全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第1期
收稿日期:2007-09-10
基金项目:国家科技基础条件平台建设项目(2005DKA21205-4)
作者简介:闫晓菲(1983-),女,山东潍坊人,硕士研究生,主要从事球虫生物学研究
通讯作者:黄兵,男,研究员,E-mail:huangbing232@163.com
基因文库的构建是现代生命科学研究中的一
项重要技术。基因文库是通过克隆方法保存在适当
宿主中的某种生物、组织、器官、或细胞类型的所有
DNA片段而构成的克隆集合体,它包括基因组文
库和 cDNA文库。cDNA是指以 mRNA为模板,在反
转录酶作用下形成互补的 DNA。它在理论上代表
了生物体某一发育阶段的所有可表达的遗传信息。
与基因组文库相比,它有着库小、易筛选且更能直
接反映细胞特征的优点。cDNA文库在研究具体某
类特定细胞中基因组的表达状态以及表达基因的
功能鉴定方面具有特殊的优势,从而使它在个体发
育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和凋亡、调
控健康与疾病发生的分子机制等生命现象的研究
中具有更为广泛的应用价值,是研究工作中最常使
用到的基因文库[1]。
1 cDNA文库的发展
从 20世纪 70年代开始,由于限制性内切酶的
发现以及质粒等载体的应用,推动了 DNA体外重
组的进展。1976年 Hofsteter[2]用杂交质粒成功构建
了第一个 cDNA文库以来,构建 cDNA文库的技术
方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期 cDNA
文库,由于当时技术条件的限制,选用质粒载体存
在着合成效率低、难以扩增和保存等缺点,为了克
服这些缺点,Young和 Davis[3]等构建了重组 λgtⅡ
载体,这一载体的运用为表达型 cDNA文库的构建
和保存提供了质的飞跃。Aguan等[4]则对提高 cDNA
cDNA文库及其在原虫研究中的应用
闫晓菲 1 韩红玉 2 岳城 1 黄兵 2
(1新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052;
2中国农业科学院上海兽医研究所 /农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海 200232)
摘 要: cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。
从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达。由于cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用,
因此其应用也日益广泛。简要介绍自cDNA文库创建以来,发展起来的各类文库及其构建cDNA文库的方法。作者重点
阐述了弓形虫、利什曼原虫、阴道毛滴虫、疟原虫等原虫cDNA文库的构建及其应用。
关键词: cDNA文库 原虫 筛选 基因克隆
ApplicationofcDNALibraryinProtozoo
YanXiaofei1 HanHongyu2 YueCheng1 HuangBing2
(1ColegeofAnimalMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumchi830052;2ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,
ChineseAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryforAnimalParasitologyofMinistryofAgriculture,Shanghai200232)
Abstract: cDNAlibraryconstructionandscreenisoneoftheimportantmethodsofgenecloning.Uptodate,it
isbasictooloffindingnewgenesandresearchinggenefunction.TargetgenescanbeselectedfromcDNAlibrary,andit
usedtoanalyzetheexpresionofthegenes.BecauseofcDNAlibraryplayanimportantroleingeneseparationand
cloning,soitsextensiveapplicationincreasingly.Thisarticlebriefintroducesdevelopedofkindsoflibraryandmeansof
constructcDNAlibrarysinceconstructionofcDNAlibrary.TheauthormainlyexplainsthecDNAlibraryconstruction
andapplicationofToxoplasamgondi、Leishmaniadonovani、Trichomonasvaginalis、malariaandsoon.
Keywords: cDNAlibrary Protozoon Screen Genecloning
2008年第1期
文库的效价做出了贡献,其利用一种与 cDNA末端
连接的特殊载体,通过 EcoR1或 Not1酶切位点易
于进行分离出单个克隆插入片段。近年来,随着分
子生物学技术的发展,形成了许多 cDNA文库构建
的新方法、新技术,使得 cDNA文库构建更加迅速、
简便、高效、高质量,以满足研究的需要。
2 cDNA文库的种类
随着 cDNA合成与克隆技术的发展,从富集高
丰度 mRNA的拷贝到富集特定的、稀有的或低丰度
的 mRNA的拷贝,也迅速发展出了许多方法构建相
应的 cDNA文库,形成了不同种类的 cDNA文库。
根据构建 cDNA文库过程中所用介质的不同,大致
分为固相 cDNA文库、Oligo-cappingcDNA文库和
逆转录病毒 cDNA表达文库。固相 cDNA文库的主
要优点是可以简便 cDNA合成的操作,在进行缓冲
液更换时既没有 cDNA的丢失之忧,也无其他物质
污染之忧。Oligo-cappingcDNA文库由 Marnyama和
Sugano(1993)[5]共同开发,是在传统 cDNA文库构
建方法的基础上,利用人工合成寡核甘酸替代真核
细胞 mRNA帽子结构,这种寡核昔酸能够作为
mRNA启始位点的序列标签。其优点是能够构建富
集全长基因和富集基因 5端序列。逆转录病毒
cDNA表达文库由 Wang(1998)[6]开发,是以逆转录
病毒作为载体而构建的 cDNA表达文库。Whitehead
(1995)[7]等和 Znnetino等(1996)[8]构建了一个肿瘤
相关的逆转录病毒 cDNA文库,并使用抗原特异性
细胞毒性 T细胞(CTL)筛选和分离了肿瘤相关的
阳性克隆。
根据 cDNA文库构建的技术和方法可以分为
经典 cDNA文库、标准化 cDNA文库、差减 cDNA文
库、酵母双杂交文库、mRNA差异显示文库、限制性
cDNA文库、染色体或区域特异性 cDNA文库。经典
cDNA文库构建的基木原理是用 Oligo(dT)作逆转
录引物,或者用随机引物,以 mRNA为模板,反转
录合成 cDNA第一链,再合成第二链 cDNA,合成的
双链 cDNA加上适当的连接接头连接到适当的载
体中即可获得文库。标准化 cDNA文库,即某一特
定组织或细胞的所有表达基因均包含其中、且含量
相等的 cDNA文库,故又称为等量化 cDNA文库。
差减文库又称为扣除文库,是反映不同组织和细胞
或同一细胞在不同功能状态下,基因表达差异的
cDNA文库。酵母双杂交文库是以酵母双杂交技术
为基础构建的 cDNA文库。酵母双杂交技术(又称
蛋白肼捕获系统)是 20世纪 90年代兴起的一种研
究蛋白质与蛋白质相互作用的高新分子生物学技
术,作为酵母双杂交研究的 cDNA文库属于质粒文
库。mRNA差异显示文库简单易行、快速、灵敏度
高、重复性好、多能性。限制性 cDNA文库是根据限
制性显示 PCR技术构建的 cDNA文库。染色体或区
域特异性 cDNA文库,是利用某物种染色体特有的
Alu重复序列为引物,以某两个物种 (包括前一物
种)的杂种细胞的 mRNA为模板合成的 cDNA文
库。
3 cDNA文库在寄生原虫的应用
在原虫学领域,由于克隆和表达原虫特异抗原
基因的重组 DNA技术的发展,构建 cDNA文库作
为从分子水平提供虫源抗原基因的手段,已在获取
保护性和诊断性抗原及研究方面起了重要作用。随
着分子生物学技术的不断发展,越来越多的学者构
建各种原虫的 cDNA文库,随即就有新基因和某种
基因的新功能被发现,且已知基因的结构和功能亦
被进一步阐明,从而为原虫病的诊断与预防、寄生
虫虫种的鉴定与分类研究奠定了基础。目前,利用
构建 cDNA文库筛选寄生原虫重要功能基因的研
究,主要集中在危害比较严重的几种寄生原虫上,
如鸡球虫、疟原虫、隐孢子虫等。
3.1 鸡球虫
鸡球虫寄生于鸡肠道上皮细胞内,大量寄生时
严重破坏肠道上皮细胞,引起鸡死亡,发病或亚临
床症状者往往导致鸡肠道上皮细胞增生,严重影响
营养物质的吸收。鸡球虫基因的克隆起始于 1987
年[9],到目前为止大约有几百种基因或基因片段已
被克隆,已构建了许多 cDNA文库。蒋建林等[10]首
次在我国构建出柔嫩艾美耳球虫(E.tenela)cDNA
文库。韩红玉等[11]成功构建了 E.tenela孢子化卵囊
的 ZAP表达性文库。李建华等[12]构建了 E.tenela杂
交虫株 F2cDNA表达文库。这些构建好的文库为从
分子水平深入研究 E.tenela特异性基因提供了物
质基础。国外也已构建了 E.tenela不同发育阶段的
鸡球虫 cDNA文库,如:孢子化卵囊 cDNA文库[13]、
闫晓菲等:cDNA文库及其在原虫研究中的应用 53
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
第二代裂殖子 cDNA文库[14]等。并且用抗体或核酸
探针对已构建好的文库进行了筛选工作,获得了一
些虫体表面抗原基因及阶段性虫体抗原基因。其中
重要的抗原基因有 Brothers等 (1988)[15]利用 E.
tenelaTA4基因片段克隆出了该基因的全长 cDNA;
Binger等(1993)[14]用兔抗 E.tenela裂殖子表面抗原
的抗体从 cDNA文库中筛选出了一个片段(λMZ5-
7)。从堆型艾美耳球虫 cDNA文库中筛选到的基
因:9S4[16]、6S2[17]、MAI[13]等。虽然已克隆到了这些基
因并用其表达产物进行了保护性试验,但到目前为
止,只能提供部分保护性,还需进一步克隆理想的
鸡球虫保护性抗原基因,联合制成多价疫苗。
3.2 弓形虫
弓形虫(Toxoplasamgondi)是一种专性细胞内
寄生的机会致病原虫,生活史复杂,危害严重,累及
的组织器官多,孕妇感染可引起畸胎、死胎等,近年
来弓形虫脑炎已成为艾滋病等患者的主要死因之
一。但是本病无特异临床表现,因而给诊断带来很
大困难;同时治疗药物少,疗程长,毒性大,因此研
制高效低毒的弓形虫疫苗引人关注。国内外都有应
用单克隆抗体免疫筛选 cDNA文库进行抗原鉴定
及分离研究的报道。如 Ossosio[18]等 1992年用能识
别弓形虫棒状体(ROP1)的单克隆抗体免疫筛选
弓形虫 cDNA文库,获得了 ROP1基因 (2.1kb)。
Bohne[19]等 1995年曾用弓形虫缓殖子特异单克隆
抗体免疫筛选 cDNA文库获得并证实缓殖子 30
KDa抗原为缓殖子特异的细胞内抗原。Wan等[20]从
弓形虫速殖子文库中筛选出一系列已表达序列标
志(Expressedsequencetag,EST),发现了与速殖子
生长和繁殖相关的基因。杨秋林等[21,22]构建了 2株
弓形虫速殖子期表达型 cDNA文库,用 PCR的方法
从 cDNA文库中扩增出 ROP1基因。这些结果为抗
弓形虫基因工程疫苗和新药物的研制奠定了一定
的基础。
3.3 利什曼原虫
利什曼原虫病(Leishmaniadonovani)又名黑热
病,虫体寄生于网状内皮细胞内,由吸血昆虫-白蛉
传播,是流行于人、犬以及多种野生动物和人的重
要人畜共患寄生虫病。Omara等[23]从构建好的利什
曼原虫 cDNA文库中克隆并鉴定了 2个 cDNA片
段,其分别来源于前鞭毛体期 cDNA文库(半胱氨
酸 2,Ldccys2)和无鞭毛体期 cDNA文库(Ldccys1)。
Ldccys1基因在无鞭毛体中可充分表达,而在前鞭
毛体阶段表达率则很低。Ldccys2基因在无鞭毛体
和鞭毛体期表达率较高。Ldccys1和 Ldccys2在利什
曼原虫体内过度表达,产生的半胱氨酸具有生物活
性。进一步研究发现,原有的无鞭毛体特异性
Ldccys1与相应抗体产生反应。Campos等[24]从杜氏
利什曼原虫感染小鼠的巨噬细胞 MHC-Ⅱ类分子
中分离出病原体多肽。根据其中一个与任何已知蛋
白都不同源的多肽序列设计引物,结合 PCR方法
从杜氏利什曼原虫 cDNA中扩增出一个 DNA片
段,以这一 DNA片段为探针筛选杜氏利什曼原虫
cDNA文库,获得了含 525bp开放阅读框的 Ld多
肽基因,研究表明 Ldp23可用于疫苗制备和免疫诊
断(不仅可用于利什曼原虫病的免疫诊断,也可用
于细胞内病原体所致的其他疾病的诊断)。敬保迁
等[25]报道,以杜氏利什曼原虫四川人分离株 mRNA
为模板,体外合成 cDNA,以噬菌体 λgt11DNA为载
体构建表达型文库。文库经抗杜氏利什曼原虫前鞭
毛体全虫兔抗血清筛选,共筛 2×104重组子,获 3
个阳性表达克隆,表达产物的分子量分别为136kDa、
160kDa和 148kDa。为进一步筛选功能基因奠定了
基础。
3.4 阴道毛滴虫
阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)是寄生在人
体阴道及泌尿道的鞭毛虫,主要引起滴虫性阴道
炎,是以性传播为主的一种传染病,全球性分布,人
群感染较普遍。章家新(2003)等[26,27]成功构建了阴
道毛滴虫全长cDNA文库,从该文库中筛选出 SIR2、
Ras、PI3K等与细胞周期相关基因的 cDNA克隆,并
用阳性质粒 cDNA克隆进行测序,序列分析获得一
个含 588bpORF的 cDNA片段,该蛋白位于胞浆
的可能性>56%,与典型 2CysPrx亚家族有较高的
同源性(56%～62%),很可能是其中的一个新成员。
张可浩等[28]从构建的阴道毛滴虫 cDNA表达文库
中筛选出 Tv-Sir2-like基因,并对该基因进行序列
分析,结果该基因开放读码框有 1116bp,为编码
371个氨基酸残基的蛋白质。该氨基酸序列与 SIR2
的同源性最高,并具有 SIR23个特征性的高度保
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2008年第1期
守结构域。因此,推测 Tv-Sir2-like是 SIR2的同源
基因,其表达产物可能参与阴道毛滴虫转录沉默,
并调节阴道毛滴虫的细胞周期。
3.5 疟原虫
疟原虫(malaria)寄生于人体引起的疾病统称
为疟疾(俗称打摆子,冷热病),是我国重点防制的
五大寄生虫病之一。为了研究恶性疟原虫的功能基
因,傅作申等[29]构建了高滴度,高重组率的恶性疟
原虫 cDNA表达文库,此文库适合进一步筛选抗疟
原虫药物结合蛋白基因。乔中东等[30]构建了夏氏疟
原虫早期滋养体的 cDNA文库,用抗 Pc-HcPM血清
筛选 3次并经抗 Pc90单克隆抗体复筛,阳性克隆
经体内剪接后行限制性内切酶酶切分析,证明抗体
筛选获得的 16个阳性克隆中,2.2kb和 2.5kb的克
隆可能表达 Pc90蛋白。这些功能基因的获得为疟
原虫新型疫苗或新药物创造了一定的条件。
3.6 隐孢子虫
隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种人畜共患的
寄生原虫,引起人和动物腹泻的重要病原体,日益
受到国内外学者的重视。迄今为止,对于隐孢子虫
病尚无有效的治疗药物和预防方法,人们在免疫学
方面进行了许多研究,期望能找到防治该病的有效
途径。抗体和疫苗对该病的治疗和预防将起重要作
用,而其关键在于寻找有效的抗隐孢子虫疫苗的候
选分子。Petry[31]等从子孢子 cDNA文库筛选出隐孢
子虫特异性 cDNA片段,运用此片段合成引物进行
PCR可检出隐孢子虫微量 DNA。此法对隐孢子虫
的检测具有重要意义。徐卫东等[32]构建了微小隐孢
子虫长春株 cDNA文库,从该文库中克隆出编码
23kDa、15/60kDa子孢子表面蛋白的 cDNA片段,为
进一步研究奠定了基础。
3.7 其他原虫
卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarini)简称肺孢
子虫,广泛存在于人和其他哺乳动物的肺组织内,
可引起肺孢子虫性肺炎,或称肺孢子虫病。本虫为
一种威胁人类健康的机会致病寄生虫。长期以来都
认为卡氏肺孢子虫与 I型肺细胞的粘附是诱发卡
氏肺孢子虫病(PCP)的重要因素。Narasihan等[33]从
卡氏肺孢子虫 cDNA文库筛选出一编码受体蛋白
的基因,应用 Southern印渍和 Northern印渍技术证
明,此基因编码的细胞外基质受体蛋白介导了卡氏
肺孢子虫与 I型肺细胞的粘附,在卡氏肺孢子虫病
病理上起重要作用。
伊氏锥虫(Trypanosomaevansi)寄生于马、驴、
骡、骆驼等动物的血浆和造血器官,引起以进行性
消瘦、贫血、黄疸、高热和心肌衰竭等为特征的伊氏
锥虫病。该病在世界各地广泛流行,我国受危害的
动物不断增多,相继有水牛、鹿、犬、猪、老虎等动物
发生伊氏锥虫病的报道。由于伊氏锥虫抗原变异、
耐药性、免疫抑制的产生,目前该病尚无理想的防
治方法。刘全等[34]成功构建了伊氏锥虫 cDNA表达
文库,为伊氏锥虫免疫相关因子的基因筛选奠定了
基础。
4 展望
cDNA文库是将细胞中所有的 mRNA逆转录
成与之互补的 cDNA,进而合成双链 cDNA,再克隆
到载体上,引入适当的宿主细胞内繁殖而得。通过
核酸、抗体探针筛选 cDNA文库,是获得诊断性抗
原及候选疫苗的有效途径。从各虫种不同发育阶段
的 cDNA文库中寻找出特异性基因片段,是虫种鉴
定及种下分类的有效途径。近年来,从经典 cDNA
文库基础上发展起来的减数 cDNA文库、标准化
cDNA文库、染色体及其区域特异性 cDNA文库,这
3种特殊的 cDNA文库构建方法用不同的策略和方
法富集特定的 cDNA,给克隆新基因提供了有力的
工具,为原虫学研究开辟新的途径。然而将来尚需
有更好的方法来构建原虫稀有基因的 cDNA文库。
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