全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 May 2010, 29(3): 365-372

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2010 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：公益性行业（农业）科研专项（3-27）
*Corresponding author. E-mail: zhangjx1210@yahoo.com.cn
收稿日期: 2009-09-24, 接受日期: 2009-11-17

侧耳属主要种类 ITS 序列分析
黄晨阳 陈强 高山 高巍 张金霞*
中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 北京 100081



摘 要：对侧耳属 16 个种的 38 个菌株进行了 ITS 序列测定，统计分析种内和种间序列趋异度。结果表明，16 个种的 ITS
序列种内趋异度很小，为 0－0.007，其中 Pleurotus djamor 不同地理来源的 3 个菌株的趋异度为 0.007。在 16 个种的种间 ITS
序列趋异度中，P. rattenburyi 和 P. djamor 之间趋异度最大，为 0.282；P. ostreatus 和 P. cornucopiae 之间的趋异度最小，为
0.003。利用 ITS 序列能够对侧耳属的大多种类进行有效鉴定。ITS 序列差异 2%－3%作为伞菌中种的鉴定临界值在侧耳属中
并不合适。而对于 P. ostreatus 和 P. cornucopiae 的准确鉴定，仍需开发新的分类鉴定标记。以香菇为外群，用贝叶斯法构建
的侧耳属系统发育树表明，系统发育树的部分节点十分可靠，后验概率值为 0.96－1.0。
关键词：分类鉴定，系统发育，贝叶斯法，序列趋异度

Analysis of internal transcribed spacer regions of main species of
the genus Pleurotus
HUANG Chen-Yang CHEN Qiang GAO Shan GAO Wei ZHANG Jin-Xia*
Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: In this study, ITS of 38 strains belonging to 16 species of Pleurotus were sequenced, and the sequence divergences were
analyzed intraspecifically and interspecifically. The results showed that sequence divergence was low for 16 Pleurotus species,
ranging from 0 to 0.007. The sequence divergence was 0.007 for three P. djamor strains from different geographic locations. The
0.282 divergence was the largest, occurring between P. rattenburyi and P. djamor, and the 0.003 divergence was the smallest,
occurring between P. ostreatus and P. cornucopiae. Our study indicated that ITS sequencing was a useful tool for identification of
most species of Pleurotus. It might not be suitable to identify Pleurotus using the 2%－3% differentiation of ITS sequence which was
considered as a critical value for species taxonomical indicator in agaric. New methods are needed to discriminate P. ostreatus and P.
cornucopiae. The phylogenetic tree of Pleurotus was yielded from Bayesian analyses compared with an outgroup Lentinula edodes.
It showed that partial topology of phylogenetic tree is reliable with posterior probability values 0.96－1.0.
Key words: identification, phylogenetic relationships, Bayesian, sequence divergence
DOI:10.13346/j.mycosystema.2010.03.022
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侧耳属 Pleurotus (Fr.) P. Kumm.是与人类关系
密切的重要经济真菌，世界广泛存在 20 种（Kirk et
al. 2008），对木质纤维素的转化以及环境修复作用
倍受关注（Hadar et al. 1993）。其中的糙皮侧耳
Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.是全球性栽培种
类，其基因组测序工作已于 2007 年已启动。近 200
年来，侧耳属描述的分类单元超过1,000个（Guzmán
2000），主要原因是子实体形态受环境条件影响大，
按照形态特征分类导致较多的同物异名或同名异
物。为了正确认识和科学利用侧耳属资源，其分类
鉴定和系统发育研究得到广泛关注（Vilgalys & Sun
1994；Bunyard et al. 1996；Vilgalys et al. 1996；Thorn
et al. 2000；Moncalvo et al. 2002；马富英和罗信昌
2002；李雪玲和姚一建 2004；郑和斌等 2006；李
翠新 2007），但是，目前对侧耳属的分类鉴定和系
统发育关系仍未完全明确。
分子生物学和生物信息技术的发展，为侧耳属
的鉴定和系统发育研究提供了诸多可供选择的技
术方法。但是，使用传统分类方法命名的研究材料，
甚至命名有误的材料，结果分析的错误便不可避
免。其次，GenBank 收录序列信息时缺乏对样品生
物学物种的准确性审核，GenBank 序列信息可靠性
不足（Harris 2003；Nilsson et al. 2006；Brock 2009）。
这些不足导致了侧耳属的鉴定和系统发育研究结
果更加混乱。另外，系统发育树重建的方法也是影
响系统发育结果的重要因素之一。不同方法的可靠
性和实用性依赖于数据的结构和大小，不同方法的
优缺点引起激烈争论（Saitou 1996；Swofford et al.
1996 ； Avise 2004 ）。最大简约法（ Maximum
Parsimony，MP）、距离矩阵邻接法（Neighbor
Joining，NJ）、最大似然法（Maximum Likelihood，
ML）、最小进化法（Minimum Evolution，ME）和
贝叶斯法（Bayesian）是生物系统发育树重建的主
要方法。贝叶斯法能够根据分子进化的现有理论和
模型用概率重建系统进化关系，克服 ML 法计算速
度慢、不适用于大数据集样本的缺陷，并且贝叶斯
法无需自引导法进行检验，以后验概率直观地表示
分析结果，弥补了 MP、NJ、ML 和 ME 法的缺点，
得到广泛的应用（Holder & Lewis 2003）。
本研究选择了经分类学专家生物学物种鉴定
的侧耳属16种38个菌株为材料，测定（ Internal
Transcribed Spacer，ITS）序列，以全部自测数据分
析侧耳属种间ITS趋异度；并以香菇Lentinula edodes
(Berk.) Pegler为外群，采用贝叶斯法构建系统发育
树，以减少引用网上数据比对导致的误差，从而较
全面地探讨侧耳属内的系统发育关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究所采用的侧耳属 38 个菌株，分属于 16
个种，其中包括全球主要栽培种类，供试材料及来
源见表 1。
表 1 供试材料及来源
Table 1 Materials used in this study with origin and GenBank accession numbers
序号
No.
菌株编号
Strain number
种名
Species
来 源
Origin
登录号
GenBank accession No.
1 CBS102498 Pleurotus abieticola R.H. Petersen & K.W. Hughes 俄罗斯 Russia EU424277.2
2 CBS100128 P. australis Cooke & Massee 澳大利亚 Australia EU424275.2
3 CBS100127 P. australis 澳大利亚 Australia EU424276.1
4 CBS325.85 大幕侧耳 P. calyptratus (Lindblad) Sacc. 斯洛伐克 Slovakia EU424283.2
5 ACCC50234 白黄侧耳 P. cornucopiae (Paulet) Rolland 云南 Yunnan, China EU424284.2
6 ACCC50375 白黄侧耳 P. cornucopiae 德国 Germany EU424301.2
7 ACCC51261 金顶侧耳 P. citrinopileatus Singer 吉林 Jilin, China EU424285.1
8 ACCC50089 泡囊侧耳 P. cystidiosus O.K. Mill. 香港 Hongkong, China EU424278.2
9 CBS615.80 泡囊侧耳 P. cystidiosus 印度 India EU424279.2
10 ACCC51280 泡囊侧耳 P. cystidiosus 福建 Fujian, China EU424280.1
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菌物学报
续表 1
11 ACCC51282 泡囊侧耳 P. cystidiosus 台湾 Taiwan, China EU424281.2
12 CBS100129
泡囊侧耳台湾变种
P. cystidiosus var. formosensis Moncalvo
台湾 Taiwan, China EU424282.1
13 CBS100134 浅红侧耳 P. djamor (Rumph.) Boedijn 巴新 Papua New Guinea EU424287.2
14 CBS665.85 浅红侧耳 P. djamor 荷兰 Netherlands EU424288.1
15 ACCC51300 浅红侧耳 P. djamor 德国 Germany EU424289.2
16 CBS278.90 栎生侧耳 P. dryinus (Pers.) P. Kumm. 荷兰 Netherlands EU424290.2
17 CBS449.77 栎生侧耳 P. dryinus 捷克 Czech Republic EU424291.2
18 CBS481.72 栎生侧耳 P. dryinus 德国 Germany EU424292.2
19 CBS724.83 栎生侧耳 P. dryinus 荷兰 Netherlands EU424293.2
20 CBS804.85 栎生侧耳 P. dryinus 荷兰 Netherlands EU424294.2
21 CBS100.82 刺芹侧耳 P. eryngii (DC.) Quél. 斯洛伐克 Slovakia EU424295.2
22 CBS613.91 刺芹侧耳 P. eryngii 西班牙 Spain EU424296.1
23 ACCC50757 刺芹侧耳 P. eryngii 法国 France EU424297.2
24 CBS282.32 阿魏侧耳 P. eryngii var. ferulae (Lanzi) Sacc. 荷兰 Netherlands EU424299.2
25 CBS307.29 P. euosmus (Berk.) Sacc. 英国 UK EU424298.2
26 ACCC50715 糙皮侧耳 P. ostreatus (Jacq.) P. Kumm. 毛里求斯 Mauritius EU424286.2
27 CBS593.82 糙皮侧耳 P. ostreatus 荷兰 Netherlands EU424300.2
28 CBS291.47 糙皮侧耳 P. ostreatus 法国 France EU424309.2
29 CBS375.51 糙皮侧耳 P. ostreatus 意大利 Italy EU424310.2
30 ACCC51060 白灵侧耳 P. nebrodensis (Inzenga) Quél. 福建 Fujian, China EU424304.1
31 ACCC50869 白灵侧耳 P. nebrodensis 新疆 Xinjiang, China EU424308.2
32 CBS100130 肺形侧耳 P. pulmonarius (Fr.) Quél. 澳大利亚 Australia EU424311.2
33 ACCC50082 肺形侧耳 P. pulmonarius 印度 India EU424312.2
34 CCMSSC00649 肺形侧耳 P. pulmonarius 云南 Yunnan, China EU424313.2
35 ACCC50892 肺形侧耳 P. pulmonarius 美国 USA EU424314.2
36 CBS175.94 P. rattenburyi Segedin 澳大利亚 Australia EU424315.2
37 CBS680.82 P. smithii Guzmán 墨西哥 Mexico EU424317.1
38 ACCC50657 菌核侧耳 P. tuberregium (Fr.) Singer 福建 Fujian, China EU424319.2
39 ACCC51462 香菇 Lentinula edodes (Berk.) Pegler 浙江 Zhejiang, China EU424320.2
Note: ACCC, Agricultural Culture Collection of China; CBS, Centraalbureau voor Schimmelcutures, Baarn, The Netherlands; CCMSSC, China
Center for Mushroom Spawn Standards and Control.

1.2 DNA 提取
基因组总 DNA 采用 CTAB 法提取（Palumbi
1996），0.8%的琼脂糖凝胶检测 DNA 样品质量和
浓度。
1.3 PCR 扩增
选用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC
GG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC
-3′）（White et al. 1990）。PCR 扩增反应在 iCycler
Thermal Cycler 上进行。反应体积为 50µL，其中：
1.25U Ex Taq DNA 聚合酶（TaKaRa），1× Ex Taq
Buffer（Mg2+ plus），0.2mmol/L dNTPs，引物 ITS1
和 ITS4 各 0.4µmol/L，10－20ng DNA 模板。扩增
程序为：94℃预变性 5min；然后 94℃变性 40s，58℃
退火 40s，72℃延伸 60s，35 个循环；最后 72℃补
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平 7min，4℃保存。扩增产物经 1.4%的琼脂糖凝胶
电泳检测。
1.4 克隆和序列测定
采用 PCR 产物直接测序。对于未成功的，采用
克隆后测序。PCR 产物经 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回
收试剂盒（Sangon）纯化，纯化后连接于 pMD19-T
Vector（TaKaRa），纯化和克隆按试剂盒说明书操作。
测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
测序结果经人工核对，提交 GenBank。
1.5 数据分析
根据 Keller et al.（2009）的方法查找 ITS2 序列。
序列比对采用 ClustalX 2.0（Larkin et al. 2007）。序
列趋异度分析采用 MEGA4（Tamura et al. 2007）。
系统发育分析采用贝叶斯法，采用 MrBayes 3.1.2
（Ronquist & Huelsenbeck 2003）。系统进化树编辑
采用 Treeview 1.6.6（Page 1996）。
2 结果与分析
2.1 序列特征
当空位作缺失处理时，38 个侧耳属菌株 ITS 序
列排序后的长度为 685 位点，其中有 296 个多样性
位点，占总位点数的 43.21%。对 ITS 各个区域进行
独立分析后发现，ITS1 区域有 161 个多样性位点，
5.8S 区域有 4 个多样性位点，ITS2 区域有 130 个多
样性位点，28S 区域 41 个位点中，1 个多样性位点。
2.2 侧耳属种间和种内 ITS 差异
在侧耳属的 16 个种中，种内 ITS 趋异度较小。
其中，P. djamor 种内 ITS 的趋异度最大，仅为 0.007。
这应该与地理来源不同有关，3 个菌株 CBS100134、
CBS665.85、ACCC51300 分别来自巴新、荷兰、德
国。P. eryngii 种（含变种）内 ITS 趋异度为 0.002，
P. cystidiosus 种（含变种）内 ITS 趋异度为 0.001。
在 P. australis、P. cornucopiae、P. dryinus、P.
nebrodensis、P. ostreatus、P. pulmonarius 6 个种的
种内 ITS 序列完全相同。
侧耳属 16 个种的种间 ITS 的趋异度中，P.
rattenburyi 和 P. djamor 之间 ITS 的趋异度最大，为
0.282；P. ostreatus 和 P. cornucopiae 的 ITS 趋异度最
小为 0.003。P. abieticola、P. cornucopiae、P. eryngii、
P. nebrodensis、P. ostreatus 和 P. pulmonarius 的种
间趋异度为 0.003 － 0.034 。 P. euosmus 和 P.
citrinopileatus 的 ITS 趋异度为 0.022（表 2）。
表 2 侧耳属种间 ITS 序列趋异度
Table 2 Sequence divergence over ITS sequence between species in Pleurotus
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 Pleurotus abieticola
2 P. australis 0.219
3 P. calyptratus 0.196 0.223
4 P. citrinopileatus 0.196 0.235 0.201
5 P. cornucopiae 0.018 0.207 0.202 0.212
6 P. cystidiosus 0.206 0.123 0.203 0.227 0.216
7 P. djamor 0.204 0.230 0.162 0.199 0.200 0.230
8 P. dryinus 0.178 0.164 0.201 0.117 0.186 0.140 0.194
9 P. eryngii 0.024 0.219 0.207 0.226 0.019 0.223 0.217 0.205
10 P. euosmus 0.202 0.222 0.202 0.022 0.218 0.213 0.192 0.111 0.232
11 P. nebrodensis 0.025 0.223 0.213 0.233 0.018 0.223 0.216 0.202 0.014 0.239
12 P. ostreatus 0.022 0.210 0.205 0.214 0.003 0.221 0.204 0.188 0.023 0.220 0.022
13 P. pulmonarius 0.020 0.200 0.191 0.196 0.015 0.207 0.198 0.176 0.034 0.202 0.033 0.019
14 P. rattenburyi 0.230 0.222 0.246 0.226 0.237 0.220 0.282 0.185 0.241 0.229 0.244 0.238 0.230
15 P. smithii 0.227 0.146 0.235 0.235 0.239 0.095 0.243 0.152 0.251 0.230 0.252 0.244 0.220 0.243
16 P. tuberregium 0.193 0.217 0.245 0.197 0.207 0.210 0.237 0.117 0.214 0.197 0.213 0.211 0.191 0.216 0.233
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2.3 构建的系统发育树
由贝叶斯法构建的侧耳属系统发育关系树拓扑
结构，部分节点的后验概率值为0.96－1.0，十分可靠，
其余节点的后验概率值为0.61－0.87（图1）。同属于
侧耳属Pleurotus亚属的P. abieticola、P. cornucopiae、
P. eryngii 、 P. nebrodensis 、 P. ostreatus 和 P.
pulmonarius 6个种聚为一支，后验概率值为1.00，亲
缘关系较近，其中P. eryngii和P. nebrodensis后验概
率值为1.00，P. eryngii、P. nebrodensis、P. ostreatus

图 1 贝叶斯法重建的侧耳属系统发育树 （树上各分支上的数
字表示 Bayesian 后验概率）
Fig. 1 Phylogenetic tree of Pleurotus constructed by Bayesian analyses
(Numbers on the tree represent the values of posterior probability
values).
和 P. cornucopiae 后验概率值为 0.99。同属于侧耳
属 Coremiopleurotus 亚 属 的 P. australis 、 P.
cystidiosus 和 P. smithii 聚为一支，后验概率值为
1.00。P. citrinopileatus 和 P. euosmus 聚为一支，后
验概率值为 1.00。P. calyptratus 和 P. djamor 聚为一
支，后验概率值为 0.99。其余节点后验概率值虽然
超过 0.6，但并未超过 0.95。
3 讨论
3.1 ITS 和分类鉴定
自 Gardes et al.（1991）利用 ITS 在真菌鉴定中
成功应用之后，以 ITS 序列为基础的真菌鉴定被广
泛应用（Gardes & Bruns 1993；Brock et al. 2009）。最常
用的方式是以测序结果进行序列比对，在测序时常
采用 PCR 产物直接测序，当直接测序失败后，采用
克隆后测序。由于 DNA 聚合酶保真性不同，导致
PCR 扩增存在一定的错配（Kobayashi et al. 1999），
克隆测序的结果并不能完全反映序列的真实结果；
也有针对特定种设计特异引物，进行属内近缘种的
鉴定（Amicucci et al. 1998）；也有使用 ITS-RFLP
进行分类鉴定（Gardes & Bruns 1996；Yang et al.
2007；Gurjar et al. 2009）；也有利用 ITS2 二级结构
进行物种鉴定（Kruger & Gargas 2008）。但是，ITS
并未成为真菌的 DNA Barcoding。另外，真菌的 ITS
序列差异多少才界定为同种一直未有定论（Nilsson
et al. 2008）。Hughes & Petersen（2009）认为伞菌
的 ITS 序列差异不超过 2%－3%定为同种。本研究
结果表明，利用 ITS 序列能够对于侧耳属的大多种
类进行有效鉴定。而其中的 P. cornucopiae 与 P.
abieticola、P. eryngii、P. nebrodensis、P. ostreatus、
P. pulmonarius 的种间趋异度均小于 0.02。P. eryngii
与 P. nebrodensis 种间趋异度、P. ostreatus 与 P.
pulmonarius 种间趋异度也小于 0.02。以 ITS 序列差
异不超过 2%－3%定为同种，并不合适。按照种间
生殖隔离的生物学物种的界定原则，这 6 个是独立
的生物学物种（Petersen & Ridley 1996；Petersen &
Hughes 1997；Bao et al. 2004）。其中的 P. ostreatus
和 P. cornucopiae 的 ITS 趋异度最小，仅为 0.003，
ITS 序列难以对两者有效地区分，仍需开发新的分
类鉴定标记。
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3.2 系统发育树拓扑结构的可靠性
系统发育的发生过程都是已经完成的历史，只
能去推断或者评估，而无法再现。真菌由于形态特
征较少、缺少可用的化石记录以及其丰富的多样性
给系统发育研究带来更多的不便。本研究表明，利
用贝叶斯法构建的侧耳属系统发育树，部分支点的
后验概率值大于 0.95，结果可靠，但是对于其他支
点后验概率值仅为 0.61－0.87。所以仅利用 ITS 序
列，并不能准确反映侧耳属内系统发育关系。李雪
玲和姚一建（2004）用 28S rDNA 构建侧耳属系统
发育树、Gonzalez & Labarère（2000）用线粒体中
核糖体小亚基 rRNA 的 V4，V6 和 V9 区序列构建
的侧耳属内系统发育树的许多节点自展值小于 70。
Hillis & Bull（1993）和 Kimball et al.（1999）认为
系统发育树分支的自展值小于 70，置信度小于
95%。所以采用 28S rDNA、V4，V6 和 V9 区也不
能完全正确的反映侧耳属内系统发育关系。采用多
个基因组合或者采用全基因组将提高系统发育分
析的可靠性（O’Donnell et al. 1998；Fitzpatrick et al.
2006；James et al. 2006；Hibbett et al. 2007）。
本研究表明，采用 ITS 序列能够满足侧耳属大
多种类的鉴定，虽未能完全阐明侧耳属系统发育关
系，但对侧耳属资源评价和遗传育种研究仍有指导
意义。
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Aime MC, Aptroot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL,
Castlebury LA, Crous PW, Dai YC, Gams W, Geiser DM, Griffith
GW, Gueidan C, Hawksworth DL, Hestmark G, Hosaka K,
Humber RA, Hyde KD, Ironside JE, Kõljalg U, Kurtzman CP,
Larsson KH, Lichtwardt R, Longcore J, Miadlikowska J, Miller A,
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