全 文 ：收稿日期:2008-01-25
基金项目:江西省自然科学基金(2007GZN1927)及同济大学长江水环境教育部重点实验室开放基金资助(YRWEF07005)
作者简介:龚世杰(1983-),汉族,江西南昌,在读硕士研究生,研究方向:微生物分子生物学;Tel:0791-8895110;E-mail:qyueihao@163.com
前言
微生物是地球上所有生命中必不可少的一个
部分,它在环境气候的形成、地球化学循环、地质演
化和生物进化中扮演着重要的角色。在湖泊生态系
统中,微生物作为物质循环和能量循环的主要参与
者,起着不可忽视的作用。湖泊微生物的多样性研
究,有助于我们更为深入地掌握湖泊微生物的分布
特征及其在湖泊生态系统中的功能与作用,对深入
开展湖泊生态环境研究具有重要的意义。
但由于在自然界中,有 99%的微生物是属于不
可培养微生物,特别是水体微生物如淡水微生物的
可培养率为 0.25%、海水微生物的可培养率为
0.001%~0.1%,这就导致了自然界中的绝大多数微
生物仍然没有被人们所认识[1]。但是,由于分子生
物学技术特别是环境基因组技术(也叫宏基因组技
术)、生物信息学的发展,极大地促进了我们对湖泊
微生物遗传多样性、种群结构和湖泊微生物生态功
能的了解,就近年来湖泊微生物多样性的研究作一
个简要的综述。
1 湖泊微生物研究现状
1.1 微生物多样性
通常情况下,生物多样性是指生物物种的多样
化及其变异的程度和广度,是物种多样性,遗传多
样性和生态系统多样性 3个层次上的综合表述[2]。
而微生物多样性是所有微生物种类、种内遗传变异
及其生存环境的总称,包括生活环境的多样性、形
态学上的多样性、系统进化的多样性、基因的多样
性、基因型的多样性、物种多样性以及营养和代谢
类型的多样性等等[2]。微生物多样性在本质上源于
遗传的多样性,即主要由碱基排列顺序的多样性和
碱基数量的巨大性所决定。微生物多样性的衡量有
很多标准:系统进化多样性、物种多样性、基因型多
样性和基因多样性等等。在物种多样性水平之上,
微生物多样性通常是根据具体环境中的某一类群
湖泊微生物多样性研究进展
龚世杰 吴兰 李思光
(南昌大学生命科学学院,南昌 330103)
摘 要: 随着不依靠培养的分子生物学技术的迅速发展,湖泊微生物多样性研究越来越受到人们的重视并取得了
较大的成果。从从古细菌域、细菌域、真核生物域3个方面概述了湖泊微生物多样性的研究进展并简单介绍了宏基因组技
术在湖泊微生物多样性研究中的运用。
关键词: 湖泊微生物 多样性 宏基因组
StudyingonLakeMicrobialDiversity
GongShijie WuLan LiSiguang
(ColegeofLifeScience,NanchangUniversity,Nanchang330103)
Abstract: Inrecentyears,alonewiththerapiddevelopmentofculture-independentmolecularbiotechnology,the
researchonlakemicrobialdiversityisbeingconcernedmoreandmoreandmanyachievementshavebeenmade.Inthis
paper,advancesintheresearchoflakemicrobialdiversityweresummarizedfrom theaspectofarchaea、bacteriaand
eukarya,andtheapplicationofmetagenomicsintheresearchoflakemicrobialdiversitywasintroducedsimply.
Keywords: LakemicroorganismsDiversity Metagenomics
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第4期
2008年第4期
微生物的进化距离来量化在物种多样性水平之下,
微生物多样性则是由物种的遗传参数如基因多样
性和基因型多样性来衡量;在物种水平上,微生物
的多样性是由物种多样性来衡量[3]。
1.2 湖泊微生物多样性研究成果
湖泊是指由地表的洼地蓄水而成的水域。湖泊
有大有小,面积大的为湖或泊,小的为池塘,还有些
天然或人工湖泊是作为蓄水、灌溉、发电之用的为
水库。湖泊是重要的淡水系统,不仅有丰富的水生
植物,还有大量的鱼虾等水产,这里又是许多动植
物的栖息场所,是自然界中重要的生态系之一。
湖泊的生境类型各不相同:有的富营养,有的
贫营养,有的含盐量高,有的海拔高等等。正是由于
湖泊生境类型的各不相同,使得湖泊微生物的多样
性非常丰富。近年来,随着分子生物学技术的应用,
湖泊微生物多样性逐渐地被人们所认识。众多学者
做了单个或多个湖泊的微生物多样性的研究,大大
地推动了湖泊微生物多样性研究的发展。这些成果
对研究微生物在湖泊生态循环中的作用和开发湖
泊微生物资源具有导向作用。
1.2.1 古细菌域 古细菌一直被认为只能生存于
极端生境(高盐、高温、厌氧等)之中[4]。随着生物技
术,特别是分子生物学技术的发展,人们开始认识
到古细菌同样也存在于非极端环境之中。它们在湖
泊浮游生物中占有相当大的比重,在湖泊生态系统
的生物地化循环中具有举足轻重的作用。
大量研究表明,古细菌在不同的湖泊中的数量
和种类分布极不平衡。首先,湖泊水体中,古细菌的
数量较多,是湖泊浮游生物的主要的细胞组成,而
在湖泊沉积物中(极端环境除外),古细菌仅约占沉
积物原核生物的1%[5]。其次,不同类型的湖泊中湖泊
古细菌类群会出现不同的分布,如 AijazAhmadWani
等[6]构建了印度 LonarCrater湖古细菌的 16SrDNA
文库,发现该湖的古细菌主要属于 Crenarchaeota
(泉古菌门)中的 Sulfolobus(硫化叶菌属)和 Euryarc
haeota(广古菌门)中的 Methanocalculus(甲烷烁菌
属);JuliaI.K.Schwarz等[5]报导在以色列一个富营
养湖泊 kinneret湖内,古细菌主要属于Methanomicr
obiales(甲烷微菌目)和 Methanosarcinales(甲烷八叠
球菌目)等等。由上可以看出,湖泊中大多数的古细
菌都属于 Euryarchaeota和 Crenarchaeota,但是在目
或属的水平上,在不同的湖泊中微生物的种类却各
不相同,说明了在湖泊生态系统中,古细菌的种类
分布是不平衡的。此外,同一类群的古细菌在许多
不同的湖泊中也都能够鉴定得到。如从上述以色列
kinneret湖中鉴定得到的Methanosaetaceae(甲烷毛菌
属,属于 Methanosarcinales)和 Methanomicrobiales在
其它的富营养和中等营养的湖泊--Biwa湖(位于日
本)、LakeSoyang湖(位于韩国)、LakeDagow湖(位
于德国)中也存在,而且在瑞士的 Rotsee湖中,
Methanosaetaceae克隆的数量更是占该湖古细菌克
隆的 91%[7]。进一步说明了 Methanosaetaceae和
Methanomicrobiales这两类古细菌在湖泊生态系统
中是广泛存在的。
湖水以及湖泊沉积物中的新属种古细菌不断
地被发现。以前人们一直认为绝大多数的古细菌都
属于 Crenarchaeota和 Euryarchaeota,但是随着许多
新属种的古细菌从各种环境中鉴定出来,人们对于
古细菌分类的认识也发生了根本的改变。如:
Korarchaeota(初古菌门)因为一直未得到纯培养而
不受重视。但 ThomasA.Auchtung等[8]发现在美国
国家黄石公园的热泉、河流、湖泊、土壤等环境中
Korarchaeota的多样性非常丰富,表明 Korarchaeota
在古生菌中也占有重要的地位。另外在湖泊中也分
离鉴定得到了其它的新属种的古细菌,其中,产甲
烷古菌与硫酸盐还原古菌在湖泊的碳循环和硫循
环中起着重要的作用[9]。
1.2.2 细菌域 目前在美国国家菌种保藏中心
(ATCC)保藏的从湖泊中分离得到的主要细菌类群
大多数都属于 Proteobacteria(朊细菌门),它包括了
α-、β-、γ-、δ-、ε-Proteobacteria(α-、β-、γ-、δ-、ε-朊细
菌纲),Bacteroidetes(拟杆菌门),Cyanobacteria(蓝细
菌门),Actinobacteria(放线菌门),Verucomicrobia
(疣微菌门),Chlorobi(绿菌门),Planctomycetes(浮
霉菌门),Firmicutes(厚壁菌门)等等 [10]。Zwart,G
(2002)等研究了北美,亚洲,欧洲等不同湖泊和河
流的细菌多样性,主要的湖泊微生物有以下几类:
α-、β-、γ-、δ-、ε-Proteobacteria,Bacteroidetes,Cyano
bacteria,Actinobacteria,Verucomicrobia,Chlorobi,它
们之中的大多数目前都不可培养[11],Zwart,G等得到
龚世杰等:湖泊微生物多样性研究进展 55
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
的实验结果很好的证明了以上结论。
湖泊细菌多样性随着湖泊盐度的变化而变化。
QinglongL.Wu等[12]报道盐度是影响细菌群落结构
多样性的一个重要因素,他们发现例如不同 Proteo
bacteria的相对丰度会随着盐度的变化而发生剧烈
的演替,而且只有少数种类的湖泊细菌能适应大范
围的盐度变化。HongchenJiang等[13]研究中国西北
的 Chaka湖发现高盐度的湖水中鉴定的克隆大部
分都属于 Bacteroidetes,低盐度的湖水底泥中鉴定
的克隆大部分属于低革兰氏阳性菌。这就说明了盐
度是影响湖泊细菌群落多样性的一个重要因素,不
同盐度环境中的湖泊细菌类群会发生很大的变化,
而且某一特定细菌类群的丰度在很大程度上也会
受到盐度的影响,而且只有少数种类的细菌能够在
不同盐度的湖泊环境中找到。
在碱性湖泊中,细菌的群落结构也有其特有的
多样性分布。例如 PurificaciónLópez-García等[14]研
究了碱性 Van湖,结果显示大多数的细菌都属于低
G+C革兰氏阳性菌 Firmicutes,且它的多样性最为
丰富。其它的类型包括 α-、β-、γ-Proteobacteria,
Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides,Cyanobacteria,Acti
nobacteria。其中,α-、β-、γ-Proteobacteria的序列与
已经鉴定的能降解有机化合物的细菌同源性很高,
而高 G+C革兰氏阳性菌 Actinobacteria的序列与能
够 降 解 烃 类 物 质 的 嗜 碱 性 菌——动 性 球 菌 属
(Planococcus)和芽孢杆菌属(Bacilus)的同源性非
常高。实际上,在碱性湖泊中都能找到革兰氏阳性
菌。YanheMa等[15]研究了中国内蒙古的碱性 Baer
湖,克隆中大部分都属于革兰氏阴性菌,其中 α-、
β-、γ-和 δ-Proteobacteria所占的比重分别为 24%、
31%、33%和 2%。而革兰氏阳性菌在文库中所占的
比例却很小。这说明了在不同的碱性湖泊中,细菌
群落的微生物多样性也各不相同;而且在碱性湖泊
中,存在着大量的能够降解有机化合物的细菌,他
们的存在可能同湖泊环境的化学平衡息息相关。
湖泊的深度同样也会对细菌的微生物多样性
产生影响。在不同的深度,湖泊细菌的微生物多样
性的分布也不相同。ShaheenB.Humayoun等[16]研究
了不同深度的湖泊微生物多样性。他们发现文库中
的细菌类型大多都属于 α-Proteobacteria(占 6%)、
γ-Proteobacteria(占 10%)、CFB(占 19%)、高 G+C
革兰氏阳性菌 Actinobacteria(占 25%)、低 G+C革
兰氏阳性菌 Bacilus和 Clostridium(占 19%),还有一
部分属于 β-、δ-Proteobacteria和 Verucomicrobiales。
研究结果说明了下层水样(缺氧环境)的细菌的微
生物多样性比上层水样 (有氧环境)更为丰富。
AaikeDeWever等[17]得到了相似的结论。由此可以
看出,湖泊细菌的微生物多样性随着湖泊深度的变
化会发生显著的变化,一般来说,下层水样的细菌
微生物多样性更为丰富,这可能是由于湖底的特定
环境(如缺氧、低温等)所造成的[9]。
随着湖泊营养类型的不同,湖泊细菌类群的微
生物多样性也不尽相同。HideyukiTamaki等[18]发现
富营养湖泊中主要细菌是 Proteobacteria(47%),且
在 Proteobacteria中,δ-、β-和 γ-Proteobacteria分别
占 23.2%、12.5%和 9.8%。而 Nitrospira则占全部克
隆的 13.4%。文库中其它的已鉴定的克隆还有 Acid
obacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和 Chlorobi等等。
另外,季节的变化会很大程度上对富营养湖泊、腐
殖质湖泊和贫营养湖泊中细菌群落的微生物多样
性产生影响。A.C.Yannarel等[19]运用 ARISA分别
对不同季节的富营养湖泊 Mendota、腐殖质湖泊
CrystalBog和贫营养湖泊 Crystal进行了研究。他们
发现随着季节的变化,3个湖泊细菌群落的微生物
多样性也会发生变化。在春秋两季,湖泊细菌的群
落组成相对比较稳定,但是在夏季却会发生较大的
变化,变化的特点就是细菌微生物多样性的减少。
由上可以看出,湖泊细菌的多样性是非常丰富
的,而且随着湖泊生境类型的不同,他们的群落组
成也各不相同。它们的变化虽然没有统一的规律,
但是通过对已报道文献的对比总结,还是能够粗略
的了解到不同环境下的湖泊细菌类群的分布。
1.2.3 真核生物域 超微真核藻类(Picoeukaryotes)
是地球上数量最多的真核生物,在海洋和湖泊环境
中的密度更是高达 102~104个细胞/ml[20]。它是环境
生态系统的微生物食物链中必不可少的重要组成
部分,在环境地球化学循环中也扮演着重要作用。
但是,目前有关真核微生物多样性的研究多是集中
于海洋环境中,湖泊环境中的真核微生物多样性研
究报道较少。
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2008年第4期
TakishitaK等[21]对日本 Namakoike湖的真核微
生物多样性研究,发现大多数的克隆都属于已知的
真核微生物类群,如 Cercozoa(丝足虫类)、Alveolata
(囊泡虫类)、Stramenopiles和 Opisthokonta等等,这
些真核类型有的可以在缺氧的环境中找到,有的则
是与真核状态的寄生虫相关,并从该湖中发现了若
干新种。JanSlapeta等[22]的研究中也同样发现了湖
泊真核微生物丰富的多样性,得到的大多数克隆属
于 alveolates,cryptophytes(隐藻纲),heterokonts(不
等鞭 毛 类 ),Cercozoa,Centroheliozoa和 haptophytes
等,也有少数序列不能归类于已知类群。而且他们
还发现了真核微生物的种特异性,如发现了属于纤
毛虫纲(ciliates)的 21个不同的种。另外,人们还发
现了特定的只有在湖泊环境中才广泛存在的真核微
生物类群,他们在海洋等其它生境中很少被鉴定或只
是在其它生境中占极少的一部分,如 Chrysophyceae
(金藻纲)、fungi等等[20]。
当然,湖泊环境的不同也会影响到湖泊真核微
生物的群落组成。MarieLefranc等[20]研究了营养状
况不同的 3个湖,结果表明富营养的 Aydat湖真核
微生物的多样性最低,中等营养的 Pavin湖的多样
性最高。其中 Cryptophyta(金藻纲),Chrysophyceae,
和严格异养的 Ciliophora(纤毛虫类)和 fungi在 3个
湖中都能鉴定到,但是 Choanoflagelida(颌鞭目)在
富营养湖泊中没有找到,Cercozoa在富营养和中性
营养中都能找到。这说明了真核微生物的群落组成
与湖泊所处的环境有密切的关系。另外,有学者利
用典型对应分析法(CAA)研究了环境因素对湖泊
真核微生物群落组成的影响,他们发现,湖泊的温
度,溶解氧、营养素甚至是细菌数量以及浮游动物
的种类都会对真核微生物的种群结构产生影响[23]。
总之,在不同的湖泊环境中,各湖泊真核微生物群
落组成各不相同。在湖泊真核微生物多样性的研究
之中,湖泊所处的特定环境条件是一个重要的参考
因素。
1.3 湖泊宏基因组研究成果
宏基因组学是直接研究从环境中取得样本中
的微生物基因组,它的基本策略:从环境样本中直
接抽提微生物 DNA,将 DNA片段克隆到载体上,
转化宿主菌,构建宏基因组文库。然后根据不同的
目的分析宏基因组文库,对文库进行随机 DNA序
列测定以研究微生物群落的组成,筛选文库以发现
特异的基因或表达的特殊表现。筛选宏基因组文库
的方法可以分为基于测序分析的方法、基于功能分
析的方法、底物诱导基因表达筛选。
目前,环境宏基因组的研究多集中在海洋,土
壤等其它自然环境中,湖泊环境的宏基因组研究还
处于起步阶段,但是人们也依然从湖泊环境的宏基
因组研究中得到了一些令人振奋的结果。如 Gary
R.LeCleir[24]等研究了加利福尼亚的一个高碱高盐
的湖泊,他们构建了湖泊的 fosmid宏基因组文库,
利用 SIGEX筛选的方法从文库中筛选到了 3个新
的编码几丁质酶的基因。RaviRanjan等[25]也利用
SIGEX的方法从一个小型湖泊的宏基因组文库中
筛选到了 11个编码脂肪酶的基因。编码脂肪酶的
新基因也曾从一个碱性湖泊的宏基因组文库中筛
选得到[26]。另外,从湖泊宏基因组文库中还鉴定到
了编码甘油脱水酶、甲烷单加氧酶、脱氢酶等[27,28]。
相信随着高通量的宏基因组文库筛选品平台的建
立,外源基因在宿主菌中难以表达等难题的解决,
湖泊微生物宏基因组的研究将会得到更快的发展,
从而造福于人类。
2 湖泊微生物多样性研究展望
由于分子生物学技术本身的局限性以及微生
物在湖泊 C、N循环中所起作用的机制研究的缺
乏,使得人们对湖泊微生物的基因组、代谢以及多
样性还所知甚少,筛选得到功能基因还面临着较大
的挑战。因此,利用现代分子生物学技术,提出新的
实验思路,设计新的分离未知湖泊微生物的实验手
段,从而从湖泊自然环境中分离到新的不可培养的
微生物,并且了解它在湖泊生态环境中的作用,是
能够充分了解湖泊自然环境中微生物多样性的秘
密并利用湖泊微生物资源的重要前提。
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(下转第74页)
龚世杰等:湖泊微生物多样性研究进展 57
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
(上接第57页)
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