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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
重组 Hepcidin融合蛋白的氧化复性及活性鉴定
王继雯 1, 2  谢宝恩 1, 2  甄静1  周伏忠1  陈国参 2
( 1河南省微生物工程重点实验室,郑州 450008; 2河南省科学院生物研究所,郑州 450008 )
  摘  要:  将诱导表达的 H is
hepcid in融合蛋白包涵体通过固定化金属离子配体亲和层析 ( IMAC)柱分离纯化后, 在 cys

te ine/ cystine氧化还原体系中氧化形成二硫键,稀释复性后用肠激酶将融合蛋白的 h is
tag切除。酶切后所得的 H epc id in经抑
菌圈试验检验, 对枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌具有抗菌活性。
关键词:  H epcidin 纯化 氧化复性 抑菌圈
Oxidative Refolding and Biological Activity Detem ination of
RecombinantHepcidin Fusion Protein
W ang Jiw en
1, 2  X ie Baoen1, 2  Zhen J ing1  Zhou Fuzhong1  Chen Guocan2
(
1
K ey Laboratory of M icrob ial Engineer ing of H enan Province, Zhengzhou 450008;
2
Institute of BiologyH enan A cademy of Science, Zhengzhou 450008)
  Abstrac:t  A fter iso lation and pur ification w ith the IMAC co lum n, the H is
hepc id in fusion pro te in was ox id ized and rena turated
in cyste ine /cystine system to form d isu lfide bond. The h is
tag w as exc ised by enterok inase and the purity H epc id in pro tein w as up to
90% . Through aga r diffusion assay, the recom binant hepc id in d isp layed obv ious antibacter ia l ac tiv ity aga instG ram bacteria such as B.
subtilis and som e negative bacte ria.
Key words:  H epc id in Pur ification Ox idation refo ld ing Inhib ition zone
收稿日期: 2010
01
15
基金项目: 河南省高新领域重点攻关计划项目 ( 082102220002)
作者简介: 王继雯, 女, 硕士研究生, 主要从事农业微生物学的研究; E
m ai:l wangjiw en@ 163. com
通讯作者: 谢宝恩,副研究员, E
ma i:l xbaoen@ 163. com
Hepc id in是 2000年发现的一个主要在肝脏表
达的含有 8个半胱氨酸的小分子多肽 [ 1, 2] , 和许多
富含半胱氨酸的多肽类似, H epcidin具有显著的抗
菌作用。然而随后的研究表明, Hepc idin是机体铁
稳态调控途径中关键性的效应分子, 其主要生物学
功能在于调节小肠细胞对于铁的吸收 [ 3]。最近研
究表明, H epcidin很可能成为一种治疗机体铁代谢
相关性疾病重要靶分子, 而且其本身对于防止遗传
性血色病等铁负荷增多症具有重要的医疗应用。虽
然 Hepc id in可从尿液中获得, 但尿液 H epcidin质量
浓度仅为 10- 30 g /L, 采用基因工程方法制备 H ep

cidin将具有很大优势 [ 4]。
本实验室构建的抗菌肽 H epcid in融合表达载体
pET
hec,在大肠杆菌 BL21中表达为包涵体, 融合蛋
白 N端带有 6个组氨酸 [ 5] ,可通过金属螯合亲和层
析 IMAC ( immobilizedmeta l ion affinity chromatography
)对表达的融合蛋白进行初步纯化。天然 Hepcidin
分子内含有 8个半胱氨酸形成的 4对二硫键,因此可
以采用先氧化形成二硫键,再用肠激酶切除 6 H is

tag的方法制备 H epcidin单体。本研究对重组 H ep

cid in的纯化、氧化与复性条件进行了研究,并验证了
它的抗菌活性,为 Hepcidin的深入研究奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 菌株、质粒及试剂
H epcidin融合蛋白表达载体 pET
H ec及基因工
程菌株 BL2 l( pET
hec)为本实验室构建。用于抑菌
试验的大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、巴西固氮螺菌、枯
草芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌为本室保存。分子生
2010年第 5期 王继雯等:重组 H epc idin融合蛋白的氧化复性及活性鉴定
物学试剂购于宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司,肽分
子量标准蛋白购自北京索来宝生化公司, 重组肠激
酶购自上海欣百诺生物公司。
1. 2 Hepc id in蛋白的诱导表达
将 H epcidin表达载体 pET
hec转入 E. coli BL21
( DE3)中,得到能够正确表达出融合有 H is
tag标签
的 Hepc id in蛋白的 BL2l( pET
H ec)菌株, 将此菌株
在含 50
g /mL卡那霉素的 LB琼脂平板上 37! 培
养过夜,挑取单菌落接入 LB液体培养基中, 37! ,
250 r /m in振荡培养至OD600值为 06,加入 02 mmo l/
L IPTG,并将温度降至 25! 诱导表达 h is
H epc idin融
合蛋白 8 h。
1. 3 包涵体制备
将表达后的细胞离心收集, 悬于细胞裂解缓冲
液 ( 100 mmol /L N aC ,l 1 mmol /L PM SF, 1 mmo l /L
EDTA, 50mmo l/L T ris
HC,l pH80)中, 冰水浴超声
波破碎, 然后 12 000 r/m in离心 10 m in并收集沉
淀。离心分离的包涵体经 1%的 TritonX
100洗涤 2
次,去除表面粘附的杂蛋白和细胞碎片。将洗涤后
包涵体溶于的包涵体溶解液 ( 8 mo l/L 尿素, 35
mmo l /L 
巯基乙醇, 100 mmo l/L NaC ,l 50 mmo l /L
Tris
HC ,l pH 值 80)中, 12 000 r/m in离心 10 m in
后, - 20! 保存备用。
1. 4 包涵体纯化
用含 20mmo l/L咪唑的结合缓冲液 ( 8 mmo l /L
尿素, 500mmo l /L N aC ,l 20 mmo l/LPB, pH74)平衡
后,利用固定化金属离子配体亲和层析 ( IMAC )柱
分离蛋白,首先用 20mmol /L咪唑冲洗未结合的杂
蛋白, 然后分别用 300 mmo l /L、400 mmo l/L咪唑洗
脱目的蛋白,洗脱流量为 1 mL /m in, 分步收集各阶
段洗脱液。
1. 5 蛋白浓度测定
应用 Brad fo rd法测定蛋白质量浓度,即分别取
0、25、5、75、10、125、15、175、20
L牛血清
蛋白 BSA溶液 1 mg /mL于不同的离心管中, 各管
补加 1 PBS溶液至 200
L,在每管中各加入 2mL
考马斯亮蓝溶液 ( 5%乙醇, 85%磷酸, 001%考
马斯亮蓝 G
250) ,室温反应 2 m in后于 595 nm测
定吸光值,并绘制标准曲线。
1. 6 Tr ic ine
SDS
PAGE电泳
将测定蛋白含量较高的收集液进行 165%
Tric ine
SDS
PAGE电泳分析, 上样后 30 V 电泳
60m in,然后 120V恒压电泳直至溴酚蓝指示剂电泳
到玻璃板的底部,当染色剂全部跑入电极缓冲液中时
停止电泳,凝胶采用考马斯亮蓝 R
250染色脱色。
1. 7 融合蛋白的氧化复性
将用 IMAC柱纯化所得的 H is
hepcidin融合蛋
白用氧化缓冲液 ( 3 mo l/L尿素 , 2 mmol /L半胱氨酸
01mmol /L胱氨酸, 25 mmol /L Tris
HC,l pH80)稀
释至终浓度 50
g /mL,在室温条件下温和搅拌 60 h,
氧化形成二硫键, 4! 透析过夜后, 用 PEG20000浓缩。
而后,用复性缓冲 A ( 4mo l/L尿素, 100mmol /L NaC ,l
25mmo l/L Tris
HC,l pH83)将蛋白浓度调整为 100
mg / mL,在 10 h内用复性缓冲 B( 100 mmo l/L NaC ,l
25mmol /L Tris
HC,l pH83)连续稀释到 50
g / mL,
复性蛋白用 PEG20000浓缩至原体积的 2- 3倍。
1. 8 酶切反应
将已复性的蛋白中加入 1 mmo l/L的 CaC l2和
01% Tween20后, 以 10 U /mg蛋白的比例加入重
组肠激酶进行酶切反应, 37! 反应 16 h, 切除 6
H is
tag。
1. 9 抑菌活性鉴定
用琼脂孔穴扩散法检验重组 Hepc id in的抗菌
活性 [ 6]。分别取处于对数生长期的大肠杆菌、地衣
芽孢杆菌、巴西固氮螺菌、枯草芽孢杆菌和沼泽红假
单胞菌悬液 100
L均匀涂布于 LB琼脂平板上, 用
高压灭菌过的打孔器在平板上打孔,滴加 50
L待
检重组 H epcid in酶切产物, 同时以吸收 50
L灭菌
PBS水作为阴性对照。平板于 37! 培养 8 h, 观察
抑菌圈生成情况。
2 结果
2. 1 蛋白表达与包涵体的制备
载体 Pet
H ec在大肠杆菌 BL21DE3经 IPTG诱
导后表达出相对分子质量为 107 kD的融合蛋白
(图 1), 表达的融合蛋白约为细胞总蛋白的 25%。
2. 2 融合蛋白的镍柱亲和层析纯化
蛋白浓度测定标准曲线见图 2, 融合蛋白的镍
柱亲和层析纯化见图 3, 1- 10号样品为包涵体溶解
液上柱后的穿透液,其主要是由杂蛋白和未被吸附
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
过量的目的蛋白组成。 10 - 24号样品是以含 20
mmo l /L咪唑 E lution bu ffer洗柱得到的杂蛋白。当
收集液的 OD595不再变化时,表明杂蛋白己经基本洗
脱干净,此时以 300 mmo l/L咪唑进行洗脱收集得到
25- 30号样品, 洗脱下来的样品是结合到镍柱的目
的蛋白,其浓度在 25号样品中最高。最后以 400
mmo l /L咪唑洗脱液进行洗脱, 以清除未被洗脱下
的残留蛋白。由图 4、图 5可知, 300 mmo l/L洗脱能
把目的蛋白洗脱完全。因此,在结合缓冲液的咪唑
浓度为 20 mmo l/L 时, 最佳的洗脱条件是用
20 mmo l/L咪唑冲洗未结合的杂蛋白, 然后用
300mmo l /L洗脱目的蛋白。
M. M ark; 1- 3分别为未诱导的细胞破碎沉淀、
包涵体溶解液、包涵体溶解沉淀
图 1 Hepc id in融合蛋白在大肠杆菌中的表达
图 2 蛋白浓度测定标准曲线
2. 3氧化与复性
采用 cysteine / cystine氧化还原体系, 将 H is

hepcidin融合蛋白氧化形成二硫键, T ricine
SDS

PAGE结果显示氧化复性后蛋白纯度较高 (图 4)。
图 3 在变性条件下 N i
NTA亲和层析结果
1, 2.分别为洗脱号 25、26融合蛋白
产物氧化复性后电泳结构; M. M ark
图 4 纯化后 Tr icine
SD S
PAGE电泳分析
图 5 酶切反应后 Tricine
SDS
PAGE电泳
2. 4 肠激酶酶切反应
酶切反应产物的 Tric ine
SDS
PAGE分析结果
显示,加入肠激酶 16 h后融合蛋白消化完全。从图
5可知,在分子量 3 kD左右有一条明显的条带, 与
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2010年第 5期 王继雯等:重组 H epc idin融合蛋白的氧化复性及活性鉴定
理论计算的 Hepc idin分子量 28 kD一致。
2. 5 抑菌活性鉴定
以琼脂孔穴扩散试验测定重组 H epcidin分别
对大肠杆菌、巴西固氮螺菌、腊样芽孢杆菌、地衣芽
孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌的抗菌效
果 , 结果显示如图 6。重组 H epcidin对腊样芽孢杆
菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌
等菌具有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌、巴西固氮
螺菌等无抗菌作用。该试验结果表明, 制备的重组
Hepc id in具有生物活性,它不但对枯草、地衣芽孢杆
菌等革兰氏阳性菌有明显的抑菌作用, 而且对沼泽
红假单胞菌等部分革兰氏阳性菌也有一定的抑菌
活性。
1.大肠杆菌; 2.巴西固氮螺菌; 3.腊样芽孢杆菌; 4. 地衣芽孢
杆菌; 5. 枯草芽孢杆菌; 6.沼泽红假单胞菌;各个平板上的中
间孔为重组 H epcid in样品,其余两孔为灭菌 PBS阴性对照
图 6 重组 Hepcid in抑菌活性测定
3 讨论
抗菌肽 (H epcidin)诱导的表达蛋白存在于在包
涵体中,必须通过变性、复性等工序使其恢复活性,
在这一过程中,蛋白损失较多, 回收率偏低。通过重
组载体表达的融合蛋白除 H epcidin分子内的 8个
半胱氨酸外不含有其它半胱氨酸残基,单体序列不
参与二硫键的形成,因此在试验中,首先将还原态的
H is
hepc id in氧化形成二硫键,然后经过 PEG浓缩、
逐步稀释、PEG浓缩、透析等程序, 再切除单体蛋
白。一方面可以节约价格昂贵的肠激酶,另一方面,
单体蛋白 N端带有组氨酸标签, 在其切除之前, 6
H is的存在可使得融合蛋白的回收和浓缩十分方
便。另外,以 PEG浓缩代替上柱浓缩, 可以避免重
新引入咪唑, 使操作更加简单快捷, 为 H epcid in的
工业生产提供了新的方法。
由于抗菌肽 H epcidin含有 8个半胱氨酸残基,
在内部形成 4对二硫键, 这些二硫键在蛋白复性时
很容易因错误配对而丧失活性。因此, 如何降低
H epcidin内部半胱氨酸残基间的错配概率, 提高其
生物活性是本试验的一个关键点。本试验通过基因
工程菌表达的融合蛋白制备 H epcidin蛋白纯度大
于 95%。经检测对对腊样芽孢杆菌、地衣芽孢杆
菌、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌等菌具有抗菌活
性, 这一点与 K rause等 [ 1 ]报道的结果 ∀只对枯草芽
孢杆菌有明显的抑菌作用#差异较大。
参 考 文 献
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