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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
利用重组大肠杆菌生产人生长激素发酵工艺的研究
朱振洪 葛立军 刘文洪
(浙江中医药大学生物工程学院，杭州 310053)
摘 要: 在摇瓶培养和发酵罐培养条件下，研究了 E coli /BL21(DE3)/pET30a(+)-hGH工程菌的不同发酵工艺条件。
确立了该工程菌的最优化工艺参数:M9-2 培养基，37℃、pH值为 6 8 － 7 4、诱导起始菌体密度为 OD600达 3 0 － 4 0，IPTG浓度
为 1 mmol /L，诱导时溶氧控制为 50%以上，补料为 10%甘油、5%Yeast extract和 5% Tryptone。该工艺条件经过连续三批发酵，
证实稳定可行，目的蛋白在胞间质呈可溶性表达，表达量占菌体总蛋白的 20%以上。
关键词: 大肠杆菌 人生长激素 发酵
Fermentation Conditions for Recombinant
Human Growth Hormone Production in E coli
Zhu Zhenhong Ge Lijun Liu Wenhong
(Bio-engineering College，Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou 310053)
Abstract: The optimum culture conditions of the bacterial strain of recombinant growth hormone(E. coli /BL21(DE3)/pET32a
(+)-hGH)were determined. The optimum expression conditions were found to be at 37℃ temperature，pH range 6 8 － 7 4，in-
duced beginning OD600 3 0 － 4 0，IPTG concentration kept 1 mmol /L，the dissolved oxygen concentration maintained at over 50%，and
feeding medium 10% glycerol + 5% Yeast extract + 5% Tryptone. The conditions were confirmed by continuous three fed-batch fermen-
tation，Soluble rhGH can be expressed stably and estimated at 20% of the total bacterial protein.
Key words: E. coli Human growth hormone Fermentation
收稿日期:2010-02-01
作者简介:朱振洪，男，硕士，助理研究员，研究方向:基因工程药物开发;E-mail:zhenhongzhu@ yahoo. com. cn
人生长激素(hGH)是由脑下垂体分泌的一种
非糖基化蛋白质，由 191 个氨基酸组成，分子量为
22 kD。它具有广泛的生理调节作用，能促进骨、软
骨组织分裂、增殖和骨化，从而使身高增加还促进代
谢作用，临床上主要用于治疗侏儒症，近年来研究
发现人生长激素还可治疗烧伤、创伤、骨折和骨质疏
等多种疾病［1］。
最初生长激素是从牛和猪脑垂体中提取出来
的，治疗效果不佳，并且有发热、过敏等副作用。化
学合成的方法效率较低，没有实用价值，因此，采用
基因工程方法大规模生产人生长激素是满足临床大
量需求的重要手段。目前人生长激素已分别在大
肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞中获得成功表达。
虽然真核表达系统中 rhGH 的活性高，但产量低、
生产成本高，无法满足临床的大量需求。大肠杆
菌由于生长周期短、表达量高、成本经济而成为目
前 rhGH生产的主要表达系统［2，3］。本研究主要运
用大肠杆菌 pET30a(+)表达载体，菌种为 BL21
(DE3) ，对人生长激素进行胞间质可溶性表达，并
通过大量试验优化工程菌的培养条件，以期实现
工程菌的稳定培养和高水平表达，为 rhGH 的大规
模生产提供了条件。
1 材料与方法
1 1 材料
1 1 1 工程菌 表达重组人生长激素的工程菌
pET30a(+)-hGH /BL21(DE3)由本实验室构建，
－ 70℃甘油冻存。
1 1 2 试剂及仪器 酵母抽提物、胰蛋白胨均购自
英国 OXOID公司;IPTG 购自 Sigma 公司;其它试剂
为国产分析。发酵设备采用美国 NBS BioFlo-110 发
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酵罐。图像分析系统采用 Pharmacia的 Image master
VDS系统。
1 1 3 培养基 种子液培养基为 LB 培养基，使用
前加入 50 μg /mL 的卡那霉素(kan)。发酵培养基
为改良 M9 培养基(配方均参照《分子克隆》)［4］。
1 2 培养方法
1 2 1 种子培养 挑取单克隆，接种到 LB 种子液
中(含 50 μg /mL的卡那霉素) ，37℃培养 17 － 20 h。
1 2 2 摇瓶大规模培养 采用 250 mL 三角瓶，每
瓶盛发酵培养液 25 mL，接种比例为 1 ∶ 60，37℃
200 r /min摇床振荡培养。
1 2 3 发酵罐培养 采用 NBS BioFlo-110 发酵
罐，总体积为 7 L，装液量为 5 L。按 10%接种，发
酵参数设置为起始 DO2:大于 40%;起始转速:200
r /min;通气量:10 － 20 L /min;连动转速:200 － 800
r /min。
1 3 分析方法
1 3 1 细胞密度测定 取菌液 0 5 mL，用无菌水
稀释后在 600 nm 处测定吸光度。
1 3 2 菌体总蛋白测定 Lowry 法测定菌体总蛋
白含量。
1 3 3 重组 hGH表达水平的测定 表达产物采用
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE) ，浓缩
胶和分离胶的浓度分别为 5%和 12%，并用 Pharma-
cia公司的 Image Master 凝胶成像系统(VDS)进行
拍照及扫描各泳道条带密度，计算重组蛋白条带密
度占整个泳道百分比［5］。
2 结果与分析
2 1 最佳发酵培养基的筛选
M9 盐基础培养基［4］配方(1 L) :NH4Cl 0 5 g ，
Na2HPO4 3 0 g ，KH2PO4 1 5 g，NaCl 0 25 g，121℃
灭菌后加入 0 1 mol /L CaCl2 1 mL /L、1 mol /L Mg-
SO4 2 mL /L。
表 1 不同M9 改良培养基的主要添加成分
培养基编号 A B C D
培养基名称 M9-1 M9-2 M9-3 M9-4
主要添加成分
0 1%
葡萄糖
0 5%
葡萄糖
1 0%
葡萄糖
2 0%
葡萄糖
表 1 所列的各个培养基中添加成分主要用
已灭菌的 20% (W /V)葡萄糖调整到所需浓度。
首选从平板上挑取单菌落，接种到 LB 种子液中，
37℃培养 18 h;再按 1 ∶ 60 的比例二级接种于 25
mL 培养基的 100 mL 三角烧瓶中，培养 2 h 左
右，加IPTG 至终浓度为 1 mmol /L 诱导目的蛋白
表达，共诱导 4 h。分别取诱导前和诱导后样品
进行 SDS-PAGE 电泳，扫描分析目的蛋白表达
水平。
从图 1 中可以看出，葡萄糖初始浓度为 0 5%
(W /V)时表达量最高，而当葡萄糖初始浓度为
2 0%(W /V)时 hGH表达大大降低，暗示外源基因
的表达可能受葡萄糖代谢物的抑制，故此在发酵过
程中应控制培养液中葡萄糖浓度。故选择改良
M9-2作为后续试验的培养基。
图 1 培养基对表达的影响
2 2 培养基初始 pH值对工程菌的表达影响
用稀盐酸或氨水调节不同摇瓶中的 pH 值，pH
分别为 6 0、6 2、6 4、6 6、6 8、7 0、7 2、7 4。37℃，
培养 3 h后再加 IPTG至终浓度为 1 mmol /L开始诱
导，共诱导 4 h，结果如图 2。诱导后样品经检测
SDS-PAGE检测并扫描蛋白含量。从电泳图谱及扫
描结果(图 3)可看出，控制诱导期的 pH 对表达影
响较大，当 pH 低于 6 6 时，rhGH 表达水平很低
(5%以下) ，而随着 pH 的升高，目的蛋白表达量得
到明显提高，pH 为 7 2 时表达水平达到最高
(22%)。所以本工程菌的发酵 pH 值应选择在
pH6 8 － 7 4 的范围内。
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2010 年第 6 期 朱振洪等:利用重组大肠杆菌生产人生长激素发酵工艺的研究
图 2 不同 pH对表达的影响
图 3 不同 pH条件下蛋白表达的电泳图
2 3 IPTG浓度对工程菌表达的影响
本试验研究 IPTG浓度对表达的影响，分别加入
IPTG至相应的终浓度(浓度范围 0 1 － 1 2 mmol /L，
每隔 0 1 mmol /L 取点)并开始诱导，共诱导 4 h。
结果如图 4 所示，低浓度的 IPTG 对于 rhGH 表达
图 4 发酵过程中 IPTG浓度对表达的影响
量有较大影响，而当 IPTG浓度大于 1 1 mmol /L时，
表达水平相应会受到抑制，综合来看 IPTG 浓度控
制在 0 9 － 1 1 mmol /L 较好，有利于重组人生长激
素的表达。
2 4 诱导起始 OD600的选择
诱导起始 OD 决定了诱导最佳时机，本试验选
取不同的起始 OD600，分别为 0 5 － 5 0，每隔 0 5 取
一个点，加 IPTG至终浓度为 1 mmol /L开始诱导，共
诱导 4 h收获样品，结果如图 5 所示。从图 5 可以
看出，OD600为 3 － 4 的表达水平最好。说明过早诱
导不仅菌体少表达水平也低，而过迟的诱导则导致
整个发酵时间的延长，能耗增加，同时表达水平也会
有一定的下降。因此考虑诱导起始 OD600为 3 0 －
4 0 为宜。
图 5 不同起始诱导 OD600对表达的影响
2 5 摇瓶补料研究
在上述优化后的培养条件下，为了考察流加营
养物质是否有利于重组大肠杆菌对外源蛋白的表
达，进行了摇瓶不同补料添加的研究。本试验选取
不同浓度葡萄糖、甘油与 Yeast extract和 Tryptone配
合，作为发酵过程中的碳源和氮源的补料，共设计了
4 种补料的搭配(表 2)。
表 2 发酵过程中的补料成分
分类 补料的成分
补料 1 10%甘油 + 5%Yeast extract + 5% Tryptone
补料 2 10%葡萄糖 + 5% Yeast extract + 5% Tryptone
补料 3 30%甘油 + 15% Yeast extract + 15% Tryptone
补料 4 30%葡萄糖 + 15%Yeast extract + 15% Tryptone
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从图 6 可以看出，4 种补料对表达水平的影响
不同，其中补料 1 对表达水平影响相对比较稳定，而
补料 2、3 和 4 对表达有一定的抑制作用。可能是由
于葡萄糖在供能的时候又会产生大量的乙酸，当乙
酸积累到一定的程度时将影响工程菌的生长和表
达。据文献报道甘油是基因工程菌较好的碳源，不
会导致副产物乙酸的积累，而本试验发现高浓度的
甘油同样也会使 rhGH 表达水平显著下降。通过 4
种不同补料的比较发现采用 10%甘油 + 5% Yeast
extract + 5% Tryptone的补料配方较佳。
图 6 不同补料成分对表达水平的影响
2 6 发酵参数优化整合
根据摇瓶试验及发酵罐试验结果进行参数优
化、整合，确定了发酵的基本参数:采用 M9-2 培养
基，接种比例 1∶ 10，温度 37℃，pH为 6 8 － 7 4，培养
阶段 DO2大于 40%，初始转速为 200 r /min，通气量:
10 － 20 L /min，连动转速:200 － 800 r /min，待 OD600
达到 3 0 － 4 0 时开始诱导。诱导阶段加入 IPTG浓
度为 1 mmol /L，DO2大于 50%，待 pH 上升(碳源耗
尽)后以合适转度流加碳源(10%的甘油)及氮源
(5% Yeast extract + 5% Tryptone)补料维持 pH 在
6 8 － 7 2，诱导 3 h 结束。一共进行了 3 次重复试
验，电泳结果如图 7。从图 7 可以看出，3 批发酵结
果稳定，rhGH 的平均表达量为菌体总蛋白的 21%，
并且不会形成包涵体，而是分泌至胞间质以可溶形
式表达。
3 讨论
研究表明，对于重组大肠杆菌的发酵不存在普
适的发酵条件，这是由于其质粒、宿主菌、表达产物
的性质等特殊性决定的。传统的利用大肠杆菌生产
1 － 3.三批发酵试验表达产物;4.蛋白质分子量标准
图 7 三批发酵试验表达 rhGH电泳图
人生长激素方法有两种，一是将其分泌至胞外上清
中，虽然纯化方便，但表达量低(10%左右) ，且容易
引起产物的降解;二是在胞内高效表达，表达量可达
40%以上，但易形成包涵体，需要进行变复性等操
作，纯化工艺烦琐，活性蛋白得率低。近年来利用周
质腔分泌表达是大肠杆菌表达系统新的发展方向，
其主要特点是:蛋白质以可溶形式表达，具有较高的
生物活性;周质腔中蛋白水解酶相对较少，提高了重
组蛋白的稳定性;消除了被分泌蛋白对细胞本身的
毒性作用;表达的蛋白易于后续的分离纯化［6，7］。
本研究应用 pET30a(+ )表达载体和 BL21
(DE3)宿主菌，成功地将 rhGH 分泌至胞间质进行
可溶性表达，由于周质腔分泌表达的产物具有可溶
性和生物活性，所以该种表达方式是选择慢速持续
的表达策略，如中等强度启动子、合适的诱导剂浓
度、丰富的培养基等，避免包涵体的形成。
基于以上原因，本研究通过试验研究，确定了
rhGH在 M9-2 培养基中发酵的参数，即诱导剂的浓
度为 1 mmol /L、pH 值控制在 6 8 － 7 4、诱导起始
OD600为 3 0 － 4 0，诱导时间为 3 － 4 h，并通过试验
发现发酵过程中采用 10%甘油 + 5% Yeast extract +
5% Tryptone作为碳、氮源补料较好，上述工艺条件
通过多批发酵重复性试验，证实稳定可行，表达产
物能以胞间质可溶性表达，表达水平达 20%以上，
为 rhGH的大规模生产及后续分离纯化工作提供
参考。
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2010 年第 6 期 朱振洪等:利用重组大肠杆菌生产人生长激素发酵工艺的研究
参 考 文 献
［1］Yi C，Wang SR，Zhang SY，et al. Effects of recombinant human
growth hormone on acute lung injury in endotoxemic rats. Inflamm
Res，2006，55(11) :491-497.
［2］Tabandeh F，Shojaosadati SA，Zomorodipour A，et al. Heat-induced
production of human growth hormone by high cell density cultivation
of recombinant Escherichia coli. Biotechnol Lett，2004 ，26(3) :
245-250.
［3］Persson J，Andersen DC，Lester PM. Evaluation of different primary
recovery methods for E. coli derived recombinant human growth hor-
mone and compatibility with further down-stream purification. Bio-
technol Bioeng，2005，90(4) :442-451.
［4］Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T著，金冬雁，黎孟枫，等译.分子
克隆实验指南［M］.北京:科学出版社，1999:908-910.
［5］王海波，王骊丽，欧俊杰，等.用重组大肠杆菌生产 rhG-CSF高密
度发酵的方法.第四军医大学学报，2004，25(12) :1085-1088.
［6］Fu XY，Tong WY，Wei DZ. Extracellular production of human para-
thyroid hormone as a thioredoxin fusion form in Escherichia coli by
chemical permeabilization combined with heat treatment. Biotechnol
Prog，2005，21(5) :1429-1435.
［7］Koo TY，Park TH. Expression of recombinant human growth hormone
in a soluble form in Escherichia coli by slowing down the protein syn-
thesis rate. J Microbiol Biotechnol，2007，17(4) :
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
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