全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 5期
亚麻脱胶过程中细菌学、酶学及相关参数分析
孙燕华 1, 2
孙建光2
赵吉1
( 1 内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特 010021; 2中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,北京 100081)


摘
要:
在实验室条件下对亚麻原茎进行温水脱胶, 系统分析发酵过程中细菌总数、果胶菌、果胶酶、木聚糖酶、纤维素
酶、还原糖、总氮量、pH值及 COD等参数的动态变化。同时, 采用变性凝胶电泳 ( DGGE)技术探讨了亚麻脱胶过程的生物多
样性。
关键词:
亚麻脱胶
果胶酶
生物多样性
Investigation on the Bacteriologic and Enzymologic Parameters
in the Process of F lax Degumm ing
Sun Yanhua
1, 2
Sun J ianguang2
Zhao Ji1
(
1
College of Life Sciences of InnerM ongolia University, H uhehaote 010021;
2
Institute of Agricultural
Resources and Regional P lanning, CAAS, B eijing 100081)


Abstrac:t
F lax degumm ing in w arm w ater was conducted under lab cond itions
Bacter io log ic and enzymo log ic param e ters in flax
degumm ing process inc luding to ta l bacter ia, pectin decomposing bac teria, pec tinase, xy lanase, ce llu lase, reductive sugar, to ta l nitro

gen, pH and COD we re investigated
B iod ive rs ity study w ith DGGE techn iques w as a lso carr ied out

Key words:
F lax degumm ing
Pectinase
B iod iversity
收稿日期: 2009
01
21
基金项目:国家自然科技资源平台项目 ( 2005DKA21201
14
1 )
作者简介:孙燕华 ( 1984
) ,女,硕士研究生,研究方向:环境微生物工程
通讯作者:孙建光 ( 1963
) ,男,博士,副研究员,研究方向:微生物资源与利用; Te:l 010
82108701, E
m ai:l jgsun@ caas
ac
cn


亚麻是优良的纺织原料,亚麻织物具有透气性
好、纹理自然等独特风格, 广泛用于服饰领域。我国
亚麻生产规模仅次于俄罗斯,居世界第二位,亚麻产
业是我国出口创汇的重要产业之一。亚麻纤维存在
于亚麻原茎的韧皮部, 为了得到亚麻纤维需要将与
纤维附着在一起的果胶质、半纤维素 (主要成分是
木聚糖 )等其他非纤维物质脱除, 这个过程称为亚
麻脱胶。我国亚麻原茎脱胶多采用温水浸渍法,俗
称
沤麻
,这是一个由果胶菌和其他多种微生物参
与的生物发酵过程。目前, 我国北方地区仍然以温
水浸渍
沤麻
为主, 存在生产周期长、污水排放量
大、臭气污染环境等问题。系统研究了亚麻脱胶发
酵过程中细菌学、酶学等参数的动态变化,以期为改
善亚麻生产发酵工艺提供理论依据。
1
材料和方法
1
1
材料及试剂
亚麻原茎采自内蒙古牙克石亚麻厂。化学试剂
和生化试剂主要购自北京化学试剂公司和 Sigma
公司。
1
2
亚麻发酵
将亚麻原茎剪成 6~ 7 cm的小段, 称 300 g装
入 5 L的大烧杯, 按水浴比 1
20加入自来水, 放置
在恒温培养箱 35
条件下静置发酵至脱胶完成, 一
个周期 5~ 7 d。脱胶过程中每 12 h取样 1次,分别
测定果胶酶、木聚糖酶、纤维素酶活性、细菌总数、
pH、还原糖、总氮和 COD等。
1
3
细菌学测定
采用稀释平板法测定了亚麻发酵过程中的细菌
学变化。细菌总数测定用牛肉膏蛋白胨培养基 (牛肉
膏 1% ,蛋白胨 1%, NaC l 0
5%,琼脂 2%, pH7
2),果
胶菌测定用果胶培养基 (果胶 0
5%, 牛肉膏 0
3%,
蛋白胨 1%, NaC l 0
5% ,琼脂 2%, pH7
2)。
2009年第 5期 孙燕华等:亚麻脱胶过程中细菌学、酶学及相关参数分析
1
4
酶学测定
用 DNS比色法 [ 1]分别测定果胶酶、木聚糖酶、
纤维素酶活性。具体方法是用 pH4
4的乙酸钠缓
冲液分别配制果胶、木聚糖、羟甲基纤维素钠底物溶
液,使终浓度为 0
4%。将上述亚麻发酵水样品在
4
、8 000 r/m in离心 5 m in,取上清液 2m l加入 25
m l刻度比色管,再加入 2m l底物,加塞摇匀, 45
水
浴反应 30 m in,然后加入 1
5 m l的 DNS显色液摇
匀,置于沸水中显色 5m in,自来水冷却,加蒸馏水稀
释至 25 m ,l摇匀, 用分光光度计分别测定 520 nm、
550 nm、530 nm处吸光值, 计算酶活。以灭活样品
( 100
灭活 10 m in)作空白对照。酶活单位定义:
在 45
、pH4
4条件下,每分钟生成 1
mol还原糖
所需酶量为一个酶活单位。
1
5
其它参数测定
亚麻发酵液 pH值用雷磁 pH计直接测定, 还原
糖总量用 DNS法测定 [ 2] ,总氮用碱性过硫酸钾紫外
分光光度法 [ 3] , COD用重铬酸钾氧化法 [ 4]。
1
6
细菌多样性分析
1
6
1
发酵液细菌总 DNA提取
在亚麻发酵过程中,
每隔 24 h取样 30m ,l 4
、8 000 r/m in、5m in离心收集
菌体。参考 M iller的方法 [ 5] ,在上述菌体样品中加入
0
5 g ( 0
5 mm )的玻璃珠、3 m l磷酸盐缓冲液 ( 100
mmol /L NaH2PO4, pH8
0)、3 m l SDS 缓冲液 ( 100
mmol /L NaC ,l 500mmo l/L Tris
HC ,l 10% SDS)和 3 m l
氯仿。在混合振荡器上振荡 2m in, 65
温育 10m in,冰
浴 10m in;重复一次。11 000 r/m in离心10m in,转移上
清液于新的离心管中, 加入等体积氯仿 /异戊醇
( 24
1),缓慢颠倒混匀, 11 000 r/m in离心 10m in, 小心
转移上清液至新的离心管中,加入 0
6倍体积预冷异
丙醇,混匀, 室温沉淀 DNA 1h。11 000 r/m in离心 10
m in,弃去上清,用 70%酒精洗涤,风干,溶于 1m lTE缓
冲液中,于- 20
保存。
1
6
2
16S rDNA V3区扩增
采用通用引物, 正向
341:f 5

CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG
GGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG
3
, 反向 534
r
5

ATTACCGCGGCTGCTGG
3
,由上海生物工程有限
公司合成。PCR反应体系: 10
PCR buffer 5
,l dNTP
m ix( 2
5 mM each) 0
2 mM, Prmi er1 ( 10
M ) 0
5
,l
P rmi er2( 10
M ) 0
5
,l 25 mM MgC l2 2
5 mM, Taq酶
2
5U, DNA模板 2
,l用水补足 50
l。反应程序: 94

预变性 5m in,然后 94
1m in、65
1m in、72
3m in,每
个循环降低 0
5
, 20个循环, 94
1 m in、55
1 m in、
72
3m in 15个循环,最后 72
再延伸 7m in, 4
保存。
用含溴化乙锭的 1
5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR
产物。
1
6
3
变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )分析
采用美
国 B io
Rad公司的 D codeTM突变检测系统对 PCR产
物进行 DGGE分析。步骤:制备变性剂浓度为 30%
~ 60%的 8%聚丙烯酰胺凝胶,待胶完全凝固后将
胶板放入装有 0
5
TAE缓冲液的电泳装置中, 每
个样孔加入 20
l PCR产物, 200V、60
恒温电泳 5
h,采用银染方法 [ 6 ]进行凝胶染色。
2
结果与分析
2
1
亚麻脱胶过程细菌数量变化
亚麻脱胶是一个复杂的生物过程, 由图 1可以
看出,在发酵前期细菌总数和果胶菌数量都迅速提
高, 但细菌总数的增速明显高于果胶菌的增速, 在
48 h时达到最高点,之后细菌总数和果胶菌数量都
迅速下降, 60 h后细菌总数和果胶菌数量略有回
升, 84 h有一个小的增长,之后趋于平缓。
图 1
亚麻脱胶过程中细菌数量变化
2
2
亚麻脱胶过程的酶活性变化
亚麻脱胶目的是去除麻茎上的果胶等非纤维素
类物质。脱胶过程果胶酶起主要作用,图 2结果也
显示出果胶酶活性显著高于木聚糖酶和纤维素酶活
性, 随着发酵进程 84 h时酶活达到最高值, 然后缓
慢下降。木聚糖酶在 84~ 120 h有一个平缓的峰
值, 但总体起伏不大,而纤维素酶在整个发酵过程基
77
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 5期
本保持在相对较低的水平。
图 2
亚麻发酵过程酶活性变化
2
3
亚麻脱胶过程还原糖和总氮变化
由图 3可以看出,在亚麻脱胶的前 12 h还原糖
含量迅速上升,主要是因为麻茎中的可溶性糖溶于
水中, 之后还原糖进一步升高, 稍后缓慢下降。
图 3
亚麻脱胶过程还原糖变化
图 4
脱胶过程总氮的变化
图 4记录了脱胶过程总氮含量的变化。脱胶前
期麻茎中的含氮物质溶于水中,使水中的含氮量迅
速上升,发酵前期的 36 h升高较快, 以后上升比较
平缓, 在 96 h时达到最高点, 之后开始下降。
2
4
脱胶过程中 pH值和 COD的变化
亚麻脱胶发酵过程是一个 pH 下降、化学需氧
量 COD上升的过程。发酵前期 24 h,麻茎中的可溶
性碳氮物质溶解于沤麻水中, 引起微生物的大量生
长繁殖, 发酵液 pH 快速下降至 pH5, 之后趋于平
缓, 稳定在 pH4~ 5之间 (图 5)。COD的上升持续
的时间相对较长,在发酵前期的 72 h基本上保持直
线上升,之后缓慢上升, 趋于平缓 (图 6)。
图 5
脱胶过程中发酵液 pH值的变化
图 6
亚麻发酵过程中 COD的变化
2
5
亚麻脱胶过程的细菌多样性
变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )结果进一步揭示了
亚麻发酵过程中的细菌多样性 (图 7)。图中可看出
亚麻发酵过程细菌类群处于动态变化中, 24 h时的
优势菌群与 48 h明显不同,而且 48 h时细菌类群较
多, 这与平板培养法的分析结果一致, 96 h后优势
菌群变得相对稳定。
3
小结
在亚麻脱胶的过程中, 微生物活菌数在脱胶前
期迅速升高,后期下降; 脱胶酶果胶酶、纤维素酶和
木聚糖酶起着重要作用, 果胶酶含量明显高于其他
两种酶活性;含氮量和还原糖在脱胶前期都迅速增
加, 脱胶过程中微生物利用碳源, 还原糖含量在波动
中稍有下降,总氮在波动中有所上升; pH值前期迅
78
2009年第 5期 孙燕华等:亚麻脱胶过程中细菌学、酶学及相关参数分析



左
16S rDNA V3区 PCR结果;右
DGGE结果;
( 1
24 h, 2
48 h, 3
72 h, 4
96 h; 5
120 h)
图 7
亚麻发酵过程的细菌多样性
速下降,后期趋于稳定; 脱胶过程中, COD一直在升
高,前期增长迅速,后期缓慢。脱胶过程中 24~ 48 h
时间段内脱胶液中微生物数量相对较多。 48 h后
出现明显优势菌。
参 考 文 献
1
李忠福,徐建国
黑龙江医药, 2002, 15( 6 ) : 428~ 429

2
陈同度,生物化学实验指导 [M ]
北京:人民教育出版社, 1979

3
国家环境保护局
中华人民共和国国家标准:水质 总氮的测定
碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法 ( GB 11894
89 )
北京:中国
标准出版社, 1989

4
国家环境保护局
中华人民共和国国家标准:水质 化学需氧量
的测定 重铬酸盐法 ( GB 11914
89 )
北京: 中国标准出版
社, 1989

5
M il lerH, Kan eko S, Chung C
H epato logy, 1989, 9: 322~ 327

6
Bassam J, G aetano
Anolles G, Gresshof fM
Analytical B iochem ist ry,
1991, 196: 80~ 83

(上接第 70页 )
3
讨论
研究表明编码降 PAH s关键酶的基因有的位于
染色体上,有的位于质粒 DNA上 [ 6, 7]。例如拟诺卡
氏菌 KP7, 利用分子杂交技术检测发现包含 8个降
解基因的 DNA 片段均位于菌株的染色体 DNA
上 [ 8]。张杰在 2003年报道一株鞘鞍醇单胞菌属细
菌含有一个大约 60 kb大小的质粒, 且该质粒与
PAH s降解功能有关 [ 9]。本实验根据得到的环羟基
化双加氧酶的
亚基保守序列 310 bp片段设计探
针,由于菌株 L2质粒双酶切的效果不明显, 所以采
用单酶切菌株 L2质粒的方法做 Southern印迹杂交,
结果表明菌株 L2的双加氧酶
亚基基因定位于约
3
5 kb的 Pvu
、N ot
、BamH I和 H ind
酶切片段
上。通过这种定位为下一步构建基因文库, 为环羟
基化双加氧酶全长基因序列的获得提供了可能。
参 考 文 献
1
孙娟,郑文教, 陈文田, 等
生态学杂志, 2005, 24 ( 10 ): 1211
~ 1214

2
田蕴,郑天凌,胡忠,等
应用与环境生物学报, 2003, 9 ( 4 ) : 439
~ 443

3
张杰, 刘永生, 孟玲, 等
应用生态学报, 2003, 14( 10 ) : 1783~
1786

4
Ahn Y, Sanseverino J, S ayler GS
B iod egradation, 1999, 10: 149
~ 157

5
章俭,夏春谷
化学进展, 2004, 16( 1 ) : 116~ 122

6
郑乐,刘宛,李培军
生态学杂志, 2007, 26( 3 ): 449~ 454

7
曹晓星,田蕴,胡忠,等
生态学杂志, 2007, 26( 6 ): 917~ 924

8
Sa ito A, w abuch i T, H arayam a S
C hem osph ere, 1999, 38 ( 6 ):
1331~ 1337

9
张杰, 刘永生, 冯家勋, 等
应用与环境生物学报, 2003, 9( 5 ):
542~ 545

79