全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
甘蓝型油菜γ2TM T基因的克隆及其
植物表达载体的构建
陈明训　王中　蒋立希
(浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所 ,杭州 310029)
　　摘 　要 : 　应用聚合酶链式反应技术 ( PCR)扩增了甘蓝型油菜γ2TM T基因 ,并将其克隆到 pMD182T vector载体上 ,对重
组子进行 PCR检测和限制性内切酶分析 ,并测定了 DNA全序列。结果表明 ,克隆片段全长为 1 044 bp。将甘蓝型油菜γ2TM T
基因定向克隆到植物表达载体 pCambia1300的 35S启动子下游 ,构建了该基因的植物超表达载体。
关键词 : 　油菜 　PCR　克隆 　植物表达载体
Clon ing and Construction of Plant Over2expression Vector Conta in ing
γ2TM T Gene in B rassica napus
Chen M ingxun　W ang Zhong　J iang L ixi
( Institu te of Crop Science, College of Agriculture and B io2technology, Zhejiang University, Hangzhou 310029)
　　Abs trac t: 　γ2TM T Gene in B rassica napus was obtained by PCR technique and cloned into pMD182Tvector. The recombinant
clone was detected by PCR technique and analyzed by the restriction enzyme. A full length of cDNA gene was sequenced. The results
showed that the length of the clone sequence was 1 044 bp.γ2TM T gene in B rassica napus was cloned into 35S p romoter downstream of
p lant over2exp ression vector pCambia1300 in orientation.
Key wo rds: 　 B rassica napus　PCR　Clone　Plant over2exp ression vector
收稿日期 : 2009205205
作者简介 :陈明训 (19842) ,男 ,在读博士 ,研究方向 :植物功能基因组学 ; E2mail: m ingxunchen257@yahoo. com. cn
通讯作者 :蒋立希 (19642) ,男 ,教授 ,博导 ,研究方向 :植物功能基因组学 ; E2mail: jianglx@ zju. edu. cn
　　天然维生素 E (VE )是苯并二氢呋喃的衍生物 ,
又称生育酚或生育三烯酚。天然维生素 E根据其
苯环上甲基的数量和位置 ,可分为α型、β型、γ型
和δ型 4种 ,其抗氧化能力以α型生育酚最强 ,依次
为β型、γ型、δ型 [ 1 ]。
天然维生素 E是一种人体所必需的脂溶性维生
素 ,为透明淡黄色粘稠油状物 ,易溶于有机溶剂 ,不溶
于水。天然维生素 E耐高温和酸碱氢化过程 ,但极易
被氧化 ,紫外线照射可使其降解。由于其极易被氧
化 ,所以常被用作氧化剂 ,可以保护其他易被氧化的
物质不受破坏。试验表明 ,天然维生素 E不但能有效
预防人体多种疾病 ,如癌症 ,糖尿病 ,肝脏疾病 ,白内
障等 ,而且能够延缓人体衰老 ,调节人体免疫能力。因
此 ,维生素 E被广泛用于医药产品和功能性食品 [2 ]。
在高等植物的根、叶、果实和种子中都有天然维
生素 E的存在。在大多数植物组织中 ,维生素 E的
主要成分为α型生育酚 ,而在种子中 ,γ类型生育酚
是主要类型 [ 3 ]。因此 ,人类食用的生育酚主要成分
就是γ类型的生育酚 [ 4 ]。α型生育酚的活性大约是
γ类型生育酚的 10倍 ,因此 ,富含α型生育酚食物
的营养价值将比富含γ类型生育酚的营养价值高。
并且 ,有研究表明α型生育酚是血液能够转运到所
需细胞的惟一一种维生素 E的类型 [ 1 ]。
γ2TMT(γ2tocopherol methyltransferase)的功能是
在维生素 E合成的最后一步将γ类型转化成α型
生育酚 [ 5 ]。最新的研究表明 ,维生素 E对植物抗逆
方面也有影响 ,如 Maeda等 [ 6 ]研究发现 ,天然维生
素 E能够增强植物对低温的适应性 ;天然维生素 E
在细胞内信号转导和基因调控方面起着重要作用。
例如 ,生育酚可通过调节叶中茉莉酸含量影响植物
2009年第 10期 陈明训等 :甘蓝型油菜γ2TM T基因的克隆及其植物表达载体的构建
的发育和胁迫响应 [ 7, 8 ]。油菜为我国主要的油料作
物 ,油菜种子含油量 30% ～50% ,菜籽油不仅是良
好的食用油 ,而且在化工冶金机械食品工业上用途
广泛 ,是重要的化工原料 [ 9 ]。提高油菜种子中α型
维生素 E的成分将会提高菜籽油的价值 ,与此同
时 ,提高维生素 E活性可能在提高油菜的抗逆性等
方面也有重要作用。为此 ,利用油菜γ2TM T基因成
功构建了植物超表达载体 ,为通过提高种子中α型
维生素 E的成分而提高维生素 E的活性奠定了
基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
11111　菌种和质粒 　菌种为大肠杆菌菌株 DH5α;
双元质粒载体为 pCambia1300质粒 ; pMD182T vector
购自 TaKaRa公司。
11112　培养基 　LB培养基。
11113　酶及生化试剂 　高保真的 Taq酶 iProof
H igh2fidelity DNA Polymerase购自 B io2Rad公司 ,限
制性内切酶、T4 DNA 连接酶、RNA 提取试剂盒及
cDNA合成试剂盒购自 TaKaRa公司 ,其它试剂均为
国产分析纯试剂。
11114　引物 　引物由上海生工公司合成 ,在需要合
成的正向引物 FP和反向引物 RP前分别加有 X baⅠ
和 S acⅠ酶切位点序列。
112　方法
11211　RNA提取及 cDNA合成 　用 RNA提取试剂
盒提取油菜叶片的总 RNA,然后利用 cDNA合成试
剂盒合成 cDNA。
11212　PCR扩增 　人工合成引物为 FP: 5′2ATTTC
TAGATTTCTCCAACCAACCTCTCATT23′; RF: 5′2AT2
TGAGCTCCGTGCATCCACATTTCTCACG23′;在 20μl
的反应体系中 , dNTP各 014μl (各 200μM ) ,引物各
110μl (210μM) ,模板 cDNA 1μl, Taq酶 012μl, 10 ×
buffer 210μl,以 ddH2 O补足 20μl。PCR扩增条件 :
98℃预变性 30 s; 98℃变性 5 s, 50℃复性 20 s, 72℃延
伸 30 s, 30个循环 ; 72℃延伸 5 m in。
11213　PCR 产物的克隆、鉴定与序列分析 　将
PCR产物回收后 ,按 3∶1比例与克隆载体 pMD182T
vector连接。按 M aniatis[ 10 ]方法制备感受态细胞 ,
将连接产物转入到大肠杆菌 DH5α,并在附加 100
μg /m l的氨苄青霉素的 LB培养基上选择培养。挑
取白斑用碱裂解法提取质粒 DNA ,用 PCR方法检测
得到重组克隆 pMDTMT,其中插入约 111 kb的目的
片段。序列测序由上海生工公司完成。
11214　植物表达载体的构建 　将含有目的基因的
重组质粒 pMDTMT和 pCambia1300经 X baⅠ和 Sac
Ⅰ酶切 , T4 DNA连接酶连接 ,得到重组质粒 pCamT2
MT。转化大肠杆菌 DH5α,在含有 50μg/m l的卡那
霉素的 LB培养基上筛选重组子。提取阳性克隆的质
粒 ,经 PCR检测和酶切鉴定 ,得到重组克隆。
2　结果与分析
211　PCR扩增产物的克隆及筛选
PCR扩增产物在 110%的琼脂糖凝胶上电泳 ,
得到约 111 kb,特异性强、单一的扩增带 ,结果 (图
1)与预期一致。扩增产物回收后与载体连接转化
到大肠杆菌 DH5α中 ,筛选出 6个阳性克隆 ,经 PCR
检测 ,得到一条约 111 kb的插入片段 ,说明该目的基
因插入在载体上 ,其片段大小与预期一致 (图 2)。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
212　DNA序列分析
经过 DNA 全自动测序仪 ,测定得到的序列为
1 044 bp的目的片段与已发表的甘蓝型油菜γ2TM T基
因序列有 12个核苷酸的差异 ,同源性为 99% (图 3)。
图 3　目的片段的核苷酸序列
213　甘蓝型油菜γ2TM T植物表达载体的构建
将筛选的 6个阳性克隆 ,进一步酶切鉴定 ,电泳
图谱 (图 4,图 5) ,表明酶切片段大小与理论值一
致 ,说明目的片段插入的位置和方向都正确。
3　讨论与总结
根据已发表的序列设计 1对引物 ,利用优化的
PCR体系扩增出甘蓝型油菜γ2TM T基因序列测定
的结果表明 ,该基因片段全长 1 044 bp,与已发表的
该基因序列同源性为 99%。
将目的基因插入到 35S启动子下游 ,构建成表
达质粒 pCamTMT。经限制性内切酶酶切鉴定插入
方向和片段大小都正确 ,证明已成功构建了植物表
达载体。
在克隆了甘蓝型油菜γ2TM T基因的基础上 ,构
建了植物表达载体 ,为提高菜籽油中α型维生素 E
的含量 ,改善菜籽油的营养价值奠定了基础。近几
年 ,随着品质育种越来越被育种学家青睐 ,以及植物
转基因技术在创造新的基因型方面的独特优势 ,植
物转基因技术在农作物品质育种提高农作物的经济
价值和营养价值方面已成为传统育种技术的重要补
充和发展。Van Eenennaam等 [ 11 ]将拟南芥的γ2TM T
基因导人大豆基因组 ,使其在大豆种子中过量表达 ,
结果发现 ,γ2TM T基因的过量表达导致α型生育酚
的含量大大提高 , 维生素 E 的活性增加 5 倍。
A lison等 [ 12 ]在拟南芥种子中特异表达锌指蛋白转录
因子 ,发现可以增加γ2TM T基因的表达 ,从而提高
种子中α型生育酚的含量。Eun Ae Cho等 [ 3 ]将拟南
(下转第 108页 )
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
乙烯受体抑制剂 12MCP能够抑制冷藏苹果乙
烯的释放以及α2法尼烯的产生 ,并且显著抑制了虎
皮病的发生 [ 17, 18 ] ;而抗氧化剂 DPA是通过抑制α2
法尼烯的氧化来控制虎皮病的发生 [ 5 ] ,在实际应用
中人们常使用 210 g/L的 DPA和 1μl /L的 12MCP
处理果实 ,因此 ,在已有研究的基础上 ,首先研究了
这两个浓度处理的鸭梨果实中鸭梨法尼烯合成酶表
达以及α2法尼烯的释放。研究结果表明 , DPA推迟
而 12MCP抑制了低温冷藏的鸭梨果皮中 PFS基因
的表达和α2法尼烯的释放。
下一步工作将利用反义 RNA或 RNA i技术沉
默α2法尼烯合成酶基因 ,以达到控制α2法尼烯合成
的目的 ,进一步探讨虎皮病发生的根本原因 ,并期望
选育出耐虎皮病的鸭梨新品种。
参 考 文 献
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(上接第 104页 )
芥的γ2TM T基因在莴苣中超表达 ,发现γ2TM T基因
的表达量大大增加 ,α型生育酚的含量大大提高。
因此 ,利用γ2TM T基因改进维生素 E的成分 ,提高
维生素 E的活性 ,改善菜籽油中维生素 E的营养价
值 ,在油菜品质育种方面具有重要意义。
参 考 文 献
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