全 文 ：生产与科研经验
2014年第 40卷第 11期(总第 323期)137
DOI:10． 13995 / j． cnki． 11 － 1802 / ts． 201411024
日本木瓜和皱皮木瓜过氧化物酶的酶学性质比较*
宋双双1，2，刘峰1，刘伟1，王晓1，Dan Staerk1，李圣波3，崔莉1
1(山东省分析测试中心，山东 济南，250014) 2(山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安，271018)
3(山东亚特生态技术有限公司，山东 临沂，276017)
摘 要 以日本木瓜和皱皮木瓜为原料，用 Tris-HCl 缓冲液提取过氧化物酶(POD)，愈创木酚 － H2O2 为底物，
采用比色法对 2 种木瓜中的 POD酶学性质进行了比较研究。结果显示，皱皮木瓜 YATS 115(A)、日本木瓜西府
海棠(B)的 POD活性的最适温度分别为 15 ℃、30 ℃，都在 30 ℃以内能较好地保持酶活性。A、B的 POD都有 2
个最适 pH值，分别是 5 和 6 ～ 6. 5，5 和 5 ～ 6，其中 B的 2 个最适 pH值差别不明显。A中 POD的 pH值稳定性范
围是 5. 5 ～ 8. 5，B的 POD在酸性条件下都相对稳定。金属离子对 A、B 的影响基本相同，Ca2 +对 2 种 POD 活性
都有促进作用。2 种 POD活性的最佳抑制剂均是 SDS，其次为抗坏血酸。
关键词 皱皮木瓜，日本木瓜，过氧化物酶，酶学性质
第一作者:硕士研究生(崔莉博士为通讯作者，E-mail:cuili0617
@ 163. com)。
* 山东省分析测试中心科技发展基金(山分基合字 2013 第 1
号) ;山东省科学院青年基金(青基合字 2014 第 5 号) ;山东省
海外高层次人才资助专项资金
收稿日期:2014 － 07 － 31，改回日期:2014 － 09 － 02
日本木瓜［Chaenomeles japonica(Thunb. )Lindl］
是蔷薇科(Ｒosaceae)木瓜属植物，又名倭海棠，原产
于日本，中国江苏、浙江、台湾、陕西庭院习见栽
培［1 － 2］，其果实为药材的习用品［3］，具有化湿和胃，舒
筋活络的功效［4］。皱皮木瓜又名汤木瓜、宣木瓜等，
是蔷薇科贴梗海棠［Chaenomeles spiciosa(Sweet)Na-
kai］的近成熟果实，主要产于安徽、浙江、湖北、四川
等地［5］，功效同日本木瓜［6］。目前对于日本木瓜的
研究较少，仅有化学成分的研究［3］，关于其果实内的
氧化、抗氧化酶类的相关研究鲜见报道。皱皮木瓜中
抗氧化酶类的相关报道主要有 SOD 的分离纯化［7］，
氧化酶类有多酚氧化酶(PPO)的性质研究［8］等。对
于木瓜中的过氧化物酶(POD) ，仅见番木瓜中 POD
的纯化及性质研究［9］，关于日本木瓜和皱皮木瓜中
POD的酶学特性的研究均未见报道。
POD广泛存在于动植物和微生物体内，是一种
以血红素为辅基的氧化酶［10］，可催化由过氧化氢参
与氧化各种还原剂［11］的反应，是果实成熟和衰老的
生理指标，参与果实酶促褐变，对果实的色泽及成分
含量等造成不良影响。目前，对果蔬 POD 的纯化及
酶学性质研究较广泛，但是对于大部分原料，其不同
品种间的 POD酶学性质的比较研究还较少。本文通
过比较日本木瓜和皱皮木瓜中 POD 的酶学性质，为
进一步深入研究两者 POD 的结构差异，为提高木瓜
加工产品的品质等提供理论基础。
1 仪器与材料
1. 1 材料
木瓜果实由山东亚特生态技术有限公司提供，
选择大小均一、完整无机械伤、无病虫害的果实，
－ 20 ℃贮藏。编号 A为 YATS 115(皱皮木瓜) ，编号
B为西府海棠(日本木瓜)。
1. 2 试剂
Tris、愈创木酚、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、柠
檬酸钠、Na2HPO4、NaH2PO4、MgCl2·6H2O、ZnSO4·
7H2O、MnCl2·4H2O、Na2SO3、DTT、曲酸、谷胱甘肽
(还原型)、吐温 － 80、SDS、偏重亚硫酸钠、EDTA-2Na、
环庚三烯酚酮(tropolone) ，所用试剂均为分析纯。
1. 3 仪器
GENESYS 10S UV-VIS 紫外可见分光光度计，
Thermo;HH-S2 数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂;
Thermo Multifuge X1Ｒ 离心机，Thermo;人工气候箱，
宁波莱福科技有限公司;BAS124S 万分之一天平，赛
多利斯科学仪器(北京)有限公司。
2 实验方法
2. 1 POD粗酶液的提取
A、B 各取 10 g，以 1 ∶ 1. 5(g ∶ mL)料液比加入
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Tris-Hcl缓冲液(20 mmol /L，pH 7. 5) ，加 0. 1%(w /
v)聚乙烯吡咯烷酮和 0. 3%(v / v)Triton X-100，低温
下研磨，研磨液 4 ℃于 10 000 r /min 离心 20 min，上
清液即为所需粗酶液，于 4 ℃冰箱中保存备用。
2. 2 POD活性的测定
测定溶液体系为 3 mL，20 mmol /L Tris-HCl缓冲
液 pH 7. 5，其中 2. 95 mL 底物含有 10 mmol /L 愈创
木酚和 10 mmol /L H2O2，0. 05 mL 酶液。于 25 ℃反
应 20 min，在 470 nm处测定吸光度变化值。以每分
钟每毫升反应体系 OD值改变 0. 01 为 1 个酶活力单
位(U)［12］。
2. 3 POD酶学性质的测定
2. 3. 1 最适温度和温度稳定性
将反应底物分别置于 4、10、15、20、25、30、35、
40、45、50、55 ℃的水浴锅中保温 5 min，加入木瓜的
粗酶液，测定吸光度。以最适温度的酶活性为
100%，其余温度下测定的酶活性与之的比值即为相
对酶活性［13］。
不同品种木瓜的粗酶液分别保存于 10、20、30、
40 ℃ 条件下，待 20、40、60 min 取出并测定酶活
性［14］。以每个温度下的初始酶活性为 100%，不同
时间测定的酶活性与之相比即为相对酶活性。
2. 3. 2 最适 pH值和 pH值稳定性
测定不同品种木瓜的粗酶液在不同 pH 值(3、
3. 5、4、4. 5、5、5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5、9)的缓冲液
中的酶活性［15］。以最适条件下的酶活性为 100%，
其余 pH值条件下测定的酶活性与之的比值即为相
对酶活性。
将木瓜的粗酶液分别在不同 pH值的缓冲液(3、
3. 5、4、4. 5、5、5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5、9)中 4 ℃保
存 6 h，测定酶活性。以最适条件下的酶活性为
100%。
2. 3. 3 金属离子的影响
分别配制终浓度为含有 1、5、10 mmol /L 金属离
子的底物溶液，加入 POD 酶液，测定酶活力，以不含
金属离子时的酶活力为 100%，分析不同的金属离子
对 POD酶活性的影响。
2. 3. 4 POD米氏常数的测定
在 25 ℃的条件下，分别改变底物愈创木酚和
H2O2 的浓度，考察底物浓度对木瓜 POD 催化速度的
影响，采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)［16］，分
别求出木瓜 POD对于愈创木酚和 H2O2 的米氏常数
Km值。
2. 3. 5 抑制剂和表面活性剂的影响
将各种抑制剂及表面活性剂与底物混合成终浓
度分别为 1、5、10 mmol /L 的溶液，加入酶液，测定吸
光度变化。以不含抑制剂及表面活性剂时的酶活性
为 100%。
2. 4 数据分析
采用 DPS 软件和 Excel 2003 对实验数据进行统
计学分析。
3 结果与分析
3. 1 POD最适温度
POD活性受温度的影响很大，在最适温度范围
内，POD活性可以达到最大。由图 1 可以看出，温度
对品种 A、B的影响呈现完全不同的趋势。当反应温
度低于 30 ℃时，B的酶活性随着温度的升高而增大;
超过 30 ℃时，随着温度的升高酶活性下降直至失活。
当反应温度超过 20 ℃，品种 A的酶活性随着温度的
升高而下降。
图 1 不同品种木瓜 POD的最适温度
Fig. 1 The optimum temperature of Chaenomeles peroxidase
3. 2 POD的温度稳定性
POD在一定的温度范围内可以长时间地保持活
性。由图 2 可知，日本木瓜和皱皮木瓜在 30 ℃以内
都能较好地保持活性。不同来源的 POD 耐热性不
同，水果和蔬菜中的 POD 是一种较耐热的酶
类［17 － 18］。Ekrem和 HU在各自的文章中提到甘瓠和
莴苣茎中的 POD的热耐受性都很好，能在 60 ℃保持
一定的活性［14，19］，刘金磊和赵岩分别对苦瓜和洋葱的
POD进行了研究，发现两者的 POD也都对温度具有较
高的稳定性及耐受性［20，21］，但本文中的 2 种木瓜的
POD对温度的耐受性比较弱，与目前报道的大多数
POD的热稳定性不同，其中，日本木瓜对热的耐受性强
于皱皮木瓜，日本木瓜 B 在 50 ℃条件下保存 20 min
会失活，这与菜花中 POD的热稳定性相似［17］。
生产与科研经验
2014年第 40卷第 11期(总第 323期)139
图 2 不同品种木瓜 POD的温度稳定性
Fig. 2 Temperature stability of Chaenomeles peroxidase
3. 3 最适 pH值
从图 3中可以看出，2 个品种的 POD 活性均随着
pH值的增加呈现先增加后降低的趋势，两者都具有两
个最适 pH值，其中，日本木瓜 B的两个最适 pH值差别
不是很明显，在 pH值为 5 ～6时，都具有较高的活性。
图 3 不同品种木瓜 POD的最适 pH值
Fig. 3 The optimum pH of Chaenomeles peroxidase
3. 4 pH值稳定性
由图 4 可以看出，皱皮木瓜和日本木瓜中 POD
的 pH值稳定性差别很大，其随 pH值变化的趋势也不
同。A的 POD在 pH值 5. 5 ～8. 5 时稳定性较好，一直
能保持 80%以上的活性，在酸性条件下保存相对不稳
定。而日本木瓜 B的 POD在酸性条件下比较稳定，在
4 ～5. 5活性迅速从 85%以上降低至 50%。
图 4 不同品种木瓜 POD的 pH值稳定性
Fig. 4 pH stability of Chaenomeles peroxidase
3. 5 金属离子的影响
金属离子可以在一定程度上影响 POD 的活性，
表 1 所示的金属离子中，只有 Ca2 +可促进 POD活性，
其余的金属离子都对 POD的活性起不同程度的抑制
作用。其中，Ca2 +对皱皮木瓜 A 中 POD 的活性的促
进作用显著高于 B，而 Yihong Hu 在对莴苣茎中 POD
的酶学性质研究中提到 Ca2 +对 POD 起抑制作用，可
以抑制 60%左右的酶活性［14］，可见不同来源的 POD
可能结构存在较大差异，导致金属离子对其有完全相
反的作用。Zn2 +在低浓度时对 A和 B 的抑制作用相
同，在 10mmol /L 时，对 A、B 的作用相反，Mn2 +的抑
制作用比较明显，10 mmol /L Mn2 + 抑制 A、B 几乎
50%的 POD酶活，Mn2 +对 A中 POD的抑制能力随着
浓度的增大而增强，但对 B 中 POD 的抑制能力与浓
度并不存在线性相关性。其他 3 种金属离子对 A 和
B的抑制效果没有显著差异。
表 1 不同金属离子对 POD活性的影响
Table 1 Influence of metalions on Chaenomeles
peroxidase activity
金属离子 /
(mmol·L －1)
相对活性 /%
A B
Na +
0 100 ± 0. 005 5 100 ± 0. 039 6
1 100 ± 0. 007 6Aa 85. 35 ± 0. 050 8Aa
5 86. 19 ± 0. 005 7Aa 74. 05 ± 0. 048 6Aa
10 82. 68 ± 0. 011 7Aa 98. 01 ± 0. 058 4Aa
Ca2 +
0 100 ± 0. 005 5 100 ± 0. 039 6
1 182. 99 ± 0. 009 5Aa 103. 34 ± 0. 046 8Bb
5 203. 81 ± 0. 006 6Aa 97. 01 ± 0. 035 9Bb
10 199. 69 ± 0. 006 1Aa 107. 26 ± 0. 013 3Ab
Mg2 +
0 100 ± 0. 005 5 100 ± 0. 039 6
1 102. 47 ± 0. 002 5Aa 88. 93 ± 0. 063 9Aa
5 94. 23 ± 0. 003 2Aa 90. 98 ± 0. 034 6Aa
10 88. 87 ± 0. 002 5Aa 101. 70 ± 0. 018 5Aa
Zn2 +
0 100 ± 0. 005 5 100 ± 0. 039 6
1 85. 88 ± 0. 002 5Aa 73. 99 ± 0. 057 9Aa
5 72. 68 ± 0. 001Ab 87. 11 ± 0. 043 7Aa
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140 2014 Vol. 40 No. 11 (Total 323)
续表 1
金属离子 /
(mmol·L －1)
相对活性 /%
A B
10 65. 88 ± 0. 003 6Bb 111. 78 ± 0. 093 5Aa
Mn2 +
0 100 ± 0. 002 1 100 ± 0. 028 5
1 98. 32 ± 0. 007Aa 69. 97 ± 0. 048 3Bb
5 97. 12 ± 0. 005 5Aa 71. 77 ± 0. 064 5Ab
10 58. 94 ± 0. 016 5Aa 52. 80 ± 0. 023 7Aa
K +
0 100 ± 0. 005 5 100 ± 0. 039 6
1 104. 02 ± 0. 005 5Aa 89. 87 ± 0. 059 7Aa
5 97. 63 ± 0. 008 0Aa 87. 99 ± 0. 044 8Aa
10 92. 87 ± 0. 004 6Aa 93. 03 ± 0. 043 8Aa
注:品种 A、B之间的多重比较，a，b，c:P ＜ 0. 05;A，B，C:P ＜ 0. 1。
3. 6 米氏常数的测定
分别以 1 /［S］为横坐标，1 /V 为纵坐标，采用双
倒数作图法，得线性方程，如图 6 所示，2 种木瓜中
POD催化愈创木酚和 H2O2 的酶促褐变反应均符合
米氏方程，进而求得 2 种木瓜的 POD 的 Km 值。Km
值的大小可近似地表示酶与底物的亲和力，Km 值越
大表示酶与底物的亲和力越小，反之，则表示亲和力
越大［16］。可见，皱皮木瓜 A中的 POD与愈创木酚的
结合能力强于日本木瓜。
图 5
3. 7 抑制剂和表面活性剂的影响
抑制剂和表面活性剂具有还原性，可以抑制
POD催化氧化愈创木酚。不同的化合物或不同浓度
的同种化合物对不同品种木瓜 POD活性的影响差别
很大。如表 2 所示，1 mmol /L 的抗坏血酸、柠檬酸、
谷胱甘肽(还原型)、Na2S2O5 及高浓度的 EDTA-2Na
图 6 POD酶促反应双倒数作图
Fig. 6 Lineweaver-Burk plot of Chaenomeles peroxidase
对品种 B的 POD活性都起促进作用，实验中的所有
化合物均对 A的 POD 活性有抑制作用，且抑制能力
随着浓度的增大而增强，其中，柠檬酸、吐温 － 80 对
A的抑制作用显著强于 B。
SDS对 2 种木瓜中 POD 活性的抑制作用最强，
在低浓度(1 mmol /L)时即可完全抑制 POD 活性，多
项有关酶活动力学的研究［22 － 23］均表明 SDS 对辣根、
葡萄等多种来源的 POD 活性有很强的促进失活作
用，本研究在木瓜中也得到同样的结果，SDS 是一种
变性剂，能够破坏蛋白质分子中的疏水键和氢键，进
而改变酶的空间构象，导致酶活性降低［12］，可见表面
活性剂 SDS是过氧化物酶类重要的钝化剂。由表 2
可以看出，大部分抑制剂和表面活性剂对品种 B 的
POD的抑制能力都弱于品种 A，可见抑制剂和表面活
性剂对日本木瓜的抑制能力低于皱皮木瓜。
表 2 抑制剂和表面活性剂对 POD活性的影响
Table 2 Influence of inhibition dose and surfactant
on peroxidase activity
化合物 /
(mmol·L －1)
相对活性 /%
A B
抗坏血酸
0 100 ± 0. 004 7 100 ± 0. 029 2
1 23. 02 ± 0. 005 7Bb 125. 45 ± 0. 030 9Aa
5 1. 07 ± 0. 008 1Aa 0 ± 0Aa
10 0 ± 0 0 ± 0
柠檬酸
0 100 ± 0. 004 7 100 ± 0. 029 1
1 75. 38 ± 0. 005 1Bb 229. 91 ± 0. 047 3Aa
5 27. 29 ± 0. 012 1Bb 96. 67 ± 0. 039 5Aa
生产与科研经验
2014年第 40卷第 11期(总第 323期)141
续表 2
化合物 /
(mmol·L －1)
相对活性 /%
A B
10 4. 65 ± 0. 004 9Bb 24. 38 ± 0. 014 7Aa
Na2 SO3
0 100 ± 0. 004 7 100 ± 0. 029 2
1 91. 23 ± 0. 016 1Aa 99. 27 ± 0. 055 8Aa
5 76. 83 ± 0. 001Aa 89. 14 ± 0. 044 4Aa
10 0 ± 0 0 ± 0
DTT
0 100 ± 0. 004 7 100 ± 0. 029 2
1 93. 67 ± 0. 013 3Aa 73. 75 ± 0. 074 7Aa
5 62. 88 ± 0. 013 1Aa 76. 55 ± 0. 048 4Aa
10 0 ± 0 0 ± 0
Kojic acid
0 100 ± 0. 004 7 100 ± 0. 029 2
1 52. 21 ± 0. 012 0Aa 33. 78 ± 0. 044 6Ab
5 35. 75 ± 0. 023 7Aa 14. 66 ± 0. 009 3Bb
10 27. 82 ± 0. 016 8Aa 10. 06 ± 0. 018 8Bb
0 100 ± 0. 027 2 100 ± 0. 024 0
谷胱甘肽 1 86. 58 ± 0. 009 1Ab 102. 05 ± 0. 040 1Aa
(还原型) 5 0 ± 0Ab 6. 02 ± 0. 015 2Aa
10 0 ± 0 0 ± 0
Na2 S2O5
0 100 ± 0. 027 2 100 ± 0. 024 0
1 71. 98 ± 0. 005 5Bb 121. 61 ± 0. 039 6Aa
5 0 ± 0Aa 3. 63 ± 0. 015 9Aa
10 0 ± 0 0 ± 0
EDTA-2Na
0 100 ± 0. 027 2 100 ± 0. 024 0
1 69. 28 ± 0. 019 3Aa 73. 67 ± 0. 049 2Aa
5 67. 57 ± 0. 023 9Bb 173. 60 ± 0. 044 9Aa
10 72. 43 ± 0. 003 5Bb 197. 54 ± 0. 028 0Aa
(w /v)
Triton X-100
0 100 ± 0. 037 2 100 ± 0. 020 1
0. 1% 48. 24 ± 0. 024 2Bb 90. 76 ± 0. 041 3Aa
0. 2% 35. 62 ± 0. 001Bb 75. 75 ± 0. 027 1Aa
0. 3% 33. 16 ± 0. 010 1Ab 70. 60 ± 0. 083 5Aa
吐温-80
0 100 ± 0. 037 2 100 ± 0. 020 1
0. 1% 42. 35 ± 0. 004 4Bb 85. 17 ± 0. 016 3Aa
0. 2% 30. 59 ± 0. 006 1Bb 64. 03 ± 0. 042 7Aa
0. 3% 26. 52 ± 0. 006 7Bb 67. 94 ± 0. 032 5Aa
SDS
0 100 ± 0. 037 2 100 ± 0. 020 1
0. 1% 0 ± 0Aa 0. 98 ± 0. 006 4Aa
0. 2% 0 ± 0 0 ± 0
0. 3% 0 ± 0 0 ± 0
注:品种 A、B之间的多重比较，a，b，c:P ＜ 0. 05;A，B，C:P ＜ 0. 1。
4 结论与讨论
皱皮木瓜和日本木瓜的 POD的最适温度分别为
15 ℃、30 ℃，二者都在 30 ℃以内能较好地保持活性。
两种 POD都有两个最适 pH值，日本木瓜的两个最适
pH值差别不明显;皱皮木瓜的 POD 的 pH 值稳定性
范围为 5. 5 ～ 8. 5，日本木瓜的 POD 在酸性条件下比
较稳定。金属离子对 B 两种木瓜的影响基本相同，
Ca2 +对两种 POD活性都有促进作用，对两种 POD 抑
制能力最强的化合物是 SDS，其次为抗坏血酸。
日本木瓜和皱皮木瓜的 POD 都含有两个最适
pH值，可能与 POD 酶的空间构象有关，或者可能存
在两种同工酶，具体原因有待于日后深入研究。本研
究中两种木瓜的 POD 对温度的耐受性都比较弱，仅
在 30 ℃以内能较好的保持活性，因此，这两个品种的
木瓜的 POD要在低温下保存，这两种木瓜 POD 的热
稳定性比目前报道的大多数果蔬中 POD 差，可能是
因为原料来源造成的，目前使用等电聚焦技术研究已
证明不同 POD同功酶的耐热性存在差异［17］，含有不
同的同工酶也可能是一个原因，有待进一步研究验
证。Ca2 +对两个 POD 活性都起促进作用，在加工生
产中应避免木瓜产品与 Ca2 +接触。抑制剂和表面活
性剂对两个品种的 POD 的作用规律基本相同，还原
性强的化合物对 POD 都有很强的抑制作用，其他表
面活性剂对 POD 的活性也有很强的抑制作用，可以
应用于加工生产过程中。
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Comparison on enzymatic property of POD from Chaenomeles
japonica(Thunb. )Lindl and Chaenomeles spiciosa(sweet)Nakai
SONG Shuang-shuang1，2，LIU Feng1，LIU Wei1，WANG Xiao1，
DAN Staerk1，LI Sheng-bo3，CUI Li1
1(Shandong Analysis and Test Center，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China)
2(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
3(Shandong Yate Ecological Technology Co.，Ltd.，Linyi 276017，China)
ABSTＲACT The peroxidase was isolated from Chaenomeles japonica (Thunb. )Lindl and Chaenomeles spiciosa
(Sweet)Nakai by Tris-HCl buffer. With guaiacol-H2O2 as substrate，the enzymatic properties of two cultivars were
monitored by measuring the absorbance. The results showed that the optimum temperatures for POD activity in YATS
115(A)and Chaenomeles Xifu(B)were 15 ℃ and 30 ℃ respectively. The POD of two cultivars could keep stable un-
der 30 ℃. The peroxidases of two cultivars both had two optimum pH. They were respectively 5 and 6 ～ 6. 5，5 and
5 ～ 6，but the two optimum pH in B was not obvious. The pH range for stable POD of A was at pH5. 5 ～ 8. 5，while
the POD of B could keep stable in acid-stage of pH. Metal ions had the same effects on the POD activity of A and
B. Ca2 + activated POD of A and B. The optimum inhibitor of POD activity in both two cultivars was SDS，and then
followed by ascorbic acid.
Key words Chaenomeles japonica(Thunb. )Lindl，Chaenomeles spiciosa(Sweet)Nakai，peroxidase，enzyme char-
acterization