全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
毛白杨二次遗传转化体系的建立
邓伟1, 2 吕立堂 2 罗克明 3 李义 2
( 1重庆大学生物工程学院基因工程中心 重庆市高校功能基因及调控技术重点实验室,重庆 400044; 2美国康涅狄格大学
植物系,美国 06269; 3西南大学生命科学学院,重庆 400716 )
摘 要: 为了建立有效的毛白杨二次遗传转化体系, 优化了培养基激素配比、抗生素筛选浓度和乙酰丁香酮浓度。采
用卡那霉素和潮霉素筛选, GUS组织染色和基因组 DNA的 PCR检测,通过二次遗传转化将 GUS基因和潮霉素磷酸转移酶基
因 Hp t导入到毛白杨中, 获得了 60 7%二次转化频率。
关键词: 毛白杨 二次转化 农杆菌 激素
Construction ofAgribacterium mediated Retransformation
System for Populus tomentosa
DengW ei
1, 2 Lv L itang2 Luo Kem ing3 L iY i2
(
1
Genetic Engineer ing R esearch Center, Bioeng ineering College, Chongq ing University, Key Laboratory of FunctionalG ene and Regulation
Technologies under Chongq ing Municipal Education Commission, Chongq ing 400044;
2
D epartm ent of Plant Science,
University of Connecticut, USA 06269;
3
School of Life Science, Southw est University, Chongq ing 400716)
Abstrac:t To establish retransfo rm ation system forP opulus tom entosa, the facto rs wh ich cou ld a ffect g enetic transfo rma tion, in
cluding horm ones com bina tion and concentration o f acetosy ringone we re stud iedSe lected by kanam yc in and hygrom ycin, transgen ic
p lants w ere identified by using GUS sta in ing and genom ic DNA PCRThe GUS andH p t genes we re transfo rm ed into pop la r p lants
through retransform a tion and 60 7% transform a tion e fficiency was ob tained
Key words: P opu lous tom entosa Retransform ation Agrobacterium tumefaciens H ormone
收稿日期: 20081015
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30700544)
作者简介:邓伟 ( 1977) ,男 (汉族 ) ,讲师,主要从事植物分子生物学研究; Em a i:l Denw e i0718@ 163 com, Te:l 02365120485
杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种之一,
具有速生优质,轮伐期短, 适应性强, 繁殖容易,用途
广泛等特点,是世界上许多国家重要的造林绿化树
种,也是生态防护林的主要树种。它还是制浆造纸、
胶合板、包装材料等的重要工业原料 [ 1]。与其它林
木相比,杨树易于无性繁殖, 遗传转化容易, 已构建
较饱和的各种连锁图, 获得大量与目标性状相关的
分子标记。最近,由美国橡树岭国家实验室和能源
部联合基因组研究所完成了毛果杨全基因组测序草
图,发现在 19条染色体上有 45 000个基因 [ 2 ]。杨
树的这些特点,使其成为研究多年生植物重要的模
式植物 [ 3]。
毛白杨是我国特有的乡土树种, 遍布于我国黄
淮海流域 100万 km2以上的 10多个省、市、自治区。
毛白杨生长迅速,适应性强, 纤维较长, 材质优良,树
干高大通直,树形美观, 是民用、建筑、家具用材和纤
维工业的重要原料,也是杨属中最适于作为纸浆材
原料的优良树种之一。但是由于生长周期长、树体
高大,异花授粉和杂交不亲和性等原因,极大地限制
了杨树育种工作的开展。利用遗传转化技术向植物
导入外源基因,对植物改良具有目的性和方向性,因
此通过该手段对毛白杨进行遗传改良具有重要
意义。
由于植物的多数性状如产量、品质等是由多基
因控制,仅靠改变其中的某一基因很难达到改良性
状的目的,所以多基因转化策略是植物遗传改良研
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
究的主要方向 [ 4]。二次转化 ( retransformation)可以
实现 2个或多个外源基因导入受体植物中, 是进行
遗传改良和功能基因研究的有效手段 [ 5]。目前已
经在烟草、马铃薯、拟南芥、连翘等植物的遗传改良
中得到应用 [ 5]。例如, Q i等 [ 6 ]采用二次转化手段将
负责合成长链不饱和脂肪酸的 3个基因转化到拟南
芥中, 获得了富含 Omega3和 Omega6的转基因植
物。采用二次转化方法将 2个乙二醛酶基因导入到
烟草中,获得了比转化单个乙二醛酶基因植物具有
更高抗盐特性的转基因植物 [ 7]。
本试验研究了影响毛白杨转化效率的各种因
素,包括激素配比、乙酰丁香酮 ( AS)和两种抗生素
的筛选浓度,以期建立有效的二次遗传转化体系,为
毛白杨遗传改良研究奠定基础。
1 材料和方法
11 材料
供试杨树品种是毛白杨 ( Populus tomentosa
Carr),根癌农杆菌菌株 LBA4404( SM r )由本实验室保
存。研究采用 pIG121质粒载体和 pCAMB IA1302质粒
载体。
12 培养基
基本培养基是 MS[ 8]和 WPM [ 9] , 添加 3%的蔗
糖和 07%的琼脂粉, 附加不同浓度和组合的 BA、
ZT、NAA、和 IAA, 配制成 6种培养基, pH调至 58,
121 高压湿热灭菌 15m in。待培养基冷却至 60
后加入抗生素和 200mg L- 1羧卞青霉素 ( Cb)。
13 方法
131 毛白杨再生试验 在温室中选取新生健康
的叶片, 清水冲洗干净, 在 01% 的升汞中灭菌
10 m in,无菌水冲洗 4次, 将无菌的叶片切成 15~
2 cm左右大小,分别转移到 6种愈伤诱导上黑暗培
养。大约 20 d后, 在叶片周围生长出白色愈伤,将
白色愈伤切下,分别继代到分化培养基上,在光下诱
导出芽。等到不定芽生长到 2~ 3 cm高时, 统计再
生频率。
132 卡那霉素 Km筛选压试验 切取毛白杨无
菌叶片, 置于 Km浓度分别为 0、5、10、25、50、70、
100mg L- 1的分化培养基上, 20 d继代一次, 40 d
后观察外植体生长状态,确定选择压。
133 农杆菌介导的毛白杨第一次转化 将 - 80
下保存的含 pIG121质粒的农杆菌菌株 LBA4404接种
到附加 Km 50mg L- 1和 SM 125mg L- 1的 YEB培
养基平板上, 28 条件下培养 2 d后挑取农杆菌单菌
落,接种于含相同抗生素的 5 m lYEB液体培养基中,
28 , 200 r/m in振荡培养过夜。取培养过夜的农杆
菌菌液按 150的比例转接到 50m l不含抗生素,但添
加 0、100、200、500、800 g L- 15种浓度的 乙酰丁香
酮 (AS)液体 YEB培养基中,二次活化培养 3~ 5 h,待
OD600nm值达到 05~ 08时侵染切成 15~ 2 cm左右
大小的毛白杨叶盘, 10 m in后倒去菌液,将外植体转
移到共培养培养基 (愈伤诱导培养基 ), 黑暗条件下
共培养 2 d。把外植体组织转移到愈伤诱导培养基上
黑暗条件下筛选培养。大约 20 d后,叶片周围生长
出白色愈伤,将白色愈伤切下, 继代到新鲜分化培养
基上光下诱导出芽。大约 20 d诱导出抗性芽,对抗
性芽进行 GUS组织染色 [ 10]。统计不同 AS浓度下
GUS染色阳性的转化频率。GUS阳性抗性芽生长到
2~ 3 cm高时,沿基部切下,转移到附加 01 mg L- 1
NAA的生根培养基上诱导生根。植物组织培养过程
在 24~ 26 , 16 h光照 /8 h黑暗光周期, 1 500~ 2 000
lx光照强度的培养室中进行。将根系发育完整,高约
6 cm的小苗进行 7 d左右的炼苗,将基部培养基清洗
干净,移栽到温室土壤中培养。
134 潮霉素 Hyg筛选压的确定 取 GUS染色和
基因组 PCR扩增呈阳性的转基因毛白杨无菌叶片,
置于潮霉素 Hyg浓度分别为 0、05、1、15、2、25、
3、4 mg L- 1的分化培养基上, 20 d继代一次, 40 d
后观察外植体生长状态,确定选择压浓度。
135 农杆菌介导的毛白杨第二次转化 将含有
pCAMB IA1302质粒的农杆菌菌株 LBA4404活化培
养, 按照上述转化方法转化毛白杨外植体,采用潮霉
素筛选,获得抗性植株。
136 转基因植物的基因组 PCR检测 基因组
DNA的提取采用改良的 CTAB法 [ 11]。按照 pCAM
B IA1302载体上潮霉素磷酸转移酶基因Hp t序列设计
上下游引物 P1和 P2,引物序列分别是 P1: 5CTC
TATTTCTTTGCCCTCGG3; P2: 5AAAGCCTGAACT
CACCGCGA3。根据 pIG121载体上的新霉素磷酸
转移酶基因 GUS基因序列设计上下游引物 P3和 P4,
其引物序列分别是 P3: 5GGCATTCAGTCTGGATCG
78
2009年第 4期 邓伟等:毛白杨二次遗传转化体系的建立
CGAA3; P4: 5CCGAAATTGGAGAGAAATCCG3。
以基因组 DNA为模板, P1、P2、P3和 P4为引物扩增
GUS基因片段和 Hp t基因片段。反应条件为 94 , 5
m in, l个循环; 94 , 30 s, 60 , 45 s, 72 , 1 m in, 40
个 循环; 72 , 10m in。
2 结果与分析
21 激素和培养基对再生频率的影响
植物激素和培养基是影响外植体再生的关键因
素。选择了 6种植物激素和培养基配比,观察其对毛
白杨再生频率的影响 (表 1)。结果表明, WPM 1培养
基再生频率最高; WPM 1和 MS1培养基的激素组合
相同,差别仅在于基本培养基不同,表明WPM基本培
养基比 MS培养基更适合毛白杨外植体再生。
表 1 激素和培养基对再生频率的影响
培养基 基本培养基
激素配比
愈伤诱导 分化培养基
外植体
数量
不定芽外
植体数量
再生频
率 (% ) *
WPM1 WPM 1m g L- 1 NAA + 2m g L- 1 ZT 2m g L- 1 ZT 137 135 99
WPM2 WPM 1m g L- 1 6BA + 4m g L- 1 2, 4D 2m g L- 1 6BA+ 025 mg L- 1 IBA
+ 02 m g L- 1 ZT 116 68 59
WPM3 WPM
025 m g L- 1 6BA + 025 m g L- 1
IAA+ 025m g L- 1 ZT
025 m g L- 1 6BA + 025 mg L- 1
IAA+ 025 mg L- 1 ZT 128 51 40
MS1 M S 1m g L- 1 NAA + 2m g L- 1 ZT 2m g L- 1 ZT 135 114 85
MS2 M S 1m g L- 1 6BA + 4m g L- 1 2, 4D 2m g L- 1 6BA+ 025 mg L- 1 IBA
+ 02 m g L- 1 ZT 129 88 68
MS3 M S
025 m g L- 1 6BA + 025 m g L- 1
IAA+ 025m g L- 1 ZT
025 m g L- 1 6BA + 025 mg L- 1
IAA+ 025 mg L- 1 ZT 143 63 44
* 再生频率是指再生出不定芽的外植体数量占全部外植体数的百分比
22 卡那霉素 Km抗生素选择压的确定
将毛白杨的叶片置于附加不同浓度 Km 的
WPM1培养基内,检测叶片对 Km的敏感性。如图 1
所示, 毛白杨对 Km 较为敏感, 在添加 25 g L- 1
Km的培养基上,叶片不形成愈伤并逐渐褐化, 经过
40 d的筛选, 叶片的成活率只有 2%。而在超过
50 mg L- 1 Km的培养基上, 40d筛选后叶片全部褐
图 1 毛白杨叶片对 Km的敏感性
化死亡。根据结果采用 25 mg L- 1的 Km作为第一
次转化的筛选浓度。
表 2 AS对转化频率的影响
AS浓度
( g L- 1 )
外植体
数量
GUS阳性不
定芽数量
转化
频率 (% ) *
0 137 84 61
100 165 115 70
500 178 134 75
800 156 105 67
* 转化频率是指 GU S阳性不定芽数量占全部外植体数的百分比
23 乙酰丁香酮 (AS)对转化频率的影响
AS是植物遗传转化中被广泛使用的一种转化促
进剂。为确定 AS对毛白杨转化的影响,试验采用附
加 25mg L- 1Km 的 WPM1培养基, 用 0、100、500、
800 g L- 14个浓度的 AS活化农杆菌菌液,经过共
培养,愈伤诱导和不定芽诱导培养,获得抗 Km的不
定芽。由于 pIG121载体上含有 GUS报告基因, 可以
方便的使用 GUS组织染色来验证转基因植物。结果
如表 2, AS对转化频率有显著影响, 100 g L- 1的 AS
可以使转化频率比对照提高 15%, 而 500 g L- 1的
AS可使转化频率提高 23%。但是更高的 AS浓度
( 800 g L- 1 )并没有进一步提高转化频率。
79
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
24 潮霉素 Hyp抗生素选择压的确定
为了进行二次转化,将 GUS染色呈阳性的转基
因毛白杨叶片置于附加不同浓度 Hyp的 WPM1培
养基内,检测叶片对 H yp的敏感性。如图 2所示,
毛白杨对 Hyp更为敏感, 在添加 25mg L- 1Hyp的
培养基上,叶片不生长出愈伤, 并逐渐褐化死亡,经
过 40 d的筛选,叶片的成活率只有 4%。而在超过
3 mg L- 1Hyp的培养基上, 40 d的筛选后叶片全部
褐化死亡。所以在二次转化时, 采用 25 mg L- 1
Hyp作为筛选浓度。
图 2 毛白杨叶片对 Hyp的敏感性
25 二次转化毛白杨的获得及其验证
使用附加 25mg L- 1Km的WPM1培养基进行
毛白杨第一次转化,用 500 g L- 1的 AS活化农杆
菌菌液,经过共培养和不定芽诱导培养,获得抗 Km
的不定芽, GUS组织染色验证,获得了 75%转化率
(表 2)。图 3显示的是第一次转化的毛白杨株系 24
号 GUS组织染色结果,表明 GUS基因在转基因植株
根、茎和叶都强烈表达。
a茎的 GUS染色; b根的 GUS染色; c叶的 GUS染色
图 3 第一次转化毛白杨株系 24号 GUS组织染色
为了进行第二次转化,取第一次转化的毛白杨
24号株系叶片,切成 56个叶盘,用 500 g L- 1AS活
化含有 pCAMB IA1302质粒的农杆菌菌液浸染,将叶
盘放置于附加 25mg L- 1Hyp的WPM1培养基进行
共培养和不定芽诱导培养,抗性芽诱导生根, 获得抗
Hyp植株 44株。为验证转基因植株,以抗 Hyp的植
株基因组 DNA为模板, PCR扩增 Hp t和 GUS基因,
GUS基因预期扩增出 1 000 bp片段,Hp t基因预期扩
增出 750 bp片段。电泳结果表明抗 Hyp的 44株植
株中有 34株既扩增出了H p t基因, 同时也扩增出了
GUS基因 (图 4) ,表明使用 25 mg L- 1Hyp可以有
效的进行二次转化,转化率达 607%。
MDNA标准分子量; P1pIG121和 pCAMBIA1302的混合质粒,作为阳性对照; C1第一次转化的毛白杨 24号株系; 1~ 44二次转化株系
图 4 二次转化毛白杨植株 NPTII和 GUS基因的基因组 PCR检测
3 讨论
二次转化是进行遗传改良和功能基因研究的有
效的手段。为了建立毛白杨有效的二次遗传转化体
系,研究了影响遗传转化的几种因素, 包括培养基激
80
2009年第 4期 邓伟等:毛白杨二次遗传转化体系的建立
素配比、抗生素筛选浓度和乙酰丁香酮浓度。发现使
用WPM培养基 (含有 1 mg L- 1 NAA和 2 mg L- 1
ZT)诱导愈伤,添加 ZT( 2mg L- 1 )诱导不定芽再生,
获得了 94%再生频率。添加浓度为 500 g L- 1的
AS可以提高转化频率。采用 Km ( 25 mg L- 1 )和
Hyp( 25mg L- 1 )筛选, 通过二次转化将 GUS基因
和潮霉素磷酸转移酶基因 Hp t导入到毛白杨中, GUS
组织染色和基因组 DNA的 PCR检测结果表明, GUS
和H p t基因成功整合到转基因植株基因组上, 获得了
607%二次转化频率。
采用 Km和 H yp筛选,建立了有效的毛白杨二
次转化系统,为毛白杨遗传改良研究和多基因功能
研究奠定了基础。
激素是影响毛白杨转化频率的关键因素, 前人
进行了大量的研究 [ 12~ 17]。例如, Y ang等 [ 16]使用 1
mg L- 1 6BA和 4mg L- 1 2, 4D诱导毛白杨外植
体愈伤, 使用 025 mg L- 1 6BA、025 mg L- 1
IBA和 025 mg L- 1 ZT诱导不定芽的形成。李科
友等 [ 17 ]采用 05 mg L- 1 6BA和 005 mg L- 1
NAA诱导愈伤和不定芽的形成。本试验使用 1 mg
L- 1 NAA和 2mg L- 1 ZT来诱导愈伤, 用 2 mg
L
- 1
ZT诱导不定芽的形成,通过优化各种转化条件,
获得较高的转化效率, 为二次转化奠定了良好的
基础。
农杆菌介导的外源基因转化是农杆菌与植物细
胞之间相互作用的结果, 酚类物质可以激活农杆菌
的毒性区,提高农杆菌的侵染能力。AS是诱导效果
最佳的酚类物质之一, 一定浓度的 AS可使农杆菌
的 Vir基因活化从而促进 TDNA的转移 [ 18]。王树
耀等 [ 19]在转化 84K杨时添加乙酰丁香酮可以明显
提高转化效率。本试验中发现, 没有添加 AS时转
化频率较低,加入 500 g L- 1的 AS时,转化频率显
著的提高,这可能是植物受体受伤时分泌的酚类物
质较少,不能较好的诱导农杆菌 Vir基因的表达, 而
外加一定量的 AS则可以较好地激活 Vir基因的表
达, 进而提高转化率。但是过高浓度的 AS并不会
进一步地增加转化率, 这可能是 AS浓度过高, 超过
了农杆菌所能利用的上限, 由此对 AS产生钝化反
应, 或者是过高浓度的 AS会抑制农杆菌的生长及
其活力状态。
参 考 文 献
1 张绮纹, 苏晓华,杨树定向遗传改良及高新技术育种 [M ] 北
京:中国林业出版社, 1999
2 Tuskan GA, D ifaz io S, Jansson S, et al Science, 2006, 15: 1596
~ 1604
3 Brunner AM, Bu sov VB, S trau ss SH Trends P lan t S c,i 2004, 9:
49~ 56
4 李宝健, 朱华晨 中山大学学报, 2005, 4: 79~ 83
5 H alp in C Plant B iotechnol J, 2005, 3: 141~ 155
6 Q i B, Fraser T, Mug ford S, et al N ature B iotechno,l 2004, 22:
739~ 745
7 S inglaPareek SL, Reddy MK, Sopory SK Proc N at l A cad S ci
U SA, 2003, 100: 14672~ 14677
8 M urash ige T, Skook F Physiol P lan t, 1962, 15: 473~ 497
9 L loyd G, M cCow n B Com b ined Proceed ings of the Intern at ion al
Plant Propagators S ociety, 1980, 30: 421~ 427
10 Jefferson RA, Kavanagh TA, B evanMW EMBO J, 1987, 6: 3901
~ 3907
11 肖月华, 罗明, 裴炎 遗传学报, 2002, 29: 62~ 66
12 王善平, 许智宏, 卫志明 植物学报, 1990, 32: 172~ 177
13 卜学贤, 林忠平, 陈维伦 植物学报, 1991, 33: 206~ 213
14 郑均宝, 张玉满, 杨文芝 河北农业大学学报, 1999, 3: 20
~ 25
15 郝贵霞, 朱祯, 朱之悌 植物学报, 1999, 41: 936~ 940
16 Y ang CL, Zu GC, Zhao SM Dev B io,l 2001, 10: 61~ 68
17 李科友, 樊军锋, 赵忠,等 中国农学通报, 2007, 7: 171~ 175
18 G odw in I P lan tM ol B io lRep, 1992, 10: 12~ 36
19 王树耀, 田宗城, 王云, 等 湖南文理学院学报, 2005, 17: 60
~ 63
81