全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
南方红豆杉 10去乙酰巴卡亭 10乙酰转移酶
基因的克隆与生物信息学分析
程抒劼 黄仕杰 郭丽琼 韩飞 林俊芳
(华南农业大学食品学院 华南农业大学生物质能研究所,广州 510640)
摘 要: 对中国重要药用植物南方红豆杉中的 10去乙酰巴卡亭 10乙酰转移酶 ( DBAT )基因进行分离、测序以及生
物信息学分析。根据 GenBank中已登录的 10去乙酰巴卡亭 10乙酰转移酶 ( DBAT )基因 cDNA序列设计引物, 采用 RT
PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了 1个 DBAT基因 TcDBAT的全长 cDNA。结果显示, T cDBAT cDNA含有 1个 1 323 bp
的开放阅读框 ( open read ing fram e, ORF ),编码 440个氨基酸,对应基因组序列含有 1个内含子。TcDBAT蛋白 N端含有 5个
N酰基化作用位点和 2个保守的 N糖基化作用位点,具有 1个保守的 B ig1结构域, 多个重要的磷酸化位点以及 1个类似钙
结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明, T cDBAT属于转移酶超家族 ( transfe r
ase superfam ily), 是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白, 能够催化 10去乙酰巴卡亭 ( 10DAB) 10位的乙酰化,从而生成抗
癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体 巴卡亭。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关
键酶基因达到提高其半合成前体巴卡亭产量的目的,并且为进一步利用组合表达系统商业化生产紫杉醇奠定基础。
关键词: 南方红豆杉 紫杉醇 10去乙酰巴卡亭 10乙酰转移酶 基因克隆 生物信息学分析
C loning and Sequence Analysis of 10Deacetylbaccatin
10OAcetyl Transferase Gene from Taxus chinensis var. mairei
Cheng Shujie Huang Shijie Guo L iqiong H an Fei L in Junfang
(College of Food Science, Institute of B iomass Energy, South China Agricultural University, Guangzhou 510640)
Abstrac:t It a im ed at iso lating and b io in fo rm atics ana lyz ing the gene encod ing a 10 deacety lbaccatin 10O ace ty l transfe r
ase( DBAT ) in Taxus ch inensis var. m airei, am edicina l plant o f the Chinese endem ic genera. By using the prim ers wh ich w ere designed
according to the cDNA sequence deposited in the GenBank database, an RTPCR clon ing stra tegy was em ployed to am plify a fu llleng th
cDNA ( designated as TcDBAT ) . The tem plate o f this amp lication was the tota l RNA iso lated from leaves o f Taxus chinens is var.
m airei. T cDBAT has an open read ing fram e ( ORF) o f 1 323 bp co rrespond ing to a deduced prote in of 440 residues and one intron w as
found in the genom ic sequence. TcDBAT conta ined 5 predicted Nterm ina l acety lation s ite and two conse rved Ng lycosy lation s ite in the
Nterm ina l reg ion, a conserved B ig1 ( bacter ia l Iglike dom ain 1) dom a in pro file, mu ltiphosphorylation sites and a Ca lpon inlike repeat
profile. Sequence hom o logy compar ison, phy logene tic ana lysis and advanced structures pred ic tion a ll suggested tha t TcDBAT is a func
tional enzym e wh ich be long ing to the transferase superfam ily. It ca talyzes the ace tylation of theC10 hydroxy l group o f the advancedm e
tabo lite 10deacety lbaccatin ( 10DAB) to y ield bacca tin , the last d iterpene interm ed ia te in the Taxo l bio syn thetic pathw ay. W ith
successful c lon ing and charac teriza tion o f re lated gene involved in b iosynthesis of bacca tin III, it may be feasib le to augm ent the sem i
synthetic approaches in produc ing the imm ediate diterpeno id precursor o f Taxo l and, u ltim ate ly, to replace them entire ly w ith the comb i
national expression system for enhanced Taxo l production.
收稿日期: 20100925
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30671457, 30871768, 31071837) ,国家 863资助项目 ( 2006AA10Z301 )
作者简介:程抒劼,女,博士研究生,研究方向:生物质资源的综合利用; Em ai:l s jcheng1984@ 163. com
通讯作者:林俊芳,男,研究员,博士生导师, Em ai:l jun fang lin2003@ yahoo. com. cn
Key words: Taxus chinensis var.m airei Taxo l 10deacety lbaccatin 10O ace tyl transferase G ene clone B io informa tics
analysis
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
紫杉醇 ( Taxol)是从红豆杉科 ( Taxaceae )红豆
杉属 (Taxus spp. )植物中分离得到的一种四环二萜
酰胺类化合物,因具有广谱强效的抗癌活性和独特
的抗癌机理而受到人们的普遍重视 [ 1, 2]。但由于其
资源十分匮乏,单纯从含量极低且生长缓慢的天然
红豆杉植物中提取紫杉醇远远无法满足临床用药需
求,药源问题亟待解决 [ 3 ]。目前, 紫杉醇的生产主
要依靠化学半合成的方法, 即以其前体物质作为合
成的起始物,从侧链合成开始需要约 10个步骤合成
紫杉醇,这在一定程度上可以改善紫杉醇供应的短
缺情况。人们正在积极试图通过研究紫杉醇生物合
成途径中关键酶及其基因, 利用基因调控技术来提
高紫杉醇半合成前体 (巴卡亭等 )的产量 [ 4, 5]。
紫杉醇生物合成过程中总共发生 5个酰基转移
反应, C10羟基组上的乙酰化是发生在紫杉烷环母
核上的最后一步修饰反应, 产物为紫杉醇生物合成
途径中的最后一个双萜中间体 巴卡亭 。作为
催化该步反应的酶, 10去乙酰巴卡亭 10乙酰转
移酶 ( DBAT)在紫杉醇的生物合成过程中发挥了关
键的作用 [ 6]。 2000年, W a lker等 [ 7]首次将该基因克
隆,并在大肠杆菌中进行了功能鉴定。南方红豆杉
又称美丽红豆杉 (Taxusma irei) ,为红豆杉科红豆杉
属,主要分布于长江流域、南岭山脉山区及河南、陕
西 (秦岭 )、甘肃、台湾等省的山地或溪谷, 是红豆杉
属植物在我国分布最广泛的一种, 与同属其他各种
相比, 资源储量相对较大, 具有重要的研究价值 [ 8]。
紫杉醇前体生物合成途径的分子生物学研究是
开展紫杉醇基因工程的必要前提。本研究根据已报
道的东北红豆杉 DBAT序列 ( AF193765)设计引物,
以南方红豆杉 cDNA为模板, 通过 RTPCR技术获
得了和已注册的 DBAT 序列同源性很高的一个
cDNA序列, 同时还首次获得了该 cDNA序列相对应
的基因组序列。利用生物信息学手段对该基因的结
构与推导的蛋白质序列进行了系统分析, 进而为紫
杉醇代谢工程提供候选基因和作用靶点。
1 材料与方法
1. 1 材料、菌株及主要试剂
南方红豆杉 (Taxus chinensis var. ma irei)树苗购
自广东省韶关市金山地红豆杉科技有限公司。大肠
杆菌 (E scherich ia coli)菌株 DH5为本实验室保存。
ExTaq( TaK aRa), dNTP( TaKaRa) , PrimeScr ipt
TM
RT
PCR试剂盒 ( TaKaRa) , pGEM T Easy vector试剂盒
( P rom ega), 胶回收试剂盒 (天根生化科技有限公
司 ) ,质粒提取试剂盒 (天根生化科技有限公司 ), 植
物 RNA提取试剂盒 (天泽基因工程有限公司 ) , 其
他试剂为国产分析纯。
1. 2 总 DNA及总 RNA的提取
称取 0. 1 g南方红豆杉的幼嫩叶片在液氮中研
磨,按照天泽基因工程有限公司植物 RNA提取试剂
盒说明书提取南方红豆杉总 RNA,紫外和 1%琼脂
糖电泳检测。以幼嫩的南方红豆杉叶片为材料利用
CTAB法提取基因组 DNA。
1. 3 引物设计与合成
根据已报道的东北红豆杉 (Taxus cusp idate )
DBAT基因的 cDNA序列 ( GenBank登录号: AF193
765),运用引物设计软件 PrimerPrem ier 5. 0和 O li
go60设计一对引物, 分别为 13F (正向引物 ) : 5
GCAGTTGAAGATTTTCTGAGCT3和 13R (反向引
物 ): 5CAGCTCCACAACTTATTCTGAA3, 引物由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1. 4 DBAT序列的获得
以南方红豆杉总 RNA为模板,按照 TaKaRa公司
PrimeScript
TM
RTPCR试剂盒说明书反转录成 cDNA。
以反转录合成的 cDNA为模板,用上述设计的引物进
行 PCR扩增。反应体系包括 cDNA 5. 0 L, 10 Ex
Taq Buffer 50 L, 25mmo l/L, dNTP 20 L, ExTaq
05 L, 引物终浓度 02 mo l/L, 终体积为 50 L。
反应程序: 94 预变性 5 m in,然后进行 35个循环:
94 40 s, 52 45 s, 72 2 m in,循环结束后 72 延
伸 8m in。PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
回收 PCR产物,连接、转化,蓝白斑筛选,测序。然后
以南方红豆杉基因组 DNA为模板,用上述设计的引
物进行 PCR扩增。反应体系: 100 ng DNA, 10 Ex
Taq Buffer 5. 0 L, 2. 5mmo l/L, dNTP 2. 0 L, ExTaq
0. 5 L,引物终浓度 0. 2 mol/L,终体积 50 L; 反应
程序:同前。切胶回收,连接克隆,测序。PCR产物回
收参照天根生化科技有限公司胶回收试剂盒说明书;
DNA连接参照 pGEM T Easy vector试剂盒说明书;热
激转化 DH5感受态细胞;华大基因科技有限公司
测序。
108
2011年第 1期 程抒劼等:南方红豆杉 10去乙酰巴卡亭10乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析
1. 5 DBAT基因的生物信息学分析
基因和蛋白质同源性分析利用 NCB I提供的
B last完成; 核苷酸序列翻译由 NCBI提供的 ORF
finder完成;基因结构分析利用软件 DNassist 2. 0以
及 NCB I提供的 Splign完成; 蛋白的理化性质利用
ExPASy中的相关工具预测;信号肽和亚细胞定位分
别利用网站 S igna lP和 PSORT进行预测; 利用网站
Co ils预测蛋白的卷曲螺旋; 应用 TM pred软件以及
EMBL提供的 SMART服务器分别进行跨膜区和结
构域分析; 利用蛋白模序数据库 Motif scan搜寻已
知功能基序 ( mot if) ; 蛋白质二级结构通过网站
SOMPA进行预测;利用网站 SW ISSMODEL进行蛋
白质同源性建模; 分子系统进化树在软件 C lustaWl
及 MEGA 4上进行, 采用 N eighborjo ining方式重复
运行 1 000次。
2 结果与分析
2. 1 南方红豆杉 DBAT cDNA基因的克隆及结构分析
以南方红豆杉总 RNA为模板,利用 RTPCR技
术获得 1条特异性扩增的条带, 经 1. 0%的琼脂糖
凝胶电泳检测大小约为 1. 4 kb (图 1A ), 命名为
TcDBAT;以南方红豆杉基因组 DNA为模板, 13F和
13R为引物, PCR扩增,获得 1条大小约为 16 kb的
条带 (图 1B),命名为 Tc13DBAT。测序后 TcDBAT
和 Tc13DBAT的实际长度分别为 1 402 bp和 1 636
bp。对 T cDBAT序列进行比对,结果 (图 2)显示,与
南方红豆杉 DBAT基因的 mRNA序列 ( AY365031. 2)
相似性达到 99% ,存在 9个碱基的差异。TcDBAT
序列含有 1个完整的开放阅读框 ( 1 323 bp),推测其
编码 440个氨基酸, 起始和终止密码子分别为 ATG
和 TGA。Tc13DBAT序列含有 1段内含子, 大小为
221 bp,它把整个基因分为两个外显子,并且外显子
区与 TcDBAT序列完全一致。这些结果表明,已经
成功克隆出南方红豆杉 DBAT cDNA基因。
M.分子量标准; 1. cDNA扩增产物; 2.基因组 DNA扩增产物
图 1 南方红豆杉 DBAT cDNA( A)和
基因组 DNA( B)扩增结果
图 2 TcDBAT核酸序列和推导氨基酸序列
109
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
2. 2 TcDBAT的生物信息学分析
经预测得到 TcDBAT蛋白的相对分子质量是
49. 2 kD,等电点为 6. 48, 其中含有 51个带负电荷
的氨基酸残基和 49个带正电荷的氨基酸残基, 符合
大多数乙酰转移酶的基本性质。不稳定指数 ( insta
b ility index)为 35. 52, 在酵母和大肠杆菌中的半衰
期分别大于 20 h和大于 10 h, 是一个相对稳定的蛋
白。脂肪族氨基酸指数 ( aliphat ic index )较高, 达到
8943,这是由于其中含有较多的亮氨酸 ( Leu)。总
平均疏水值 ( grand average of hydropathic ity, GRAVY )
为 - 0. 067,含有 145个疏水性氨基酸残基,是个亲水
性蛋白 (图 3)。该氨基酸序列不含有信号肽、卷曲螺
旋和叶绿体、线粒体转运肽,为非分泌型蛋白。亚细
胞定位预测结果显示,该蛋白 69. 6%存在于细胞质
内, 21. 7%存在于细胞核, 过氧化物酶体和线粒体中
各含有 4. 3%,由此推测其催化的转酰基作用主要发
生在细胞质内。功能基序分析结果显示, TcDBAT蛋
白 N端含有 5个 N酰基化作用位点和两个保守的 N
糖基化作用位点, 5个酪蛋白激酶 II磷酸化作用位
点, 5个蛋白激酶 C磷酸化作用位点, 1个酪氨酸激酶
磷酸化作用位点, 1个保守的B ig1结构域以及 1个类似
钙结合蛋白重复结构。跨膜区分析表明, 这是一个膜
蛋白,其中第 149- 168位之间有一明显的跨膜螺旋,其
N端在胞内,方向为由胞内到胞外;同时第 146- 165位
之间也有一明显的跨膜螺旋,方向为由胞外到胞内。
TcDBAT蛋白的结构域位于其氨基酸序列的第 7位
和第 432位之间, 这表明它与催化植保菌素生物合
成第一步反应的邻氨基苯甲酸盐N乙酰转移酶, 催
化长春多宁生物合成最后一步反应的去乙酰基长春
多宁 4乙酰转移酶以及单端孢霉烯 3乙酰转移酶
同属于转移酶超家族。
峰值大于零为疏水性峰,峰值小于零为亲水性峰
图 3 TcDBAT蛋白的疏水性图谱
TcDBAT蛋白的二级结构预测结果显示, 其中
含有 31. 82%的 螺旋, 19. 32%的延伸链, 3. 86%
的 转角和 45. 00%的无规则卷曲。纵观该蛋白的
整体结构, 螺旋和无规则卷曲是其中主要的结构
元件, 而延伸链和 转角则散布于整个蛋白之中。
对 TcDBAT的三级结构进行预测,结果 (图 4)显
示,其总体上呈现椭球状结构,由大量的 螺旋通过随
机卷曲连接而成,这些 螺旋环绕形成一个袋状空腔,
其空腔口部为底物结合与碳链延伸的活性部位。
将 TcDBAT的推导氨基酸序列在 NCBI网站上
进行在线 B lastp同源性比对,结果显示,它与其它不
同物种来源的 DBAT氨基酸序列的同源性在 97% -
98%之间,这些序列包括 (中国 )红豆杉 (Taxus walli
chiana var. chinensis ) DBAT序列 (ABW842431), 东北
红豆杉 (Taxus cusp idate) DBAT序列 (AAF276211),加
拿大红豆杉 (Taxus Canadensis) DBAT序列 ( ABW84
2351), 墨西哥红豆杉 (Taxus globosa ) DBAT 序列
(ABW842461),短叶红豆杉 (Taxus brevifolia ) DBAT序
列 (ABW842441),南洋红豆杉 (Taxus sumatrana)DBAT
序列 ( ABW842451), 西藏红豆杉 (Taxus w allichiana )
DBAT序列 (ABW84237. 1),枝孢芽枝菌 (C ladosporium
cladosp orioides)DBAT序列 ( ACA48517. 1),曼地亚红豆
杉 (Taxus media) DBAT序列 (ABK411941),喜马拉雅
红豆杉 Taxus fauna DBAT序列 ( ABW 842381), 欧洲
110
2011年第 1期 程抒劼等:南方红豆杉 10去乙酰巴卡亭10乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析
红豆杉 (Taxus baccata ) DBAT序列 (ABW84242. 1),亮
白曲霉 (Asp erg illus candidus)DBAT序列 ( ACI470631)。
同源性分析结果进一步表明, TcDBAT是紫杉醇生物
合成途径上的功能基因, 编码 10去乙酰巴卡亭10
乙酰转移酶 (DBAT)。通过最大简约法构建系统进化
树 (图 5),从图中可以看出, TcDBAT的推导氨基酸序
列与中国红豆杉 DBAT 基因成熟肽氨基酸序列
(ABW84243. 1)在进化上很接近,有可能从同一祖先平
行进化而来。
图 4 TcDBAT的三级结构
进化树下的标尺表示遗传距离,树枝上的数字为置信度值
图 5 DBAT的分子系统进化树
3 结论与讨论
目前, 目的基因克隆的方法主要有基因组文库
或 cDNA文库法、PCR方法等 [ 9]。本试验根据已报
道的东北红豆杉 DBAT基因的 cDNA序列, 在其 5
和 3端设计引物, 扩增出南方红豆杉 DBAT基因的
编码区序列,为通过基因工程途径利用该重要功能
基因调节紫杉醇的合成代谢奠定基础。基因结构分
析显示,该基因属于断裂基因类型,这在高等植物中
较为常见。Guo等 [ 10 ]利用半定量 RTPCR的方法对
曼地亚红豆杉 DBAT基因进行表达谱分析,结果显
示,该基因是一个组织特异性基因,其在叶片中的表
达最强,茎中表达较弱而在果实中检测不到表达。
本研究在前人的基础之上, 以南方红豆杉的叶片为
材料, 成功获得目的基因, 从而可以推测该基因可能
至少参与了叶片中叶绿素的合成, 但尚需进一步的
试验确证。
红豆杉属约 11种,分布于北半球。我国有 4个
种和 1个变种,它们分别是西藏红豆杉 Taxuswallichi
ana、东北红豆杉 (Taxus cusp idate )、云南红豆杉 (Taxus
yunnanensis)、(中国 )红豆杉 Taxus w allichiana var.
chinensis和南方红豆杉 Taxus chinensis var. mairei[ 11]。
TcDBAT分子系统进化分析结果显示, 它与 (中国 )
红豆杉 DBAT基因成熟肽氨基酸序列在进化上很接
近, 从分子进化的角度论证了前人根据传统形态特
征得出的推论,即不应将南方红豆杉和 (中国 )红豆
杉分成为两个独立种,而应该将南方红豆杉认定为
(中国 )红豆杉的变种 [ 11]。
纵观目前在寻找及扩大紫杉醇药源方面的不同
研究领域,培育高产紫杉醇的红豆杉栽培品种所需
周期长、效率低,紫杉醇产量提高有限; 紫杉醇化学
全合成虽然已经取得成功,但是合成的步骤复杂,其
他有毒或无用的副产品多,紫杉醇产率太低,这使得
紫杉醇的全化学合成成本高且不具备商业前景; 生
产紫杉醇的微生物绝大多数是与红豆杉共生的真
菌, 紫杉醇含量极微,并且这些真菌的培养和大规模
发酵都很困难, 菌株的衰退也是一个难题, 目前为
止尚未见产业化前景。随着紫杉醇代谢途径的逐
步阐明, 通过在微生物中构建紫杉醇代谢途径, 利
用 微生物工厂 来大量生产紫杉醇前体, 进而通
过化学半合成的方法生产紫杉醇较为可行。同
时,将植物次生代谢途径中的关键酶基因导入植
物或其他物种中高效表达用于生产有用的次生代
111
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
谢物质已有诸多成功报道, 因而代谢工程是将来
生产紫杉醇的理想途径, 具有广阔的发展前景 [ 12]。
目前,本实验室已建立了成熟的食药用菌遗传转
化体系,并且成功构建出含有南方红豆杉 DBAT基
因以及多个紫杉醇生物合成途径关键酶基因的食
药用菌表达载体, 有望通过紫杉醇生物合成途径
的分子生物学研究为进一步利用组合表达系统商
业化生产紫杉醇奠定基础。
参 考 文 献
[ 1 ] Sch iff PB, Fan t J, H orw itz SB. Prom ot ion ofm icrotubu le assem b ly in
v itro by taxo.l Natu re, 1979, 277: 665667.
[ 2] 梅兴国,鲁明波,李春光.紫杉醇的抗癌作用及治疗其他疾病的
潜力.国外医学 药学分册, 1996, 23( 3 ): 136140.
[ 3] C raag GM, S cheparat SA, Su ffnessM, et a.l The taxol supp ly crisis.
New NC I policies for hand ling th e largescale p roduction of novel
natu ral p roduct an ticancer and ant iH IV agen ts. JNat Prod, 1993, 56
( 10 ): 16571668.
[ 4] 滕文静,胡新玲,王伟,等.紫杉烷 13羟基化酶基因的克隆及
其转化烟草的研究.中国生物工程杂志, 2008, 28( 2 ) : 5358.
[ 5] B alog lu E, K ingston DG. A new sem isyn th es is of paclitaxel from b ac
catin III. J Nat Prod, 1999, 62 ( 7) : 10681071.
[ 6] 孔建强,王伟,朱平,等.紫杉醇生物合成的研究进展.药学学报,
2007, 42( 4 ): 358365.
[ 7] Walker K, CroteauR. M olecu lar clon ing of a 10d eacetylb accatin III
10Oacetyl tran sferase cDNA from Taxus and fun ct iona l expression
inE sch erichia coli. ProcN at lAcad S ciUSA, 2000, 97( 2 ) : 583587.
[ 8] 张嫚丽,霍长虹,董玫,等.美丽红豆杉中非紫杉烷类化学成分的
研究.中国中药杂志, 2007, 32 ( 14) : 14211425.
[ 9] 沈湛云,刘春生,王学勇.甘草 香树酯醇合成酶的编码区克隆
与序列分析.中国中药杂志, 2009, 34( 19) : 24382440.
[ 10] Guo BH, K aiGY, Gong YF, et a.l M olecu lar clon ing and heterolo
gous expression of a 10deacety lbaccatin III10Oacetyl tran sferase
cDNA from Taxu s xm ed ia. M ol B io lRep, 2007, 34 ( 2) : 8995.
[ 11] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志 [M ] .北京:科
学出版社, 1978: 436448.
[ 12] 刘万宏,姚波,祝顺琴,等.紫杉醇前体生物合成途径及生物技
术研究进展.中草药, 2009, 40 ( 8) : 13271331.
(责任编辑 李楠 )
112