全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
康宁木霉 QF02纤维素酶酶学性质的研究
邹水洋 1, 2 郭祀远2
( 1东莞理工学院化学与环境工程学院, 东莞 523808; 2华南理工大学轻化工研究所, 广州 510640)
摘 要: 对康宁木霉 QF02生产的纤维素酶的一般酶学性质进行了研究。该纤维素酶系中滤纸酶、羧甲基纤维素酶、微
晶纤维素酶、葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为 55 、65 、50 和 70 , 最适作用 pH为 40 - 5 0;在 40- 50 范围内热
稳定性较好, 24 h保温后的残留酶活在 485%以上; 在 pH 30 - 8 0范围内比较稳定, 4 保存 24h后的残留酶活在 757%以
上。与几种商品纤维素酶相比 ,该纤维素酶对未处理和碱预处理稻草都表现出较强的糖化能力。
关键词: 纤维素酶 酶学性质 酶解糖化 康宁木霉 稻草
Study on the Enzymatic Properties of Cellulases from
Trichoderma koningiiQF02
Zou Shuiyang
1, 2 Guo Siyuan2
(
1
College of Chem istry and Environm ental Engineering, Dongguan University of T echnology, D ongguan 523808;
2
Light Industry and ChemicalEngineering R esearch Institute, South China University of T echnology, Guangzhou 510640)
Abstrac:t The enzym atic properties of ce llu lase series from T richoderma koning iiQF02 w ere stud ied. The op tim um temperatu res
o f FPase, CMCase, avice lase andg lucos idase were 55 , 65 , 50 and 70 respec tive ly, w ith the optim um pH40- 5 0. The
ce llulase series exhibited a rathe r h igh heatresistant character. Itw as observed thatm o re than 48 5% o f enzym atic activ ity could still
rem ain after incubation at 40- 50 for 24 h. W ith in the pH o f 3 0- 8 0, the cellulase series w ere rather stable and the residual en
zym atic activity could be above 75 7% after being kept at 4 fo r24 h. The enzym atic activ ity o f the cellu lasew as h igher than that of
severa l commerc ia l ce llu lases fo r sacchar ification of unpretreated and alka li pre trea ted rice straw.
Key words: Cellu lase Enzym atic property Enzym atic sacchar ification T r ichoderma kon ing ii R ice straw
收稿日期: 20091229
基金项目:东莞市科技计划项目 ( 2008108101013)
作者简介:邹水洋,男,博士,讲师,主要从事发酵工程及酶工程研究; Em ai:l zsy2046@ 163. com
纤维素酶不仅在生物质能的开发中有着巨大的
应用潜力,近年来在食品、饲料、酿造、造纸、纺织等
轻工业领域的应用也日益广泛 [ 1 ]。纤维素酶实际
上是指能协同作用将纤维素催化水解最终产生葡萄
糖的一组酶的总称, 按底物特异性可将其分为 3种
组分: 纤维二糖水解酶 ( EC 3. 2. 1. 91, 又称为外切
纤维素酶 )、内切纤维素酶 ( EC3. 2. 1. 4)和 葡萄
糖苷酶 ( EC3. 2. 1. 21)。由于微生物基因的多样性,
不同来源的纤维素酶蛋白在分子结构、酶学性质以
及酶系组成比例等很多方面都表现出丰富的多样
性 [ 2- 5]。了解不同来源纤维素酶的酶学性质,对于
其作用机理的认识及实际应用都是非常必要的。本
实验室在前期的工作中, 选育了一株纤维素酶高产
菌 ! ! ! 康宁木霉 (T richoderma kon ing ii ) QF02, 以稻
草为碳源进行液态发酵, 达到了较高的产酶水
平 [ 6- 7]。本研究对康宁木霉 QF02生产的纤维素酶
的最适温度、最适 pH、热稳定性、pH稳定性以及糖
化性能等一般酶学性质进行了进一步研究, 以期为
其在工业上的应用提供基础数据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 纤维素原料 稻草原料来自湖南岳阳市农
场, 稻草在 75 烘干, 粉碎后过 40目筛备用; 碱预
处理稻草是将稻草粉经 2% NaOH 在室温下浸渍
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
24 h后,以蒸馏水洗至中性,再在 75 烘干备用。
1. 1. 2 试剂 Whatm an No. 1滤纸、水杨素、羧甲
基纤维素钠 ( CMCN a)和微晶纤维素 ( A vicel)由
S igma公司生产。葡萄糖测定试剂 ( GODPOD法 )
由北京金豪制药有限公司生产。其它化学试剂均为
国产分析纯或生化试剂。
1. 1. 3 酶制剂 自制酶由康宁木霉 QF02按文献
[ 6]优化的条件生产,经过滤及离心分离 ( 4000 ∀ g,
10 m in)获得上清液,然后将上清液按文献 [ 5]描述
的方法用 70%饱和度 NH4 SO4进行盐析, 经离心分
离 ( 5 000 ∀ g, 20m in)收集酶泥,溶于 pH48的柠檬
酸 柠檬酸钠缓冲液 (即初步纯化的酶制剂 )于 4
冷藏备用。伯奥纤维素酶由上海伯奥公司生产,生
产菌为绿色木霉。纤维素酶 Onozuka R10由 B io
zune L ife Sciences Dep生产, 生产菌为 Aspergillus
sp.。纤维素酶 Primafast 200 和 Primafast 8L 由
Genenco r B ioProducts Co L td生产。
1. 2 方法
1. 2. 1 粗酶液最适作用温度及 pH的测定 将自制
酶分别于 40- 80 水浴和 pH20- 60缓冲液中测
定各组分活力,以酶活最高的温度和 pH作为最适作
用温度和最适作用 pH (其相对酶活规定为 100% )。
1. 2. 2 粗酶液热稳定性及 pH稳定性试验 热稳
定性试验:将自制酶分别置于 40- 60 水浴保温 24
h,分别测定各组分的残留活力。pH稳定性试验:将
自制酶置于 pH10 - 100缓冲液中, 4 恒温保存
24 h后再调节 pH至 48左右, 分别测定各组分的
残留活力。
1. 2. 3 自制酶与商品纤维素酶对稻草的酶解性能
试验 以稻草粉 (未处理或经碱预处理 )作为酶解
底物,酶解反应在 0025 mo l/L、pH48的柠檬酸 柠
檬酸钠缓冲液中进行, 250 mL锥形瓶装入稻草 4 g,
料液比 4%,自制酶与商品纤维素酶的载量均控制
在 50 FPU / g稻草, 50 酶解 48 h后测定其总还原
糖与葡萄糖含量。以上试验均平行做 3个样品,试
验结果取其平均值,标准偏差小于 5%。
1. 2. 4 酶活力的测定 滤纸酶 ( FPase)和羧甲基
纤维素酶 ( CMCase)活力按国际理论和应用化学协
会 ( IUPAC )规定的方法 [ 8]分别以Whatman No. 1滤
纸和 CMCN a为底物测定; 葡萄糖苷酶 ( g lucosi
dase)活力参照 M ande ls的方法 [ 9]以水杨素为底物测
定。微晶纤维素酶 (Av icelase)活力根据文献 [ 10]的
方法以 Avicel为底物测定。FPase、CMCase和 Av
icelase活力分别代表纤维素酶全酶活力、内切酶活力
和外切酶活力 [ 11]。
1. 2. 5 还原糖与葡萄糖含量的测定 还原糖含量
以葡萄糖为标准按 DNS法测定 [ 12]。水解液中葡萄
糖含量用葡萄糖氧化酶法 ( GODPOD法 )测定: 将
样液稀释至葡萄糖含量 0- 0100 mg /mL,取稀释液
100 mL于比色管, 加入 GODPOD试剂 100 mL,
在 37 下保温 5m in, 加蒸馏水 200 mL,摇匀后于
510 nm处比色测定葡萄糖含量。
2 结果与讨论
2. 1 制酶最适作用温度
在 40- 80 测定了自制酶各组分的活力 (图
1),结果表明, FPase在 50- 60 范围内的酶活力比
较接近, 最适温度为 55 。对于各组分而言, Av
icelase最适温度为 50 ; CMCase表现出较高的温
度适应性, 最适温度为 65 ; g lucosidase表现出
最高的温度适应性, 最适温度为 70 。和一些文
献报道的真菌纤维素酶 [ 13, 14 ]相比, 自制纤维素酶
系中 CMCase和 g lucosidase具有较高的最适作
用温度。
图 1 温度对自制纤维素酶活力的影响
2. 2 自制酶最适作用 pH值
在 pH20- 60的缓冲体系测定了自制酶各组
分的活力, 结果如图 2所示, FPase的最适 pH 为
50, A v icelase和 CMCase最适 pH为 48, g lucosi
dase最适 pH为 40。由此可见自制的纤维素酶是
典型的酸性酶,其作用的最适 pH在 40- 50,与其
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2010年第 5期 邹水洋等:康宁木霉 QF02纤维素酶酶学性质的研究
发酵产酶的最适 pH [ 6, 7]基本一致。
图 2 pH对自制纤维素酶活力的影响
2. 3 自制酶的热稳定性
纤维素酶在木质纤维素酶解中采用的温度大多
在 45- 55 ,因此将自制酶分别置于 40- 60 保温
24 h,测定其残留活力, 结果如表 1所示。表 1显
示,自制纤维素酶在 50 以下较稳定, 24 h保温后
的酶活残留率接近或超过 50%, 这对于其工业应用
是很有益的。在 55 以上 FPase、Av ice l和 CMCase
的失活严重; g lucosidase在 55 仍然具有较强的
耐热性,但在 60 时残留酶活下降到 30%。
表 1 自制纤维素酶在不同温度下保温 24 h后的残留酶活
温度
( )
相对酶活 (% )
Avicelase CMCase g lucos idase FPase
40 884 # 38 950 # 41 971 # 44 896 # 35
45 623 # 29 565 # 26 647 # 30 589 # 21
50 532 # 25 485 # 20 610 # 28 496 # 22
55 408 # 16 434 # 23 529 # 23 368 # 18
60 161 # 08 216 # 09 300 # 12 125 # 04
2. 4 自制酶的 pH稳定性
酶在不同 pH环境中的失活主要是酶蛋白不可
逆变性的结果。试验中观察到 pH ∃ 20和 pH %
90时,酶液会产生大量絮凝沉淀。 pH 调节至 48
后于 25 轻微搅拌 2 h仍有部分沉淀不能溶解。图
3中的试验数据显示,在较宽的 pH范围内自制酶有
较好的稳定性, 其中 FPase和 Av iclase稳定范围在
pH 30- 80; CMCase和 g lucosidase稳定范围分
别在 pH20- 80和 pH30- 90。在上述 pH范围
内, 自制酶各组分残留活力均达到 757%以上。
图 3 自制纤维素酶在不同 pH下保存
24 h后的残留酶活
2. 5 自制酶对稻草的酶解糖化性能
一些文献表明 [ 15, 16] , 不同来源的纤维素酶对木
质纤维素原料的酶解糖化能力有很大差别。为此,
本试验以稻草这种具有代表性的木质纤维素原料作
为酶解底物,在相同滤纸酶活载量下比较了自制酶
与几种商品纤维素酶对稻草的酶解糖化性能。
对于未预处理的稻草粉, 自制酶和几种商品纤
维素酶的糖化效率都比较低, 还原糖产量小于 6
mg /mL(图 4), 这是由于天然纤维素原料中木质素
和半纤维素的物理屏障使纤维素难以酶解的缘故。
经碱预处理的稻草粉去除了大部分木质素和一部分
半纤维素,显著改善了纤维素与酶的可及性,其酶解
糖化率比未预处理时提高了 2- 3倍 (图 5)。比较
酶解产生的还原糖与葡萄糖可以发现,不论是未预
处理稻草粉还是碱预处理稻草粉, 自制酶都表现出
较强的糖化能力, 4种商品纤维素酶中仅 Pr imafst
200与之相当, 其它几种酶都相差甚远。尤其对碱
预处理稻草粉,自制酶的优势更加明显,其还原糖与
葡萄糖产量比伯奥酶、Onozuka R10和 Prima fst 8L
高出 47% - 342%。以上试验初步展示了自制酶在
木质纤维素生物转化中良好的应用潜力。至于优化
的酶解工艺条件以及在其它领域的应用还有待进一
步研究。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
图 4 不同酶源对未处理稻草的酶解糖化
图 5 不同酶源对碱预处理稻草的酶解糖化
3 结论
康宁木霉 QF02生产的纤维素酶的主要酶学
性质如下, 该纤维素酶系中滤纸酶、羧甲基纤维素
酶、微晶纤维素酶、葡萄糖苷酶的最适作用温度
分别为 55 、65 、50 和 70 , 最适作用 pH 为
40- 50;在 40- 50 范围内热稳定性较好, 24 h
保温后的残留酶活在 485%以上;在 pH30- 80
范围内比较稳定, 4 保存 24 h后的残留酶活在
757%以上; 与几种商品纤维素酶相比, 该纤维素
酶对未处理和碱预处理稻草都表现出较强的糖化
能力。本研究结果展示了康宁木霉 QF02产生的
纤维素酶在木质纤维素生物转化中具有良好的应
用潜力。
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