全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·技术与方法·
收稿日期：2008-07-07
基金项目：国家发改委稀土专项基金（IFZ051210）
作者简介：许科伟（1977-），男，在读博士，研究方向：环境科学
通讯作者：周青，E-mail：zhouqeco@yahoo.com.cn
生物修复 （bioremediation） 主要是利用天然存
在的或特别培养的微生物在可调控环境条件下将
有毒污染物转化为无毒物质的处理技术 [1]。 生物修
复主要依靠细菌、真菌甚至高等植物以及细胞游离
酶的自然代谢过程降解、 去除环境中的污染物，消
除或减弱环境污染物的毒性，减少污染物对人类健
康和生态系统的风险，是一类低耗、高效和环境安
全的生物技术。 从广义上说，生物修复包括微生物
修复、植物修复和细胞游离酶生物修复等三大主要
类型。 目前，作为环境科学研究中一个富有挑战性
的前沿领域，生物修复的研究已进入一个相当活跃
的时期，可以预见，生物修复将是 21 世纪初环境技
术的主攻方向之一 [2]。
从上个世纪 60 年代以来， 污染物降解菌的分
离、污染物微生物代谢途径分析以及微生物中污染
降解基因等方面均有迅速的发展。传统的微生物分
离培养方法不能满足微生物原位识别及形态学研
究的需要，并且在多样性和动力学研究方面还存在
着严重的局限性，不仅培养过程复杂耗时 ，只能反
映显微镜条件下极少部分的菌落数，而且大多数不
可培养的微生物则不能被检出。
分子生态学不是简单的分子技术在生态学问
题中的应用，而是代表着一个新兴的学科 ，具有着
生态学和分子生物学相互交叉的强大活力，分子生
态学作为一门学科的建立 ， 拓宽了人们的研究视
野。研究污染物降解菌的多样性以及微生物种群适
应污染环境的机理， 对于评价污染物的环境毒理、
生物降解性以及污染环境的自净具有重要的参考
分子生物学技术在生物修复中的应用研究进展
许科伟 1 周青 1，2
（1江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122；2江南大学环境与土木工程学院，无锡 214122）
摘 要： 随着分子生物学技术如分子杂交、PCR、电泳技术等的发展，微生物学研究领域发生了深刻的变革，灵敏
的检测和精确的细菌鉴定成为可能。微生物分子生态学作为分子生物学与微生物生态学交叉而形成的学科，在生物修复
方面得到广泛应用。从分子生物学实验技术角度综述了各种微生物分子生物学技术在生物修复中的应用研究情况。
关键词： 微生物分子生态学 生物修复 分子杂交 PCR 电泳
Advances in Microbial Molecular Ecology Applied to
Bioremediation
Xu Kewei1 Zhou Qing1，2
（1The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122；
2School of Environment and Civil Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： With the development of techniques of molecular biology，including nucleic acid probe detection，PCR
technique，and electrophoresis separation，the research on microbiology has been improved，which could facilitate monitor
and identificati on significantly. Microbial molecular ecology，as the intersectant subject of molecular biology and microbial
ecology，is being prevalent in bioremediation. The development of microbial molecular ecology for bioremediation of
contaminated environment was summarized in the review based on molecular ecology experiment.
Key words： Microbial molecular ecology Bioremediation Hybridization PCR Electrophoresis separation
2009年第 2期
价值 [3]。
1 分子生态学中主要研究方法
分子生态学研究始终依赖和跟踪分子标记技
术和分子检测技术。分子标记技术包括限制性片段
长度多态 （RFLP）、单核苷酸多态 （SNP）、扩增片段
长度多态性（AFLP）、随机扩增 DNA 多态性（RAPD）、
可变的串连重复多态 （VNTRP）和 PCR 技术 ；分子
检测技术包括 DNA（或 RNA）序列分析、片段分析，
单链构象多态性 （SSCP）、变性梯度 （DGGE），温度
梯度凝胶电泳 （TGGE）、变性高效液相色谱 （DHP-
LC）。 同时，由于现代生物信息学的发展，使蛋白质
技术（直接研究基因的表达产物）的使用成为可能
（图 1） [4，5]。
2 分子生物学研究方法在生物修复中的应用
生物修复是一项利用微生物代谢潜力来修复
被污染环境的技术。其重要的特点是它包含了很多
复杂的微生物种群和群落，有些种群从中起到关键
性的作用，所以深入的了解污染区域中的微生物生
态对于提高生物修复的效果有着非常重要的意义。
而分子生态学作为一个强有力的工具可以提高工
作的效率和效果，在农药、石油烃、多环芳烃以及重
金属等修复中应用都非常广泛 [6]。
2.1 标记核酸探针杂交技术
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，
FISH）是将基因探针用荧光染料标记，再使之与固
定在载玻片上的微生物样品杂交，将未杂交的荧光
探针洗去后用普通荧光显微镜或是共聚焦激光扫
描显微镜进行观察和摄像。采用这一技术可以同时
对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性
定量分析和空间位置标示。荧光原位杂交技术广泛
用于分析复杂环境的微生物群落构成，可以在自然
生境中监测和鉴定微生物，并能对未被培养的微生
物进行检测 [7]。 rRNA 为靶序列寡核苷酸或 PNA（荧
光蛋白质-核苷酸特异探针原位杂交） 探针的荧光
原位杂交能提供微生物的形态学、数量、空间分布
等信息，现已成为环境科学研究领域中的热点技术 [8]。
Lanthier 等 [9]在降解 PCP 的 UASB 反应器内接种一
种脱氯细菌 PCP-1， 采用 FISH 测试经过生物强化
后形成的厌氧颗粒污泥微结构。真细菌和古细菌分
别采用探针 EUB338 和 ARC915 检测 ，PCP-1 用 3
个特异探针检测。 FISH 结果显示，古菌主要分布在
颗粒污泥内部，而最后阶段污泥表面会形成一层较
薄的 PCP-1 菌层，这种结构能够确保其他厌氧微生
物免受 PCP 毒作用。 Yang 等 [10]成功地应用 Dhe1259t
D.ethenogenes-195 的原位荧光探针对四氯乙烯 （P-
CE）降解菌 Dehalococcoides ethenogenes 在污染环境
中的存在性，分布以及丰度进行了监测。
核酸印迹杂交 （Blot hybridization）是从核酸混
合液中检测特定核酸分子的传统方法。其原理是双
链的核酸分子在某些理化因素作用下解开双链，而
在条件恢复后又可依碱基配对规律与探针形成双
链结构。 根据检测样品的不同又分为 DNA 印迹杂
交和 RNA 印迹杂交 。 在 16S rDNA/RNA 技术中最
常用到的是 RNA 印迹杂交。 Yoshifumi Shinoda 等 [11]
用 RNA 印迹杂交和实时定量反转录 PCR 分析甲
苯好氧和厌氧降解中两种关键酶产生基因（甲苯双
加氧酶 tod 基因和苯甲基合成酶 bss 基因） 的主要
诱导因素，结果显示，这两种基因都是由甲苯诱导
产生的，同时，tod 基因是在好氧条件下产生，而 bss
基因则是在好氧和厌氧条件下诱导产生的 。 RNA
印迹杂交还可以用来定量测得特定微生物种群
16S rRNA 在总 rRNA 中的比例。检测出的标记物的
量可以用来表示与探针结合的靶 rRNA 的量，特定
微生物 rRNA 的相对量可以用其探针信号与普适
探针信号的比值表示，并由此得到目标微生物在样
图 1 分子生态学种群研究流程图
许科伟等：分子生物学技术在生物修复中的应用研究进展 69
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
品中的丰度，但在生物修复中未见相关报道。
2.2 以 PCR 为基础的 rRNA 及 rDNA 分析技术
聚合酶链式反应（PCR）技术，是一种在体外模
拟天然 DNA 复制过程，快速扩增特异性 DNA 序列
的技术。 PCR 技术本身十分简单，可以将数量很少
的原始模板 DNA 分子进行倍增， 能在最大程度上
满足有关科学研究工作的需要。细菌核糖体小亚基
RNA 基因为所有的细菌共有， 且其与细菌整个基
因组的变化相比 ， 具有高度的保守性 。 通过 16S
rRNA 基因保守区引物进行 PCR 扩增是现在的一
个主要研究手段。PCR 技术可以研究某一特定环境
中微生物区系组成，进而了解种群动态，也可以研
究特定微生物种群的动态。 Kao[12]等利用 PCR 技术
扩增 PCP 降解菌的 16S rDNA， 确定其中优势菌种
为 P.mendocina NSYSU，利用 PCP 作为惟一碳源，为
利用土著菌或接种细菌原位或异位生物修复 PCP
污染土壤或水体提供了理论依据。Lloyda 等 [13]用 16S
rDNA 分析人工湿地中微生物硫酸盐还原机理 ，结
果表明，在试验开始 23 d 后，微生物群落中固氮菌
起占据的重要的生态位，溶解性氮成为了修复中的
主要限制性因素。
近年来，PCR 技术得到了迅速发展， 产生许多
衍生技术 ，包括逆转录 PCR （RT-PCR）、定量 PCR
（Quantitative PCR）、多重 PCR（Multiplex PCR）、嵌套
式 PCR[14]和原位 PCR 等 ，生物修复研究中应用比
较多的是以下几种。
逆转录 PCR（RT-PCR）是以 RNA 为模板，经逆
转录获得与 RNA 互补的 DNA 链即 cDNA， 然后以
cDNA 链为模板进行 PCR 扩增而获得目的基因或
检测基因表达，灵敏性大大提高。 例如，Cheng 等 [15]
运用 PCR 和 RT-PCR 技术成功地发现了两种高效
的聚乙烯合成酶基因 ElPKS1 和 ElPKS2，这两种基
因可以有效地提高微生物生物修复能力。
定量 PCR （Quantitative PCR）是在 PCR 定性技
术的基础上发展起来的核酸定量技术 。 因为单纯
PCR 所提供的定性结果不足以阐述许多问题的本
质，因此，对核酸进行定量检测也是 PCR 发展的趋
向之一。 包括最大可能数 PCR（MPN-PCR）和竞争
性定量 PCR（QC-PCR）。 Schwartz 等 [16]利用定量 PCR
（Quantitative PCR）对于菲降解细菌 Arthrob-
acter 在土壤混合种群环境下的生长情况做了定量
的测定 ： 该菌种数量从接种时的 5.55×105（cfu）g-1
增加到 100 h 后的 1.97×107（cfu）g-1，最大种群密度
在 150 h 后 ，最大降解速率达到之前达到 ，种群密
度在 56%菲矿化后保持恒定。 Baker 等 [17]用特异性
pMMO（颗粒性甲烷氧化酶基因片段 ）引物做竞争
性定量 PCR，来检测在三氯乙烯修复中起重要作用
的甲烷氧化菌群结构 ，结果表明，型甲烷氧化菌相
对于Ⅱ型甲烷氧化菌呈优势地位。
PCR 与分子标记和分子检测相结合的技术有
以下 3 种 ：（1）PCR-RFLP 方法 [18]是将 PCR 引物中
的一条加以荧光标记， 反应后用合适的限制酶切、
电泳分析，再根据片段的大小不同以及标记片段种
类和数量的不同分析群落的结构组成及功能多样
性，可以用来监测因环境改变而引起的微生物种群
的变化。 同时由于其灵敏性高和分析量大，也是一
个有竞争力的分析方法 。 Porteous 等 [19]运用 PCR-
MERFLP（多重）研究在生物修复中的有益菌 Pseud-
omonas，结果表明这种方法是非常有效的工具并充
实了环境中 Pseudomonas 的 rDNA 基因文库。 Stuart-
Kell 等 [20]通过对萘降解质粒进行 RFLP 分析 ，发现
这些降解质粒之间非常接近，从而证明萘降解质粒
的转移在微生物群落适应污染环境中具有重要作
用 ； （2）PCR-SSCP 方法原本用于临床鉴定基因突
变， 近年来被应用到微生物生态学研究中 。 单链
DNA 片段呈复杂的空间折叠构象， 这种立体结构
主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来
维持的。 当有一个碱基发生改变时，会或多或少地
影响其空间构象，使构象发生改变。 空间构象有差
异的单链 DNA 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大
小不同， 可通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
敏锐地将构象上有差异的分子分离开。Pohler1 等 [21]
的生物修复实验基于 16S rRNA 扩增 ， 运用 SCCP
指纹技术对酸性采矿湖围隔中总细菌和硫酸盐还
原细菌 （SRB） 群落结构和动态进行了成功监测；
（3） PCR-RAPD 方法是由 Williams 发展起来的随机
扩增多态性 DNA 分子遗传标记技术， 能快速进行
基因多态性研究，并且由于不涉及印迹杂交、放射
性自显影等技术，因此简便易行。姚健等 [22]用 RAPD
方法分析了农药严重污染对土壤微生物群落的
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2009年第 2期
DNA 序列多样性的影响，用 14 个随机引物扩增出
共 95 个可靠的片段，经过对 DNA 序列多态性的分
析和 DNA 丰度、修饰丰度 、Shannon-Weaver 指数和
相似性系数的计算， 结合土壤微生物量的测定，结
果表明化学农药可在 DNA 水平上影响微生物多态
性。
2.3 DNA 扩增片段电泳检测技术
DNA 分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水
作用共同作用的结果。 温度、有机溶剂和 pH 等因
素可以使氢键受到破坏 ， 导致双链变性为单链 。
DGGE 技术检测核酸序列是通过不同序列的 DNA
片段在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构
型的变化 ，导致电泳速度的急剧下降，最后在其相
应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可以在凝胶
上呈现为分散的条带。该技术可以分辨具有相同或
相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单
一碱基的变化和遗传多样性以及 PCR 扩增 DNA
片段的多态性。 TGGE 技术的基本原理与 DGGE 技
术相似，含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈
线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离 PCR
产物及目的片段。 TGGE 技术与化学变性剂形成梯
度的 DGGE 技术相比，梯度形成更加便捷 ，重现性
更强。近来电泳检测技术已成为微生物生态中一个
重要的手段，它可以分析群落多样性、研究群落动
态、监测细菌富集和分离等 [23]。
Del Panno 等 [24]人使用 DGGE 技术测定一年内
土壤微宇宙中微生物群落在生物修复过程中质量
和数量的变化，得出受污染土壤中的微生物群落结
构与受控条件下的有较大不同，并判断其结构与接
种污泥的量有关 。 Kazunari Sei 等 [25]用 PCR-DGGE
来研究海水受芳香化合物污染后， 降解苯酚类，水
杨酸盐等微生物的群落行为及其整个群落结构的
变化，监测的效果表明，用此方法可以说明这些细
菌种群的行为特性，也可以用来估计微生物生态系
统的修复效果。Fantroussi 等 [26]提取了使用 3 种除草
剂的土壤微生物的总 DNA， 通过通用引物 PCR 扩
增了 16S rDNA 基因， 然后用 DGGE 分析 4 种不同
土壤的微生物的群落结构的变化，通过统计 DGGE
条带分析了 4 种土壤群落的相似性， 并通过测序，
发现一种至今未被培养的类群 。 Eichner 等 [27]成功
地运用 TTGE 分析经过扩增的 16S rRNA，测定由于
受到苯酚严重污染高度复杂的活性污泥生态系统
的结构变化。
2.4 耦合技术
由以上的很多应用来看，许多技术是联合使用
的。 另外，由于使用 PCR 扩增技术一般不能准确反
映微生物的量（除定量 PCR），引物的设计方法和数
据库对某些微生物还是很不完善的，在实际应用和
结果的分析上也较其它方法有一定的难度 [28]。 可以
把现在比较流行磷脂脂肪酸分析法（PLFA） [23]、细胞
甲基脂肪酸脂（FAME）图谱分析、醌类图谱分析法
等结合起来， 更好地区别和鉴定不同的微生物种
类，在环境微生物生态的测定中将得到越来越广泛
的重视和应用。
Wagner-Dobler 等 [29]采用 FAME 图谱分析 、16S
rDNA 的序列比较 、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳等方
法，将苯降解菌主要类群归为 Rhodococcus，其他还
有 Alcaligenes、Terrabacter 等 。 Kurisu [30]等在高温接
触氧化过程中采用 PCR-DGGE 法，用 FISH 法及醌
类图谱法同时分析来研究微生物的群体结构，得到
MK-7 为这一处理系统的优势醌类种类。含有 MK-7
的微生物包括 δ 及 ε 变形杆菌、 黄杆菌/ 噬纤维菌
群和（G+C）含量低的革兰氏阳性菌如 Bacillus spp。
而 FISH 的结果表明 ，Bacillus lentus 和 B.thermoclo-
acae 占有很大的比例，在不同的温度下微生物群体
主要由 Bacillaceae 及兼性高温和中温杆菌组成。
3 结语
微生物分子生态学技术已经越来越多地应用
于生物修复研究和应用中 ， 提高了生物修复的效
果，增强了目的性，同时还可以用于评估修复过程
中生态系统的健康程度 [31]。 相对于传统的生物培养
技术等，它具有快速、灵敏、精确等优点，更重要的
是，基于这些技术 ，可以跟踪某些基因工程菌的扩
散和迁移，有利于提高修复的生态安全性。 有理由
相信，在不久的将来，它必将成为生物修复中的一
个强有力的工具，发挥越来越大的作用。
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