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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 2期
番茄 LeNHX1基因植物过量表达载体的构建及表达分析
范晶 雷常安 黄明远 刘超 梁梓 陈丽萍 王永建
(乐山师范学院化学与生命科学学院 峨眉山生物多样性保护与利用研究所,乐山 614004)


摘
要:
从番茄幼苗中提取 RNA,根据 NCB I中番茄 LeNHX1基因序列设计引物 ,通过 RT
PCR获得了番茄 LeNHX1基
因的 cDNA序列, 包含一个 1 605 bp的开放阅读框,编码 534个氨基酸。将 cDNA序列连接到植物过量表达载体 PBI121上,对
所获得的重组质粒进行双酶切鉴定, 结果表明,植物过量表达载体 PB I121
LeNHX1已构建成功。半定量 RT
PCR结果表明
LeNHX1基因在根、茎和叶中均表达, 盐、低温和脱落酸的诱导能提高 LeNHX1基因的表达量, 推测番茄 LeNHX1基因在逆境
应答中可能起着重要作用。
关键词:
番茄 LeNHX1基因 植物过量表达载体
Expression Analysis and Construction of Plant
Over
expression Vector of Tomato LeNHX1Gene
Fan Jing Lei Changan HuangM ingyuan L iu Chao L iang Z i Chen L ip ing W ang Yongjian
(K ey Laboratory of P ro tection and U tilization of B iodiversity, College of Chem istry and L ife Science, LeshanN ormal University, Leshan 614004)


Abstrac:t
To tal RNA was ex tracted from the tom a to young seed ling, cDNA was obta ined by reve rse transc ription po lym erase chain
reaction. P rim e rs w ere designed acco rding to tom ato LeNHX1 gene sequence o f NCBI, then the target LeNHX1 gene was am plified by
RT
PCR protoco.l the nucleotides fragm ent o f LeNHX1 gene inc luding an ORF( 1605 bp), encoding 534 am ino ac ids, The transcr ipt of
wh ich was connec ted to p lant over
express ion vec to r PBI121. The doub le d igestion o f recom binant plasm id resu lt show ed that the plant
over
expression vectors w ith LeNHX1 was constructed successfu lly. The results of RT
PCR show ed that LeNHX1 w as expressed in
roo ts, stem s and leaves, the express ion level w as induced by salt, low temperature and ABA stress. W e suggest the LeNHX1 gene could
p lay an important ro le o f stress response in tom a to.
Key words:
Toma to( Ly cop er sicon esculentum )
LeNHX1 gene P lan t over
expression vector
收稿日期: 2009
11
09
基金项目:四川省教育厅基金资助项目 ( 08Zb051) ,乐山师范学院科研项目 ( Z0858) ,峨眉山生物多样性保护与利用研究所科研项目 ( 08S04)
作者简介:范晶,男,讲师,博士,从事植物分子生物学研究工作; E
m ai:l fan jing972001@ sohu. com
土壤盐渍化能够导致植物体内的 Na+浓度偏
高,可对植物造成渗透胁迫并破坏细胞内离子浓度
的平衡状态,影响作物的正常生长发育并降低其产
量。目前,中国约有 1亿 hm2的土地受到盐渍化的
威胁 [ 1] , 提高作物耐盐能力, 已成为植物基因工程
研究的一项重要课题。NHX基因编码质膜或液泡
膜 N a+ /H +反转运蛋白, 可将细胞质中过多的 N a+
排除到细胞外部或区隔化到液泡中, 从而达到保护
细胞的目的。目前, 已有许多植物的 N a+ /H+反向
转运蛋白 NHX基因被克隆并被证明与植物的耐盐
性有关 [ 2- 5]。番茄 LeNHX2基因是在番茄中第一个
被发现的编码 NHX蛋白的基因, 其在高盐环境中能
够使细胞内部维持较高的 K+浓度,具有调节 PH值
和渗透压、提高作物耐盐性的功能 [ 6, 7] , 番茄 LeN

HX1基因也属于 Na+ /H+反转运蛋白家族成员,但目
前关于其生物学功能和表达特性的研究还未见报道,
本研究克隆了番茄 LeNHX1基因, 构建了其植物过量
表达载体并分析了该基因的表达特征,为进一步研究
该基因的功能、挖掘新的抗逆基因奠定了基础。
1 材料与方法
1
1 材料
大肠杆菌 JM 109由乐山师范学院分子生物学
2010年第 2期 范晶等:番茄 LeNHX1基因植物过量表达载体的构建及表达分析
实验室提供;植物表达载体 PB I121由四川大学刘永
胜教授惠赠; T4DNA连接酶购自成都微克生物技术
有限公司; PCR产物平端连接试剂盒 pEASY
B lunt
C lon ing K it购自北京全式金生物技术有限公司; 限
制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、DEPC和 Trizol
购自成都博瑞克生物技术有限公司。
1
2 方法
1
2
1
用于 LeNHX1基因全长 cDNA克隆的 PCR
引物的设计和合成 根据番茄 LeNHX1基因序列
( GenBank登录号: A J306630) , 利用 Pr imer Prem ier
5
0软件设计巢式 PCR特异基因扩增引物, 由上海
Inv itrogen公司合成。第一轮 PCR上游引物 ( F1)为
5

AGTTGAATGAAATAGTAGGTGGAGT
3
, 下游引
物 ( R1)为 5

TTAGCTCCGCCTTTATCATAGT
3
;第
二轮 PCR上游引物 ( F2)为 5

CACTTAGTGAACCT

GCTGACACA
3
; 下游引物 ( R2 ) 为 5

TTCAA

GAAACTC TGCTGCGTT
3
。
1
2
2
植物材料的处理及 RNA提取 将番茄品种
(Ly copersicon esculentum M il.l cv. A ilsa craig )成熟种子
用 5%次氯酸钠灭菌消毒后放置于 1/2M S培养基上
发芽,温度为 25
,种子萌发前暗培养一周左右,之后
用光照培养,光周期为 16 h光照和 8 h黑暗, 光照培
养 1周左右后, 将幼苗按以下条件进行诱导: NaC l
( 200mM NaC l)、甘露醇 ( 150mM )、低温 ( 4
)、脱落
酸 ( 10
M ),诱导时间为 6 h。RNA提取时取适量未
诱导和采用上述各种条件诱导的材料用液氮研磨处
理,按每 100mg样品中加入 1mL Trizo l提取液并混
匀,具体操作方法参照 RNA提取试剂盒说明书。
1
2
3
番茄 LeNHX1基因全长 cDNA的克隆及 DNA
测序 以未诱导的番茄幼苗 RNA为模板, 参照反转
录试剂盒进行第一链 cDNA合成。LeNHX1基因扩增
采用巢式 PCR进行, PCR 反应条件: 95
预变性
3m in,随后 94
变性 50 s, 56
退火 40 s, 72
延伸
2
0m in, 33个循环,最后 72
保温 10m in。反应结束
后,取 1
L产物作为 DNA模板进行第 2轮 PCR扩
增,其余成分与第 1轮 PCR反应相同。扩增结束后
采用 PCR产物平端连接试剂盒直接将回收纯化后的
高保真 PCR产物与平末端克隆载体 pEASY
B lunt在
室温下进行连接,连接时间为 15 m in, 然后转化大肠
杆菌 JM 109感受态细胞, 涂布于含氨苄青霉素 ( 50

g /mL)的抗性平板上培养,待长出单菌落后,采用通
用的 M13F引物和第二轮 PCR扩增的下游引物 ( R2)
进行 PCR反应,验证重组质粒中外源 DNA片段的插
入方向,挑选出能够产生扩增条带的含 pEASY
Blunt

LeNHX1重组质粒的单菌落送上海 Inv itrogen生物技
术有限公司进行 DNA测序。
1
2
4
植物过量表达载体 PB I121
LeNHX1的构建
及鉴定 由于克隆载体 pEASY
B lun和植物过量表
达载体 PB I121上均带有 Xba I和 BamH I酶切位
点, 采用这两种限制性内切酶分别对含 35S启动子
的植物过量表达载体 PB I121质粒和含有 LeNHX1
基因的 pEASY
B lunt
LeNHX1重组质粒进行双酶切
(时间为 5 h,温度为 37
), 酶切后将目的片段进行
回收纯化并进行混合,加入 T4连接酶后放置于 16

进行过夜连接,连接产物再转化大肠杆菌 JM 109感
受态细胞并涂布于含卡那霉素 ( 50
g /mL)的抗性
平板上, 37
培养过夜后挑选单菌落于含卡那霉素
抗生素的液体培养基中培养, 提取重组质粒并进行
酶切鉴定, 构建好的重组质粒命名为 PB I121
LeN

HX1, 构建流程示意图如图 1。
图 1
植物过量表达载体 PBI121
LeNHX1构建示意图
95
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 2期
1
2
5
LeNHX1基因组织特异性表达及不同逆境
条件下的表达分析 采用半定量 RT
PCR方法, 对
未诱导的番茄幼苗的根、茎和叶进行组织特异性
表达检测, 同时分析用盐、甘露醇、低温和脱落酸
等逆境条件进行诱导处理后番茄 LeNHX1基因在
幼苗茎中的表达情况, 用于 LeNHX1基因半定量
RT
PCR的上游引物为 5
– ACGATATGGTGGGCT

GGTTTA
3
, 下游引物为 5

GATCACATCCTCCCT

TTGACA
3
; 采用番茄 U bi3基因作为内参 ( GenBank
登录号: X58253), 上游引物为 5

AGAA
GAAGAC

CTACACCAAGCC
3
,下游引物为 5

TCCCAAGGGT

TGTCACATACATC
3
。 PCR反应条件为: 94
预变
性 5m in;随后 94
变性 30 s, 55
退火 30 s, 72
延
伸 30 s, 28个循环,最后 72
保温 10 m in。
2 结果和分析
2
1
逆转录 PCR扩增 LeNHX1基因全长 cDNA
通过 RT
PCR扩增获得 LeNHX1基因, 反应物
经 0
7%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如图 2所示。
由图可知扩增片段大小和预期大小一致, 长度为
1
69 kb。
图 2
LeNHX1基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
2
2 番茄 LeNHX1基因全长 cDNA的测序及结果
分析
采用 DNA分析软件 Sequencher对含 pEASY

B lunt
LeNHX1重组质粒的 DNA测序结果进行分
析, 发现所克隆到的 LeNHX1序列 (来源番茄品种
A ilsa craig )与 GenBank的 LeNHX1序列 (来源番茄
品种 Moneymaker)相比, 在开放阅读框内共有 7个
不同碱基,其中在开放阅读框内部 160 bp、497 bp和
1 142 bp三处位置的碱基的差异导致相应的氨基酸
变化,在 444 bp、744 bp、984 bp和 1 149 bp位置的
碱基也不同但未导致氨基酸发生变化 (图 3), 采用
DNAMAN软件进行同源性分析,发现两者之间核酸
的同源性为 99
56%,氨基酸的同源性为 9
44%。
G enB ank LeNHX1为 GenB ank中 LeNHX1基因序列; C lon ed LeNHX1为试验所克隆的 LeNHX1基因序列
图 3
番茄 LeNHX1基因测序结果分析
2
3
PBI121
LeNHX1重组质粒鉴定
挑选含有 PB I121
LeNHX1重组质粒的单个
菌落, 于含卡那霉素的抗性液体培养基中培养,
提取 PB I121
LeNHX1重组质粒并用限制性内切
酶X ba I和 BamH I双酶切。结果如图 4, 酶切后
产生两条片段, 其中小片段约 1
7 kb, 大小与预
期相符, 说明植物过量表达载体 PB I121
LeNHX1
已成功构建。
2
4
LeNHX1基因组织特异性表达及不同胁迫条
件下的表达分析
用半定量 RT
PCR分析了 LeNHX1基因在番茄
幼苗不同组织中的表达情况及盐、甘露醇、低温和脱
落酸对该基因表达的调控, 结果发现在没有胁迫情
况下, LeNHX1基因在番茄幼苗的根、茎和叶中表现
为组成型表达 (图 5
A),采用不同胁迫条件处理 6 h
后, 在茎部组织中, 盐、低温和脱落酸能够诱导 LeN

96
2010年第 2期 范晶等:番茄 LeNHX1基因植物过量表达载体的构建及表达分析
HX1基因的表达且基因表达受低温诱导最为显著
(图 5
B)。
M. M arkerIII; 1. PBI121
LeNHX1 重组质粒 X ba I 和
BamH I双酶切结果; 2. pEASY
B lunt
LeNHX1重组质粒
X ba I和 BamH I双酶切结果; 3. pEASY
B lun t
LeNHX1
重组质粒为模板 PCR扩增得到的 LeNHX1片段
图 4
PBI121
LeNHX1重组质粒鉴定结果
A.未处理状态下 LeNHX1基因在根、茎和叶中的表达;
B.不同胁迫处理时茎部 LeNHX1基因的表达
图 5
LeNHX1基因的表达模式
3 讨论
土壤中过高的盐浓度能够对植物生长造成许多
不利影响,如降低光合能力、加速细胞衰亡等, 现有
研究证明通过转单一的 Na+ /H +反转运蛋白就可提
高植物的耐盐能力 [ 8]。基因组测序计划的进行揭
示植物中包含大量的 Na+ /H +反转运蛋白,但目前
对它们功能的研究还处于起始阶段 [ 9] , 本试验对所
克隆到的番茄 LeNHX1基因测序结果进行分析时发
现,其序列 (来源番茄品种 A ilsa craig)与 GenBank
中登录的 LeNHX1序列 (来源番茄品种 Moneymak

er)在开放阅读框的不同位置共有 7个碱基不同,其
中 3个碱基不同并导致氨基酸发生相应变化, 另外
4处碱基虽不同但并未引起编码氨基酸的变化。采
用 DNAMAN软件对序列进行分析,发现两者之间核
酸的同 源性为 99
56%, 氨基 酸的同 源性为
99
44%。我们在克隆 LeNHX1基因全长 cDNA时,
采用了 Ferm entas公司生产的高保真 P fu DNA聚合
酶, 该酶具有 3
- 5
外切校正功能, 错配率很低, 由
此我们可推测所克隆到的 LeNHX1序列与 GenBank
中的 LeNHX1在核苷酸序列上的差异可能是由于番
茄品种不同所导致的。
半定量 RT
PCR结果发现在番茄幼苗的根、茎
和叶中均有 LeNHX1基因的表达,说明该基因为组
成型表达。采用不同的胁迫方式处理 6 h后, 茎部
组织中 LeNHX1基因的表达量受盐、低温和脱落酸
的诱导而明显提高,其中以低温诱导最为有效,小麦
的 TaNHX2基因在受盐、低温、聚乙二醇和脱落酸的
诱导后, 表达量可被提高 [ 10 ]。在番杏科植物冰花
中, 茎部组织 MNhx基因的表达量在受 N aC l诱导后
同样显著提高, 这些现象和本试验的结果均很相
似 [ 11]。本研究成功构建了番茄 LeNHX1基因的植
物过量表达载体, 并对该基因的表达特性进行了相
关研究,结果表明番茄 LeNHX1基因可能在盐、低温
和脱落酸等信号途径中起着重要作用,为下一步研
究该基因的生物学功能及利用该基因进行作物改良
奠定了基础。
参 考 文 献
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174.
(下转第 101页 )
97
2010年第 2期 刘志伟等 :毛竹笋全长 cDNA文库构建
酶识别序列,对构建的表达载体文库中的基因表达
可能会产生不利影响。另外,文库中的插入片段并
非都是全长 cDNA。
毛竹笋高质量全长 cDNA文库的成功构建,为
研究竹类植物纤维素合成相关基因及纤维素合成机
理奠定了坚实的基础, 现已成功筛选出了几条 cesa
家族基因,为进一步研究提供了保障。
参 考 文 献
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