a Beijing suburb，was identified with the
traditional classification and molecular biotechnology，and the inhibiting activity was evaluated by bioassay in vitro． The result showed that
the morphological，physiological and biochemical characteristics of the strain were basically consistent with that of Bacillus subtilis，and the
homology of 16S rDNA sequence between Kc-t99 and B． subtilis was 98． 06% ． On this basis，strain Kc-t99 was identified as B． subtilis． The
antimicrobial test approved that the strain was capable of inhibiting 5 pathogenic fungi and 4 bacteria，especially displayed a significant in-
hibitory activity to Fusarium oxysporum f． sp． conglutioans，Pseudomonas syringae pv． lachrymans and Monilinia fructicola．
Key words: Antagonistic Bacillus Taxonomy Microbiostatic activity Pathogenic fungi Bacteria
化学合成农药的长期使用不但增加了病原菌的
抗药性，而且严重破坏了生态环境［1］，因此，开发高
效、低毒、环境兼容的植保替代产品已成为当务之
急。生物农药具有源于自然、易于在自然界的代谢
循环中分解的特点，符合可持续农业生产的要求，近
年来得到了迅猛的发展。特别是在微生物代谢产物
中寻找杀菌谱广的天然成分，开发生物制剂已成为
近年来的研究热点［2］。
芽孢杆菌是一类土壤习居菌，在土壤微生物中
占有较大比例，多年来一直受到重视。到目前为止，
已有许多芽孢杆菌产品在实际生产中被应用于植物
病害的防治，有些还被用作药物、保健品和饲料添加
剂［3］。因此，芽孢杆菌在生物防治的应用中具有广
阔的前景。
菌株 Kc-t99 是从京郊菜园中筛选出的一株拮
抗芽孢杆菌，初步试验表明其对供试的指示真菌和
细菌均有很好的抑制效果。为了明确其分类地位，
并评价其在植物病害生物防治中的应用潜能，本研
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
究拟对其进行系统的分类鉴定，并测定其对几种主
要靶标病原真菌和细菌的抑制活性。
1 材料与方法
1． 1 供试菌种
拮抗菌 Kc-t99由北京市农林科学院植保环保所
生防微生物研究室自京郊菜园土壤中分离筛选获得，
保存编号为 JZB120002;病原菌甘蓝枯萎病菌(Fusari-
um oxysporum f． sp． conglutioans)、小麦纹枯病菌(Rhi-
zoctonia cerealia)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、
苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana f． sp． pirico-
la)、百合根腐病菌(F． oxysporum)、黄瓜角斑病菌
(Pseudomonas syringae pv． lachrymans)均由本室分离
自京郊田间病株，辣椒疮痂病菌(Xanthomonas vesicato-
ria)、茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和大肠
杆菌(Escherichia coli)由中国农科院植保所提供，蜡
状芽孢杆菌(Bacillus cereus)由沈阳农业大学提供。
1． 2 培养基
Kc-t99 液体培养基:葡萄糖 0． 5%、牛肉膏
0． 3%、蛋白胨 0． 5%;发酵培养基:葡萄糖 0． 7%、牛
肉膏 0． 3%、蛋白胨 0． 5%、硫酸镁 0． 02%;NA 培养
基参照文献［4］、PDA 培养基参照文献［5］、生理生
化鉴定用培养基参照文献［6］配制。
1． 3 主要试剂
大肠杆菌 E． coil DH5α、细菌基因组 DNA 提取
试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、普通质粒小
提试剂盒均购于天根生化科技有限公司;PCR 反应
体系、链接反应体系及酶切反应体系所需试剂均购
自大连宝生物工程(大连)有限公司。
1． 4 菌株 Kc-t99 形态学观察
Kc-t99 菌种于 NA 斜面上活化培养 24 h，挑取
活化的菌落进行革兰氏染色［6，7］，对细胞个体及排
列方式进行观察，并对菌落的形态、大小、边缘、表
面、隆起、透明度和颜色等进行观察。
1． 5 生理生化特性测定
按文献［6］和［7］的方法测定菌株 Kc-t99 的生
理生化特性。
1． 6 16S rDNA序列分析
1． 6． 1 基因组 DNA提取 刮取 1 环经 NA 活化培
养 24 h的 Kc-t99 斜面菌种，接入装有 20 mL液体培
养基的 50 mL 三角瓶中，37℃、180 r /min 振荡培养
12 h，取菌悬液提取基因组 DNA，具体操作参照细菌
基因组 DNA提取试剂盒说明书进行。
1． 6． 2 PCR扩增 参照文献［8，9］的方法进行，引
物序列为 A1:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，
A2:5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3;PCR(25 μL)反
应体系:TaqTM酶 0． 5 μL，10 × PCR Buffer 2． 5 μL，
dNTP 4 μL，引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，补 ddH2O
至 25 μL;PCR反应条件:94℃预变性 5 min;94℃变
性 40 s，55℃退火 45 s，70℃延伸 2 min，30 个循环;
最后 72℃延伸 15 min，4℃保存。
1． 6． 3 序列测定及同源性分析 PCR 扩增产物用
3%琼脂糖凝胶回收，将纯化回收后的 16S rDNA 连
接到 pMD18-T载体上，连接反应体系:4． 5 μL 目的
基因片段，0． 5 μL pMDT-18 载体质粒，5 μL solution
Ι;水浴连接 16 h。将连接产物转到大肠杆菌 DH5α
中，通过蓝白斑筛选［10］挑取阳性克隆子，并通过双
酶切［8］检测转化结果，验证正确后送北京三博远志
技术有限责任公司测序。测序后获得的 16S rDNA
序列，在 NCBI进行 BLAST比较［11］，最后利用 DNA-
MAN软件构建系统发育树［12］。
1． 7 生物活性测定
采用平板对峙法测定 Kc-t99 对植物病原真菌
的抑菌作用，在 PDA 平板边缘接种 Kc-t99，28℃恒
温培养 1 d后，在平板中央接种直径为 7 mm的真菌
菌饼，继续培养 4 d后测量菌落间的抑菌带宽度，以
在未接种 Kc-t99 的 PDA 中培养真菌菌饼作阴性对
照。对细菌的抑菌作用采用牛津杯法，将在液体培
养基中培养 24 h 的 Kc-t99 菌悬液，以 2%(V /V)的
量接种到发酵培养基中，28℃、180 r /min 振荡培养
48 h;发酵液 8 000 r /min 离心 10 min，上清过 0． 22
μm滤膜，取滤液 100 μL滴加在含有 2%细菌的 NA
平板中央的牛津杯中(直径 7 mm) ，待发酵滤液扩
散后置 28℃条件下恒温培养，1 d 后观察并测量抑
菌圈大小。以无菌水作阴性对照。
1． 8 数据的统计分析
利用统计分析软件 SPSS13． 0，选择 Duncan 法
对生物活性测定结果进行方差分析和多重比较。
2 结果与分析
2． 1 菌株 Kc-t99 的分类鉴定
2． 1． 1 形态学特征 Kc-t99菌落在普通培养基上呈
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2011 年第 4 期 任大明等:拮抗菌株 Kc-t99 的鉴定及其抑菌活性研究
浅黄色，不透明，表面干燥、无光泽，有褶皱的隆起，菌
落边缘不整齐。革兰氏染色呈阳性，在显微镜下呈单
个菌体，不同生长期菌体形状略有差异，椭圆或直杆
状，芽孢椭圆形，在孢囊中部或中上部，无伴孢晶体。
2． 1． 2 生理生化特性 菌株 Kc-t99 的生理系列化
反应结果列于表 1。将此结果参考文献［6，7］中的
检索表进行检索，与枯草芽孢杆菌(B． subtilis)相应
性状吻合。
2． 1． 3 16S rDNA序列及其与相关种的同源性 使
用通用引物 A1和 A2可扩增出约1． 5 kb的特异性条
带，将测序结果相互重叠拼接，得菌株 Kc-t99 的 16S
rDNA序列(图 1)。此序列与 GenBank 中芽孢杆菌
16S rDNA序列进行同源性比较构建的系统进化树，
结果(图 2)显示菌株 Kc-t99 与已知菌株 B． subtilis
Pab02 的亲缘关系最近，在同一分支，二者的 16S
rDNA序列同源性达到 98． 06%。
表 1 菌株 Kc-t99 生理生化特性
测定项目 反应 测定项目 反应
运动性 + 卵黄卵磷脂酶 －
接触酶 + 形成吲哚 －
V-P测定 + 硝酸盐还原 +
葡萄糖产酸 + 形成二羟基丙酮 +
山梨糖产酸 + 纤维素分解 +
甘露糖产酸 + 产糊精 －
甘露醇产酸 + 2%NaCl生长 +
阿拉伯糖产酸 － 5%NaCl生长 +
木糖产酸 + 7%NaCl生长 +
葡萄糖产气 － 荧光反应 －
酪朊水解 + 氯霉素敏感性 +
明胶水解 + 链霉素敏感性 +
淀粉水解 + 氨苄敏感性 －
利用柠檬酸盐 + 酪氨酸水解 －
利用丙酸盐 － 苯丙氨酸脱氨酶 －
“ +”表示阳性结果，“-”表示阴性结果
图 1 菌株 Kc-t99 的 16S rDNA序列
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
图 2 根据菌株 Kc-t99 16S rDNA
序列同源性构建的系统进化树
2． 2 菌株 Kc-t99 对主要靶标的抑菌活性
对 5 株病原真菌和 5 株细菌抑菌活性测定结果
如表 2。从表 2 可以看出，菌株 Kc-t99 对供试的所
有病原真菌和 4 种细菌均表现较好的生长抑制作
用，其中对甘蓝枯萎病菌、桃褐腐病菌及黄瓜角斑病
菌抑制效果显著。
3 讨论
在传统分类中，细菌的菌落形态、菌落扩展方
式、革兰氏染色、芽孢染色及其他各项生理生化指标
是确定菌株分类地位的重要依据，近年来分子生物
学技术越来越多地应用于细菌的分类研究。由于
16S rRNA的功能同源性高且古老，其序列变化与进
化距离相适应，因此已成为细菌分类研究中最有用
的“分子钟”［13，14］，通过分析 16S rRNA 基因(16S
rDNA)序列，可以在分子水平上揭示不同个体间遗
传因子的相似性程度，其分析的结果与形态学特征
和生理生化指标相结合，使鉴定结论更为准确可靠;
一般认为细菌间 16S rRNA基因序列同源性达 97%
以上的菌株即可定为同一个种［14］。本研究在形态
观察和生理生化特性测定的基础上，分析了拮抗菌
株 Kc-t99 的 16S rDNA 序列，其与枯草芽孢杆菌的
同源性高达 98． 06%，因此可以将其鉴定为枯草芽
孢杆菌。
表 2 菌株 Kc-t99 对供试靶标菌的抑菌活性
靶标真菌
抑菌带宽(mm)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值
靶标细菌
抑菌圈直径(mm)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值
甘蓝枯萎病菌
(Fusarium oxysporum
f． sp． conglutioans)
14． 25 13． 50 14． 50 14． 08 a
蜡状芽孢杆菌
(Bacillus cereus)
23． 50 20． 50 22． 50 22． 17 b
桃褐腐病菌
(Monilinia fructicola)
13． 00 13． 50 12． 50 13． 00 b 大肠杆菌(E． coli) 13． 00 14． 50 14． 50 14． 00 c
小麦纹枯病菌
(Rhizoctonia cerealia)
11． 00 10． 75 11． 25 11． 00 c
黄瓜角斑病菌
(Pseudomonas syringae
pv． lachrymans)
26． 00 26． 50 25． 00 25． 83 a
苹果轮纹病菌
(Botryosphaeria berengeriana
f． sp． piricola)
12． 50 13． 00 13． 50 13． 00 b
辣椒疮痂病菌
(Xanthomonas vesicatoria)
8． 50 9． 00 9． 00 8． 83 d
百合根腐病菌
(F． oxysporum)
10． 50 11． 00 11． 00 10． 83 c
茄子青枯病菌
(Ralstonia solanacearum)
0 0 0 0． 00 e
小写字母示方差分析的结果，同一列内标有同一字母的均值在 α = 0． 05 水平上无显著差异
枯草芽孢杆菌是一种应用广泛的生防菌，其抑
菌谱广，国外已开发出防治各类作物白粉病、霜霉
病、炭疽病、菌核病、灰霉病和疫病等真菌与细菌病
害的菌剂。国内用于防治水稻纹枯病和三七根腐病
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2011 年第 4 期 任大明等:拮抗菌株 Kc-t99 的鉴定及其抑菌活性研究
和烟草黑胫病等病害也取得了良好的效果［1，15］。拮
抗菌株 Kc-t99 兼具抑制真菌和细菌的活性，对甘蓝
枯萎病菌和黄瓜角斑病菌表现了显著的抑制作用。
其中的甘蓝枯萎病是公认难以防治的系统性侵染
的土传病害，对其生物防治的研究报道较少，加
之其近年新传入我国，传播漫延迅速，对甘蓝的
生产造成了严重的威胁，目前尚无理想的防治方
法，亟待开发有效的防治产品和技术。本研究确
定了拮抗菌 Kc-t99 的分类地位和对甘蓝枯萎病
菌的抑菌活性，为其进一步的抑菌机理、菌种选
育和发酵工艺等研究，进而研制和开发高效、安
全、环境兼容的甘蓝枯萎病生防制剂奠定了良好
的生物学基础。
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(责任编辑 李楠)
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