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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
谷子弯孢菌海藻糖酶基因(ClTRE)及其
启动子的克隆和序列分析
谢夏青1 李志勇2 马继芳2 刘磊2 董志平2 董金皋3
(1南京农业大学生命科学学院，南京 210095;2河北省农林科学院谷子研究所，石家庄 050031;
3河北农业大学生命科学学院，保定 071001)
摘 要: 海藻糖代谢调控真菌生长、发育及致病性，为了进一步研究海藻糖代谢在谷子弯孢病菌中的功能，对海藻糖酶
基因及其启动子进行了克隆。根据植物病原真菌海藻糖酶基因的保守序列设计简并引物，扩增得到海藻糖酶基因同源序列。
通过 RACE 技术，首次在谷子弯孢病菌中克隆得到了海藻糖酶基因(ClTRE)全长 cDNA 序列。序列分析表明，该基因最大开
放阅读框为 2 037 bp，编码 679 个氨基酸;二级结构预测表明，该蛋白含约 40. 48%的 α 螺旋，12. 99%的延伸串，6. 5%的 β 转
角，40. 03%的不规则卷曲;蛋白保守结构域分析发现其含有海藻糖酶特有的保守位点，与其他植物病原真菌中海藻糖酶基因
有 51% －86%同源性;利用 SignalP3. 0 软件预测谷子弯孢海藻糖酶蛋白具有信号肽。通过染色体步移技术克隆得到其上游
启动子序列，利用 TFSEARCH软件分析含有多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件，初步推测该基因与逆境胁迫相关。谷子弯
孢病菌 ClTRE基因及其启动子的克隆，为进一步研究该基因在病菌致病中作用以及以该基因为靶位点的化学防控奠定基础。
关键词: 谷子弯孢病菌 海藻糖酶 基因克隆 染色体步移 生物信息学
Cloning and Sequence Analysis of ClTRE Gene in Cochliobolus lunatus
Xie Xiaqing1 Li Zhiyong2 Ma Jifang2 Liu Lei2 Dong Zhiping2 Dong Jingao3
(1College of Life Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095;2Millet Institute of Agricultural Academy of Hebei Province，
Shijiazhuang 050031;3 College of Life Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001)
Abstract: Trehalose metabolism regulate development，growth and pathogenicity in fungus． The rehalase gene and its promoter
were cloned in order to study trehalose metabolism in Cochliobolus lunatus． Using degenerated primer and RACE method，the complete
cDNA sequence of trehalase gene was isolated from Cochliobolus lunatus which was designated as ClTRE． The largest open reading
frame is 2 037 bp encoding a predicted protein of 679 amino acid residuces． The predicted secondary structure composition for the pro-
tein has about 40. 48% alpha helixes，6. 5% beta turn，12. 99% extended strand and 40. 03% random coil． Protein alignment analysis
showed ClTRE had trehalase specific signature and 51% － 86% homology with trehalase gene of other fungi． The ClTRE protein had
signal peptide through the analysis of SignalP3. 0 result． The promoter of ClTRE was cloned by genomic walking method，and sequence
analysis showed it contained several stress response element，which may implicate in the response to a variety of biotic and abiotic stres-
ses． The cloning of the ClTRE gene and its promoter would lay a foundation for further functional study which may benefit the chemical
control of C． lunatus as trehalase might be an new target for designing pesticide．
Key words: Cochliobolus lunatus Trehalase Gene clone Genomic walking Bioinformatics
收稿日期:2011-04-13
基金项目:国家自然科学基金项目(30771354) ，河北省自然科学基金项目(C2004000699)
作者简介:谢夏青，本科，专业:生物学;E-mail:1048440330@ qq． com;李志勇为并列第一作者
通讯作者:董志平，女，研究员，研究方向:谷子病害，E-mail:dzping001@ 163． com;董金皋，男，教授，研究方向:分子植物病理学，E-mail:shmdjg@
hebau． edu． cn
海藻糖(trehalose)是一种非还原性二糖，广泛
分布于细菌、酵母、丝状真菌和植物中［1 － 4］，虽然海
藻糖合成途径具有多样性，但在真菌中海藻糖的分
解是以唯一的海藻糖酶(trehalase)的水解来实现
2011 年第 7 期 谢夏青等:谷子弯孢菌海藻糖酶基因(ClTRE)及其启动子的克隆和序列分析
的，因此在真菌代谢循环中起关键作用，而哺乳动
物无此代谢途径，因而可以以真菌海藻糖酶为靶
位点设计杀菌剂，这类农药因对非靶标生物(人、
动物)无毒害而备受青睐。如井冈霉素广泛用于
禾本科作物纹枯病的防治，其主要成分井冈羟胺 A
即为海藻糖酶抑制剂，井冈霉素具有药效高、生物
安全性高等特点［5，6］。此外，国外也对该基因功能
进行了系列研究，如在稻瘟病菌(Magnaporthe
grisea)中，NTH1 基因编码一个中性海藻糖酶，该
基因突变体由于在寄主组织内扩展能力降低，而
使致病力下降［7］。灰葡萄孢海藻糖酶基因与致病
性无关，但与孢子对热耐受能力有关，并且该基因
调控孢子萌发率，海藻糖酶基因缺失突变体孢子
萌发率下降［8］。利用基因敲除技术获得构巢曲霉
(Aspergillus nidulans)中性海藻糖酶突变体，发现突
变体要比野生型耐热能力提高 5 － 10 倍［9］。根内
球囊霉(Glomus intraradices)的中性海藻糖酶
(GINTH1)基因与该菌受到热胁迫后恢复到常态
能力相关［10］。
谷子弯孢病菌(Cochliobolus lunatus)是谷子叶
片上的一种重要丝状病原真菌，病害流行年份常造
成较大损失。为研究海藻糖代谢在谷子弯孢病菌致
病中的作用，我们克隆了一个编码海藻糖酶基
因———ClTRE基因，并对其进行序列分析，为下一步
研究该基因功能及以该基因为靶位点的化学农药防
控奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 菌株与试剂
谷子弯孢病菌(C． lunatus)和大肠杆菌(Es-
chrichia coli)菌株 JM109 由河北省农科院谷子研究
所植保室保存。Reverse Transcriptase M-MLV，3-
Full RACE Core Set(宝生物工程大连有限公司) ;
SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech 公
司)。
1. 2 谷子弯孢病菌 ClTRE基因的克隆
1. 2. 1 引物设计、病菌基因组 DNA 和总 RNA 的
提取及第一链 cDNA 的合成 根据已知的小麦颖
枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、小麦黄斑叶枯病菌
(Pyrenophora tritici)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、
高梁炭疽病菌(Glomerella graminicola)和粗糙脉孢
霉(Neurospora crassa)5 种病原真菌海藻糖酶基因氨
基酸序列的保守区域 FVVAGGR和 NGVLIWA 设计 1
对寡核苷酸简并引物。引物序列为 Tre1:5-TTYGTB-
GTRGCWGGWGGWCG-3;Tre2:5-CCCARATCARCAC-
DCCATTC -3。
分别采用 CTAB法和 Trizol 法提取病菌的基因
组 DNA和总 RNA，并用 M-MLV 反转录酶合成第一
链 cDNA。
1. 2. 2 谷子弯孢病菌海藻糖酶基因(ClTRE)cDNA
同源片段的克隆 以合成的第一链 cDNA 为模板，
利用简并引物 Tre1 和 Tre2 扩增谷子弯孢 ClTRE 基
因同源片段。采用 25 μL反应体系，PCR反应程序:
95℃ 5 min，94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，35
个循环;72℃ 10 min。1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测扩
增结果。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收
目的条带。将回收产物与 pMD19-T 载体连接过夜，
通过热激法转化到大肠杆菌感受态细胞 JM109，涂
板培养过夜，通过菌落 PCR法筛选阳性克隆并送到
上海生工生物公司测序。利用网上在线 BLAST 软
件，对所获得的序列进行同源性分析。
1. 2. 3 RACE 技术获得 ClTRE 基因 cDNA 全序列
根据所克隆得到的 ClTRE 基因同源片段的 cDNA
序列设计特异性引物，即 Cltre-3:5-CCCAACTCT-
GAAGGCAACGGGACGA-3和 Cltre-5:5-CATTTGG-
GTGAGAAGCGGTGGTTGG-3，分别用于 3RACE 扩
增和 5RACE扩增。按照 SMART RACE cDNA Am-
plification试剂盒说明进行扩增。将克隆得到的基
因片段两端序列与 ClTRE 基因同源片段进行拼接，
拼接后便得到了谷子弯孢海藻糖酶 cDNA 全长
序列。
1. 2. 4 Genome Walking技术获得 5端启动子序列
利用平末端限制性内切酶消化基因组 DNA:
Dra I、Pvu II、Sma I、EcoR V、Swa I酶切过夜后纯化。
取等 量 的 接 头 I (5-GTAATACGACTCACTATAG-
GGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3)、 II
(3-H2N-CCCGACCA-PO4-5) (50 μmol /L) ，80℃反
应 10 min，25℃反应 30 min。按照 Adaptor 3. 8 μL、
T4连接酶 0. 3 μL、T4连接酶 buffer 2 μL、DNA 3. 9
μL体系配制反应液，16℃连接过夜，70℃灭活 5
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
min，加入 1 × TE稀释 10 倍后用于扩增。利用接头
互补的引物 AP1:5- GTAATACGACTCACTATAGGGC-
3及基因特异引物 ClTRE-W 5-GTCGCAAGGAG-
CAATTACGCTGCCA -3扩增，按照常规体系配制反
应液，用宝生物 LA-Taq聚合酶进行 PCR 扩增:94℃
25 s，72℃ 4 min，7 个循环;94℃ 25 s，67℃ 4 min，32
个循环;67℃ 4 min。电泳检测每个接头扩增的产
物，并回收测序。
1. 3 ClTRE基因结构及预测蛋白的生物信息学分析
根据 http:/ /ncbi． nlm． nih． gov /http:/ / cn． Ex-
pasy． org及 http:/ / softberry． com /等网站提供的生物
信息学软件进行在线分析。用 SOPMA 软件分析蛋
白质二级结构;用 ScanPrositet软件分析蛋白的特定
结构域;用 SignalP3． 0 软件对海藻糖酶信号肽进行
预测，应用在线启动子分析软件 TFSEARCH 对 5非
翻译区进行生物信息学分析;氨基酸序列同源比对
用 DNAMAN 5. 0 软件完成。
2 结果和分析
2. 1 谷子弯孢病菌 ClTRE 基因 cDNA 全长序列的
克隆
利用简并引物 Tre1 和 Tre2 对谷子弯孢病菌
cDNA进行 PCR 扩增，获得一条 1 371 bp 的条带。
以合成的谷子弯孢病菌病菌 3末端和 5末端 cDNA
为模板，进行 3RACE和 5RACE扩增。经 1. 2%的
琼脂糖凝胶电泳检测获得的条带大小分别为 748 bp
和 623 bp(图 1)。将所获得的 3末端和 5末端 cD-
NA序列进行拼接，应用 NCBI 的 ORF finder 软件对
该 cDNA序列进行开放阅读框(ORF)分析，发现有
1 个全长 2 037 bp、编码 679 个氨基酸的 ORF。利用
1. 3RACE PCR产物;2. 5RACE PCR 产物;3．同源片段
PCR产物
图 1 谷子弯孢 ClTRE基因扩增结果
BLASTX 软件与 GenBank中已知蛋白进行同源性分
析，发现该开放阅读框所编码的氨基酸序列与许多
真菌如小麦颖枯病菌(P． nodorum)、小麦黄斑叶枯
病菌(P． tritici)和稻瘟病菌(M． grisea)等的海藻糖
酶基因的相似性为 51% － 86%。因此，初步推测该
序列为谷子弯孢病菌海藻糖基因，把克隆得到谷子
弯孢病菌海藻糖基因的提交到 GenBank，序列登录
号为 HQ910234。
2. 2 谷子弯孢病菌 ClTRE 基因结构及生物信息学
分析
根据 http:/ /ncbi． nlm． nih． gov /http:/ / cn． Ex-
pasy． org及 http:/ / softberry． com /等网站提供的生物
信息学软件进行在线分析，ClTRE 基因编码 679 个
氨基酸，相对分子量为 7 5198. 7 u ，等电点(pI)为
4. 65，为酸性蛋白。通过与稻瘟病菌海藻糖酶
(MgTRE)和粗糙脉孢霉海藻糖酶(NcTRE)蛋白多
重比对(图 2) ，发现谷子弯孢海藻糖酶蛋白同样具
有海藻糖酶特有的保守位点 1(G-G-R-F-x-E-x-Y-x-
W-D)和保守位点 2(Q-W-D-x-P-x-x-W-［PAS］-P)。
在 NCBI上进行蛋白保守结构域分析，结果(图
3)表明谷子弯孢海藻糖酶蛋白具有海藻糖酶保守
结构域。运用 SOPMA 软件(http:/ /pbil． ibcp． fr /)
预测谷子弯孢 ClTRE 蛋白的二级结构(图 4) ，表明
该蛋白含约 40. 48%的 α 螺旋，12. 99%的延伸串，
6. 5%的 β转角，40. 03%的不规则卷曲。利用 Sig-
nalP3. 0 软件分析谷子弯孢海藻糖酶具有信号肽，在
第 1 个氨基酸到第 32 个氨基酸(MALLRSLAIAL-
VAAAPLANALYINGSVIAPCD)之间。每个氨基酸对
应 1 个 S值，信号肽区域的 S值较高，从图 5 可以看
出，从谷子弯孢海藻糖酶蛋白氮端开始 S 值逐渐变
小，32 个氨基酸后接近于零。每个氨基酸会有 1 个
C值，在剪切位点处 C值是最高的，从图 5 中可知在
第 20 个和第 21 个氨基酸之间数值最高，表明在这
两个氨基酸间剪切。
2. 3 ClTRE 基因启动子区的克隆及生物信息学
分析
染色体步移法扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检
测，结果表明由 Dra I、Pvu II、Sma I、EcoR V和 Swa I
酶切基因组 DNA构建的文库作为模板，扩增分别得
到约 0. 75、1. 6、1. 0、1. 3 和 0. 8 kb的条带(图 6) ，测
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星号位置(★)为海藻糖酶保守位点
图 2 谷子弯孢 ClTRE基因与其他真菌海藻糖酶蛋白同源性比对
图 3 谷子弯孢 ClTRE基因预测蛋白的保守结构域分析
坚线由长至短依次代表 α螺旋，延伸串，β转角，不规则卷曲
图 4 谷子弯孢 ClTRE蛋白二级结构的预测
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图 5 谷子弯孢 ClTRE蛋白信号肽的预测
图 6 谷子弯孢 ClTRE基因启动子扩增
序及拼接结果表明，这些片段与 ClTRE 基因 5端有
97 bp重叠区，说明这些产物为 ClTRE基因 5端上游
序列。把克隆得到谷子弯孢病菌海藻糖基因启动子
的序列提交到 GenBank，序列登录号为 JF260982。利
用 TFSEARCH启动子网站中分析 ClTRE基因上游调
控元件，发现其含有明显的启动子结构。在1 591 bp
的上游侧翼序列中发现多处 TATA-box(－445、
－ 823、－ 980 和 － 1 092)及 CAAT － box(－ 123、－
268、－ 904、－ 989、－ 1 079、－ 1 165 和 － 1 454)。
此外，在 ClTRE基因启动子序列中还发现了热激转
录因子(HSF)结合元件(－ 6、－ 255、－ 427、－ 566、
－ 680、－ 1 104、－ 1 189、－ 1 440 和 － 1 539)和压力
反应元件 STREs(－ 359)、GCN4 转录因子的结合元
件(－ 1 536)、ADR1 转录因子的结合元件(－ 354)
以及 GCR1 转录因子的结合元件(－ 1 211)。
3 讨论
利用保守结构域设计简并引物并通过 RACE技
术获得基因全长是目前克隆未知基因应用最广泛、
最快速、最有效的方法之一。该技术可以一步
PCR扩增获得已知基因片段 cDNA全长序列，并且
以 cDNA为模板扩增，可以降低一些非表达基因的
干扰。与筛选基因文库相比，RACE 技术具有简
单、快速和经济的优点。但是 RACE 技术只能获
取基因起始密码子上游一部分序列，不能获得完
整启动子序列，而真菌启动子顺式作用元件预测
及同源重组载体的构建均需要较为完整的启动子
序列。目前克隆启动子常用方法有反向 PCR、随
机 PCR扩增及基于连接接头的染色体步移方法。
前两种方法效率较低，假阳性较高;而染色体步移
方法在启动子克隆中广泛应用［11］，利用此方法克
隆到谷子弯孢海藻糖酶基因启动子序列，在构建
的 5 个接头文库中都可以扩增出目的条带，并且
均拼接成功，表明在谷子弯孢菌中染色体步移方
法扩增启动子效率较高。
谷子弯孢病菌海藻糖酶启动子区中发现 5 处
TATA-box，但是与转录起始位点离的较远，最近的
距离转录起始位点 445 bp，而真核生物基因启动子
TATA-box常在转录起始位点上游的 75 bp 位置出
现，是否这些位置的变化影响海藻糖酶转录活性有
待进一步研究。启动子区存在 9 个热激转录因子
(HSF)的结合元件，推测其在逆境胁迫中起作用，对
真菌的耐热性和抗逆性具有重要意义［12］。启动子
区中发现 1 个 Adr1 转录因子结合位点，Adr1 调控
真菌的乙醇、甘油及脂类代谢，而弯孢病菌海藻糖酶
也可能受到 Adr1 转录因子调控，可以推测谷子弯孢
病菌海藻糖、甘油及脂类代谢途径有可能存在反馈
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2011 年第 7 期 谢夏青等:谷子弯孢菌海藻糖酶基因(ClTRE)及其启动子的克隆和序列分析
和互作［13］。启动子区 359 bp 处存在压力反应元件
STREs(Stress responsive element CCCCT) ，在热激及
渗透胁迫下，Msn2 /Msn4 转录因子通过与 STREs 反
应元件结合，而调控海藻糖酶基因表达，从而使病菌
应对胁迫［14］。
通过 SOPMA 软件预测可知，海藻糖酶基因编
码的蛋白主要由 α螺旋和不规则卷曲构成，而 β-转
角和延伸链则散布于整个蛋白质中。一般认为 α
螺旋和 β 折叠结构规则，有氢键维持，不易变形，主
要起稳定蛋白质分子结构的作用，伸展结构和无规
则卷曲往往突出于蛋白表面，构成蛋白质的功能
区域。
目前，植物病原真菌海藻糖酶基因在国内研究
尚少。因此，谷子弯孢病菌海藻糖酶基因的成功克
隆对研究该基因在病菌生长发育及致病过程，进而
为以海藻糖酶为靶位点的化学防控研究奠定基础。
参 考 文 献
［1］杨平，李敏惠，潘克俭，等．海藻糖的生物合成与分解途径及其生
物学功能．生命的化学，2006，26(3) :233-236．
［2］Gancedo C，Flores CL． The importance of a functional trehalose bio-
synthetic pathway for the life of yeast and fungi． FEMS Yeast Re-
search，2004，(4) :351-359．
［3］Purvis JE，Yomano LP，Ingram LO． Enhanced trehalose production
improves growth of Escherichia coli under osmotic stress． Appl Envi-
ron Microbiol，2005，71(7) :3761-3769．
［4］Barbara WM，Eliza M，Wanda M． Properties of trehalase from differ-
ent organs of alfalfa，Medicago sativa． Acta Physio Plant，2005，27
(1) :53-60．
［5］范柯琴，金利群，郑裕国．海藻糖酶的酶学特征及其作为新农药
靶标的开发应用．化学与生物工程，2009，26(4) :7-11．
［6］俞建忠，吴庆安，许丹倩．海藻糖酶抑制剂井冈羟胺 A 的制备与
表征．农药，2006，5(7) :448-449．
［7］Andrew JF，Joanna MJ，Nicholas JT． Trehalose synthesis and metabo-
lism are required at different stages of plant infection by Magnaporthe
grisea． EMBO，2003，22(2) :225-235．
［8］Gunther D，Patrick B，Matthias H． Trehalose metabolism is important
for heat stress tolerance and spore germination of Botrytis cinerea． Mi-
crobiology，2006，152:2625-2634．
［9］Fillinger S，Chaveroche MK，van Dijck P，et al． Trehalose is required
for the acquisition of tolerance to a variety of stress in the filamentous
fungus Aspergillus nidulans． Microbiology，2001，147:1851-1862．
［10］Aurora O，Rudiger H，Natalia R． Trehalose turnover during abiotic
stress in arbuscular mycorrhizal fungi． New Phytologist，2007，174:
879-891．
［11］Xu P，Hu R Y，Ding XY． Optimized adaptor polymerase chain reac-
tion method for efficient genomic walking． Acta Biochimica Bio-
physica Sinica，2006，38(8) :571-576．
［12］李志勇，郝志敏，董志平，等．玉米大斑病菌钙调磷酸酶 A亚基
的克隆与特征分析．遗传，2009，31 (10) :1059-1064．
［13］ Salazar M，Vongsangnak W，Panagiotou G，et al． Uncovering tran-
scriptional regulation of glycerol metabolism in Aspergilli through
genome-wide gene expression data． Molecular Genetics and Genom-
ics，2009，282 (6) :571-586．
［14］Zahringer H，Thevelein JM，Nwaka S． Induction of neutral trehalase
Nth1 by heat and osmotic stress is controlled by STRE elements and
Msn2 /Msn4 transcription factor:variations of PKA effect during
stress and growth． Molecular Microbiology，2000，35:397-406．
(责任编辑 狄艳红)
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