全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
大豆脂肪氧化酶 3基因 ( Lox3)启动子的
克隆及其瞬时表达分析
赵艳 1 史岩玲2 钱丹丹1 张庆林 1 闫帆 1 王庆钰 1 张艳 1 李景文 1
( 1吉林大学植物科学学院,长春 130062; 2吉林农业大学农学院,长春 130118)
摘 要: 利用 PCR技术从大豆基因组 DNA中分离脂肪氧化酶3基因启动子片段 Lox3p。PLACE在线启动子预测工具
分析表明: 序列中含有多种典型的种子及胚特异性表达元件。将克隆得到的 Lox3p片段替换 pCAM BIA1301中的 CaMV35S启
动子, 构建表达载体 pCAMLox3p。通过农杆菌介导法在大豆种子中进行瞬时表达, GUS组织化学染色及荧光测定都显示出
Lox3p驱动 GUS基因表达的强度高于 CaMV35S启动子。结果表明, 该 Lox3p启动子片段具备一定的胚特异表达特性, 为探明
大豆脂肪氧化酶3基因启动子胚特异表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。
关键词: 大豆 脂肪氧化酶3基因 启动子 瞬时表达
Cloning and Transient Expression of Soybean Lox3 Gene Promoter
Zhao Yan
1
ShiYanling
2
Q ian Dandan
1
Zhang Q inglin
1
Yan Fan
1
W angQ ingyu
1
Zhang Yan
1 L i Jingw en1
(
1
College of P lant Science, Jilin University, Changchun 130062;
2
College of Agronomy, J ilin Agricultural University, Changchun 130118)
Abstrac:t The upstream nucleo tide sequence of soybean Lox3 gene, nam ed Lox3p, was iso lated from the genom icDNA of soybean by PCR
me thod. Promo ter sequence ana lysis by PLACE showed that it had some typica l seedspecific and em bryospecific c ise lem ents. R eplacing
CaMV35S prom oter of pCAMB IA1301 w ith theLox3p fragmen,t the b inary expression vector pCAM Lox3p w as constructed. T ransient expression
in soybean seed byAgrobacterium tum efaciens mediated method, both the results o f histochem ical GUS ana lysis and fluorom etric GUS ana lysis
showed thatGUS activ ity driven by Lox3p fragm entwas h igher than that driven by CaMV35S promo ter. The resu lts indica ted that the fragm ent o f
Lox3p m ight be smi ilar or have retained certa in embryospecific features, which prov ided va luable inform ation of supporting the future research o f
regulatory sequence and regulatory mechanism of Lox3 gene promoter.
Key words: Soybean L ox3 gene P rom oter Transient expression
收稿日期: 20100311
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30971808 ) ,转基因生物新品种培育重大专项子课题 ( 2008ZX08004003 ) ,吉林省科技厅重点项目
( 20080204 ) ,长春市科技计划项目 ( 08GH 10)
作者简介:赵艳,女,在读博士,研究方向:植物种质资源与利用; Em ai:l zhaoyan3053877@ yahoo. com. cn
通讯作者:王庆钰,教授,博士生导师, Em ai:l w qy414 cn@ yahoo. com. cn
李景文,讲师, Em ai:l l jwk9@ 163. com. cn
随着基因组大规模测序的陆续完成、功能基因
组研究的不断深入,对适用启动子的要求越显迫切。
种子特异性启动子能够调控外源基因只在种子中大
量表达,增加种子中表达量的同时避免了植物营养
的不必要浪费。近年来, 人们相继分离和鉴定了许
多种子特异性启动子, 如水稻谷蛋白启动子 [ 1] , 油
菜 nap in蛋白启动子 [ 2] , 豆球蛋白启动子 [ 3 ]和玉米
醇溶蛋白启动子 [ 4]等, 在植物转基因研究应用中显
示出了显著效果。
种子特异性启动子有时存在表达特异性及稳定
性的问题,如蚕豆 USP基因启动子可以驱动报告基
因在转基因拟南芥种子中特异性表达,但该启动子
驱动报告基因在转基因豌豆的花药、花粉和种皮中
都表达 [ 5] ; 种子特异性启动子的表达强度有时也会
发生改变,如: 棉花的 球蛋白启动子在转基因拟
南芥和烟草中驱动 GUS的表达活性只是棉花中的
167%和 1% [ 6] ,说明利用植物本身的种子特异性
启动子应用在转基因研究中是十分必要的。大豆是
重要的农作物,为人类提供丰富的蛋白质和食用油。
但大豆中获得的种子特异性启动子相对较少, 在一
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
定程度上减缓了大豆转基因工程的研究与应用。
大豆脂肪氧化酶3基因 ( Lox3)是与脂类代谢相
关的一种酶,真核生物启动子数据库中显示,该基因
启动子调控下游基因在大豆胚中特异性表达。本试
验根据 GenBank中 Lox3基因的上游序列设计合成引
物,扩增获得的片段构建在含有 GUS报告基因的表
达载体 pCAMB IA1301中, 转化农杆菌 EHA105, 在大
豆种子中进行瞬时表达,旨在通过种子中的瞬时表达
分析,研究 Lox3基因启动子在大豆种子中的表达强
度及调控序列。
1 材料与方法
11 材料
大豆品种吉豆 2号、大肠杆菌 DH 5、根瘤农杆
菌 EHA105和 pCAMB IA1301质粒为本实验室保存;
限制性内切酶 P st I、N co I、pMD18T克隆载体、Ex
Taq、T4连接酶均购自 TaKaRa公司, DNA凝胶回收
试剂盒购自维特洁公司, PCR引物和 DNA序列测定
由上海生工生物工程公司合成, 5溴 4氯 3吲哚葡
糖苷酸 ( XG luc )购自 C lon tech公司, 4MU 和 4
MUG购自 S igma公司,其它试剂均为进口或国产分
析纯。
12 Lox3基因启动子的克隆与序列分析
根据 GenBank中大豆脂肪氧化酶 3基因的上
游序列 ( X069281)设计合成 2条引物,在下游引物
的 5 端引入 N co I酶切位点,并增加 3个保护碱基:
LoxF: 5 AATTCATTTCTAATGTAAAATT3 , LoxR:
5 GGGCCATGGCTTTGCAACCCACCAACACTAC3
(加横线者为 N co I酶切位点 ) ,采用 CTAB法提取
大豆幼苗叶片总 DNA。以总 DNA为模板, 扩增脂
肪氧化酶3基因的上游序列片段 ( Lox3p), 纯化后
连接到 pMD18T克隆载体上, 获得重组质粒进行筛
选并测序。利用 DNAMAN软件对测序结果进行同
源性比对, PLACE ( http: / /www. dna. affrc. go. jp/
PLACE /signalscan. htm l) 网站寻找可能存在的顺式
作用元件。
13 瞬时表达载体构建
用 P st I和 N co I双酶切质粒 pMD18TLox3p和
pCAMB IA1301, 将酶 切 pMD18TLox3p 得 到的
Lox3p片段与酶切 pCAMB IA1301载体得到的含有
GUS的大片段, 用 T4连接酶进行连接, 得到 Lox3p
与 GU S基因融合的瞬时表达载体 pCAM Lox3p。由
CaMV35S启动 GUS基因的质粒 pCAMB IA1301, 作
为 Lox3p启动子与组成型启动子瞬时表达比较的试
验对照。
14 农杆菌介导法侵染大豆种子
将以上两个瞬时表达载体利用冻融法转入根癌
农杆菌 EHA105中。参照胡新文等 [ 7]方法, 将大豆
种子去种皮后切成两瓣, 浸没在分别含有 pCAM
B IA 1301和 pCAM Lox3p质粒的农杆菌 EHA105中
(菌体重悬后 OD600约为 02) , 真空压力 009 - 01
MPa, 20m in,对大豆种子进行侵染。
15 GUS活性检测
GUS组织化学染色和荧光检测都参照 Jeffer
son
[ 7]的方法进行。取出部分未侵染和侵染的大豆
种子, 加入 GUS染色液 ( 50 mmo l /L磷酸钠缓冲液
pH 70, 10 mmo l/L EDTA, 1 mmol /LXG luc, 01 %
Tr iton X100, 10 mmo l/L巯基乙醇 ),真空渗透, 37!
温育过夜, 75%乙醇脱色, 10倍显微镜下观察染色
情况。将剩余种子在研钵中用液氮研磨成粉末, 加
入提取缓冲液,上清液为 GUS蛋白粗提液。取出部
分加 GUS反应底物 4MUG, 进行荧光活性测定。
GU S活性用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得
到相对活性。
2 结果与分析
21 Lox 3基因启动子片段的克隆
用上述方法, 从大豆基因组 DNA中, PCR扩增
得到长度为 860 bp的片段 (图 1) , 命名为 Lox3p。
将该片段连接到 pMD18T载体上, 转入大肠杆菌
中, 提取质粒进行鉴定, P st I与 N co I双酶切鉴定结
果得到与预期相符的片段 (图 2)。
22 Lox3p的序列分析
生物信息学分析表明, Lox3p序列中含有多种
在其它植物启动子中存在的通用启动子元件, TATA
盒 ( RNA聚合酶∀的结合位点 [ 8] )和 CAAT盒 (可能
与转录起始频率有关 [ 9, 10] )及几个典型的种子特异
表达元件 (图 3), 如: 300 ELEMENT (包含胚特异表
达元件 [ 11] )、Ebox(常出现在参与三酰基甘油合成
和植物种子特异表达基因的启动子中 [ 12] )、RY re
peat(对种子特异性基因的高水平表达十分重
要 [ 13, 14] )、SEF1 mot if (能够增强启动子的转录活
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2010年第 9期 赵艳等: 大豆脂肪氧化酶 3基因 ( Lox3)启动子的克隆及其瞬时表达分析
性 [ 15] )、SEF4 mot if (胚特异蛋白 SEF4的结合位
点 [ 16] )和多个种子特异表达元件 AACA [ 17]、ACGT、
CCAA
[ 18]等, 这些调控元件可能对 Lox3p启动子的
胚特异表达方式及表达强度起着重要作用。
图 1 Lox3p扩增产物 图 2 pMD18TLox 3p的酶切鉴定
图 3 Lox 3p DNA序列的生物信息学分析
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
23 pCAM Lox3p瞬时表达载体的构建和转化
用 P st I和 N co I双酶切重组质粒 pMD18T
Lox3p,回收克隆片段,与 P st I和N co I双酶切 pCAM
B IA1301质粒载体得到的大片段进行连接,经转化和
酶切验证,构建得到表达载体 pCAM Lox3p。重组质
粒 pCAM Lox3p用 P st I和N co I进行双酶切鉴定, 获
得预期大小目的片段 (图 4),说明 Lox3p启动子片段
替换了 pCAMBIA1301中的 CaMV35S组成型启动子,
证明该表达载体构建正确。通过冻融法, 将 pCAM
B IA1301和 pCAM Lox3p 载体质粒转化农杆菌
EHA105,经 PCR分析,证实转入农杆菌 (图 5)。
图 4 pCAM Lox3p的酶切鉴定
图 5 农杆菌菌液 PCR鉴定
24 GUS活性检测
图 6表明, 转化 pCAMBIA 1301和 pCAM Lox3p
载体的大豆种子可以被 XG luc溶液染成蓝色, 说明
载体中的 GU S报告基因能够被 CaMV35S组成型启
动子和 Lox3p启动子片段激活表达。与侵染 pCAM
B IA1301载体的种子相比, 侵染 pCAM Lox3p载体
的种子颜色深; 荧光分析结果表明 (图 7) , 侵染
pCAMLox3p载体的种子荧光强度相对值是 CaMV35S
A.未侵染的大豆种子 B.转 pCAM BIA1301载体的大豆种子
C.转 pCAM Lox 3p载体的大豆种子
图 6 Lox 3p在大豆种子中的启动活性
启动子驱动 GUS表达载体在种子中表达活性的
117倍。
图 7 CaMV35S Lox 3p启动子融合 GUS基因
表达载体的相对 GUS活性分析
3 讨论
利用转基因技术改良大豆的品质, 需要适合的
种子特异性启动子。本试验根据大豆胚特异性表达
基因 Lox3上游序列设计合成引物扩增其启动子序
列, 研究其在种子中的表达强度。克隆获得的 Lox3
上游 860 bp序列中, 含有典型的种子特异性表达元
件, 特别是与胚特异性表达有关的 300 ELEMENT
和 SEF4 motif元件在序列中多次出现。转录因子通
过与这些顺式作用元件的结合, 进而增强或抑制启
动子的活性,影响基因转录。与种子特异表达有关
的顺式作用元件的存在、位置、数量等对基因的组织
表达特性及表达强度都有影响。如: B3结构域转录
因子 LEC2在种子特异性基因表达调控方面起作
用, 能够与 OLEOSIN基因启动子中的两个 RY基序
结合,当缺少任意一个 RY时,降低 LEC2激活 OLE
OSIN基因启动子的活性, 当两个 RY同时缺失时,
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2010年第 9期 赵艳等: 大豆脂肪氧化酶 3基因 ( Lox3)启动子的克隆及其瞬时表达分析
LEC2激活 OLEOSIN 基因启动子的活性完全丧
失 [ 19]。因此, 对 Lox3启动子序列中顺式作用元件
的研究将会使该基因胚特异表达特性的调控机制更
加明确。
本试验通过在大豆种子中瞬时表达,对 Lox3基
因上游 860 bp核苷酸序列进行了初步分析。结果表
明 Lox3p驱动 GUS基因表达的活性高于 CaMV35S组
成型启动子,说明该片段具有较强的驱动下游基因
在种子中表达的特点;但 Lox3基因上游更远端序列
是否仍存在对种子特异表达强度及方式起作用的调
控元件,仍需进一步的试验研究。
参 考 文 献
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