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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂
枯草芽孢杆菌的方法
王大威1，2 张健1，2 姜伟3 张凤久4
(1中海油研究总院，北京 100027;2海洋石油高效开发国家重点实验室，北京 100027;
3中国海洋石油总公司，北京 100027;4中国海洋石油有限公司，北京 100027)
摘 要: 脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物产生的一类具有较强表面活性的生物表面活
性剂。枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(sfp)是枯草芽孢杆菌中参与脂肽代谢的功能性基因。采用 sfp基因 PCR对从环境
中得到的一组产生表面活性剂的微生物进行筛选，结合 Tricine-SDS-PAGE电泳对 PCR 结果呈阳性的菌株的代谢粗初提物进
行检测，初步鉴定得到两株枯草芽孢杆菌。进一步利用 16S rDNA 序列的系统发育学分析确定这两种菌株为枯草芽孢杆菌，
并利用 TLC、HPLC鉴定其产物为脂肽类表面活性剂，从而建立了一套快速分离检测产生脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢
杆菌方法。
关键词: 脂肽 枯草芽孢杆菌 sfp基因 Tricine-SDS-PAGE电泳
Rapid Detection and Characterization of Surfactin-producing
Bacillus subtilis
Wang Dawei1，2 Zhang Jian1，2 Jiang Wei3 Zhang Fengjiu4
(1 CNOOC Research Institute，Beijing 100027;2 State Key Laboratory of Offshore Oil Exploitation，Beijing 100027;
3China National Offshore Oil Corporation，Beijing 100027;4 China National Offshore Oil Corporation Ltd，Beijing 100027)
Abstract: Surfactin is a kind of important biosurfactant that metabolizes by Bacillus subtilis，but now strain Bacillus subtilis re-
ported was little for identify to Bacillus subtilis and surfactin is time-consuming and complex． We research the utility of using PCR of
the sfp gene as a means of identifying Bacillus species that produce surfactin，and using Tricine-SDS-PAGE as a means of identifying
surfactin，16S rDNA sequence analysis and HPLC in parallel to ensure that the PCR and Tricine-SDS-PAGE provided correct re-
sults．
Key words: Surfactin Bacillus subtilis sfp gene Tricine-SDS-PAGE electrophoresis
收稿日期:2011-03-14
基金项目:国家级重大基础研究前期研究专项(2008ZX05024)
作者简介:王大威，男，博士，研究方向:微生物提高原油采收率;E-mail:wangdw3@ cnooc． com． cn
脂肽(Lipopeptide)又名脂酰肽(Acylpeptide) ，
是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成的小
肽，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽
类生物表面活性剂显示了十分优良的特性，在医药、
食品、化妆品、环境治理和微生物采油等领域都有广
泛的应用［1］。大多数脂肽来源于微生物，而其中以
来源于细菌的脂肽居多。目前发现的脂肽类生物表
面活性剂有 10 余种，主要包括 Surfactin、Lichenysin、
Iturin和 Fengysin 等［2］。其中表面活性素(Surfac-
tin)是一类环状结构的脂肽(图 1) ，具有良好的表
面活性，能增加憎水烃类的生物可获得性，激发烃的
生物降解，与部分重金属结合能移除被污染的土壤和
沉积物中的重金属;同时，还具有特殊的生物活性，能
提高尿激酶的活性，防止血液凝结。脂肽类生物表面
活性剂发现 35 年来，尽管相比于化学合成表面活性
剂，其具有诸多优点，但目前脂肽类表面活性剂的应
用还十分有限。这主要是因为发现的产生脂肽的菌
株较少，公开报道只有 20株菌株可以产生脂肽［3］。
2011 年第 9 期 王大威等:一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法
图 1 表面活性素的结构
近年来，人们一直采用血平板法和扩油圈法
筛选产生物表面活性剂的菌株，这些方法不仅工
作效率低，且不能有效将产脂肽的微生物从中区
分开;同时鉴定微生物产生的脂肽的方法一般都
采用高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)、质
谱对纯化的产物进行分析，这些检测手段对产物
的纯度要求较高，但脂肽类生物表面活性剂纯化
需要经过酸化沉淀、冷冻干燥、真空抽干等繁琐的
工序，费时而且效率低，因此如何快速筛选产生脂
肽类表活剂的微生物一直是困扰研究人员的主要
问题。
枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(sfp)位于
srf操纵子的下游(图 2) ，片段长 4 kb，是参与脂肽
代谢的第二调控元件。Nakano等［4］确定了 sfp 基因
的核酸序列，其编码枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶
(SFP)属于 4-phosphopantetheinyl transferase 超家
族。Hsieh等［5］曾报道针对 sfp 基因合成引物，建立
快速鉴定产脂肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
的方法，但该方法后期同样采用传统的 HPLC(高效
液相色谱)对菌株产物进行分析，在产物纯化时还
是会消耗大量的时间和人力。
图 2 sfp基因在表面活性素合成酶基因操纵子复合多酶体系中的位置示意图
考虑到采用常规方法分离纯化微生物产生的脂
肽存在的诸多困难，本研究拟采用以往蛋白质分离
常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法对代谢
产物进行分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
法是分离蛋白质的常用生化方法，该方法简便、快
速、价廉、不需要对蛋白或肽类进行过多处理，并具
有相对较高的分辨率，但由于 Bacillus 属细菌所合
成脂肽的相对分子量多在 1 kD左右，为避免 SDS微
团对蛋白质分离产生干扰，本研究采用 80 年代末由
Schagger和 von Jagow 首创的三羟甲基氨基甘氨酸
Tris-tricine缓冲系统［6］对脂肽进行分析。该系统可
使小蛋白质-SDS 复合物与 SDS 微团分离，去除干
扰，最小可分离 1 － 10 kb的蛋白质，10 多年来，一直
利用这种较简便的不连续梯度胶分离小分子肽。
本试验采用 sfp 基因 PCR 结合 Tricine-SDS-
PAGE电泳拟建立一套快速分离检测枯草芽孢杆菌
及其产物脂肽的方法，减少在菌株分离和产物纯化
过程中的对人力和时间的浪费，加快分离目标菌株
的进程，为今后现场筛选脂肽类表面活性剂产生菌
株提供可靠的方法。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株 10 株现场分离的产生生物表面活性
剂的未知菌株，标准菌株为本实验室保存的枯草芽
孢杆菌(Bacillus subtilis)ZW-3。
1． 1． 2 培养基 液体培养基用基本无机盐培养基:
K2HPO4·3H2 O 4. 8 g，KH2 PO4 1. 5 g，MgSO4·7
H2O 0. 2 g，CaCl2·2H2O 0. 2 mg，三水合柠檬酸钠
0. 5 g，酵母浸出物 0. 1 g，氮源为 1 g硫酸铵，葡萄糖
为碳源，加水配成 1 L溶液。固体培养基另加 2%的
琼脂，121℃灭菌 20 min。
1． 1． 3 标准品 脂肽标准品购自于 Fluka(Sigma)。
1． 2 方法
1． 2． 1 sfp 基因的 PCR 扩增 将初筛的菌株接种
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于摇瓶培养基中 180 r /min 37℃振荡培养 3 d。基
因组 DNA 的提取参考分子克隆实验指南(第 3
版)［7］。sfp基因的 PCR扩增方法参考文献［5］。提
取细菌基因组 DNA，以其为模板 PCR 扩增 sfp 基
因。引物 f(5-ATGAAGATTTACGGAATTTA-3)和 r
(5-TTATAAAAGCTCTTCGTA-3)由上海生工生物
工程有限公司合成。PCR 体系采用 20 μL，反应体
系:10 × PCR 缓冲液(含 MgCl2 20 mmol /L)2 μL，
Taq DNA聚合酶 0. 2 μL，10 μmol /L 引物各 1 μL，
DNA模板 1 μL，去离子水 13. 8 μL。PCR 扩增程
序:94℃ 10 min;94℃ 1 min，46℃ 30 s，72℃ 1 min。
共 25 个循环;72℃ 10 min。PCR产物在 2%琼脂糖
凝胶中电泳进行检测。
1． 2． 2 Tris-tricine 缓冲系统丙烯酰胺凝胶电泳
参照文献［8］，将 PCR 阳性菌株接种于摇瓶培养基
中 180 r /min 37℃振荡培养 3 d，发酵液 8 000 r /min
离心 10 min，弃菌体沉淀。制胶方法与普通 Tris-Gly
系统相同，注意电泳槽内分别加入阴极和阳极电泳
缓冲液，将上清液和 Surfactin 脂肽标准品溶液(400
μg /mL)上样后，先在 30 V 恒压下电泳 1 h，然后在
150 V恒压下电泳 4 h，溴酚蓝前沿即可移动到离底
部约 0. 5 － 1 cm，停止电泳，凝胶小心取下后，浸入
染色液中染色，而后脱色、保存。电泳后，凝胶首先
经考马斯亮蓝 G-250 染色液初染，再使用油红 O 进
行了第二次染色，油红 O 为脂溶性染料，用于脂类
染色。
1． 2． 3 16S rDNA 基因的序列分析 为最终确定
PCR扩增呈阳性及产物经 Tricine-SDS-PAGE 电泳
为脂肽的目标菌株的种属，对其进行 16S rDNA 基
因的序列分析。以细菌基因组 DNA为模板，扩增引
物采 用 细 菌 通 用 引 物 B14926 (5-CCGGATC-
CAGAGTTTGATCCTGGTCAGA-ACGAACGCT-3)和
B14927 (5-CGGGATCCTACGCCTACCTTGTTACG
ACTTCACCC-3) (上海生工生物技术有限公司合
成)。PCR反应体系选用 20 μL反应体系:10 × PCR
缓冲液(含MgCl2 20 mmol /L)2 μL，Taq DNA聚合酶
0. 2 μL，10 μmol /L引物各 1 μL，DNA模板 1 μL，去
离子水 13. 8 μL。PCR扩增程序:94℃ 10 min;94℃
45 s，55℃ 60 s，72℃ 70 s，共 30 个循环;72℃ 10
min。扩增的 PCR产物连接到载体 pMD18-T(TaKa-
Ra)上，转化 E． coli DH5α。提取有 16S rDNA 插入
的质粒并测序，序列测定由北京三博远志公司完成。
1． 2． 4 脂肽薄层层析(TLC)鉴定 脂肽薄层层析
方法参照文献［9］，将分离得到的表面活性剂样品
溶解在二氯甲烷中配成溶液。取两块活化的薄
板，记为 A板、B 板，每块板分别点样，在氯仿 ∶ 乙
酸 = 8∶ 2(V /V)中展开 10 min。挥发掉溶剂后，A
板直接以茚三酮试剂(0. 15%的茚三酮丙酮溶液)
显色。把 B 板放入耐高温的密封瓶内，瓶中预先
以小杯盛约 1 mL浓盐酸，110℃烘箱中熏蒸 1 h进
行原位酸水解，通风橱中冷却，吹去盐酸后，以茚
三酮试剂显色。
1． 2． 5 脂肽高效液相色谱(HPLC)鉴定 为进一
步验证 Tricine-SDS-PAGE 电泳的有效性和稳定性，
对脂肽表面活性剂进行纯化。纯化样品采用高效液
相色谱进行检测，流动相 A(40% 乙腈 + 60% 10
mmol /L醋酸铵，pH6. 9) ，流动相 B(乙腈) ，进行梯
度洗脱，0 － 10 min内 B相由 10%变到 25%，流动相
1. 0 mL /min、反相 C18 柱、紫外 215 nm检测即可。
2 结果
2． 1 sfp基因的 PCR扩增结果
sfp基因 PCR产物电泳(图 3)显示 10 株生物表
面活性剂代谢菌株中，ZW-4、ZW-8 在 675 bp 处有
条带，与正对照菌株一致，可以初步判定为枯草芽孢
杆菌。
2． 2 Tris-tricine缓冲系统丙烯酰胺凝胶电泳
对细菌发酵液离心上清电泳后，凝胶首先经考
马斯亮蓝 G-250 染色液初染，发现发酵液最前沿条
带呈浅蓝色，其迁移距离与 Surfactin 脂肽标准品相
同。为了进一步确认该条带为脂肽，经油红 O 染色
后，原本呈浅蓝色的最前沿条带和 Surfactin 脂肽都
被染成红色，可确定该条带为脂肽，电泳结果如图 4
所示。
2． 3 16S rDNA基因的序列分析
染色体 DNA 用 PCR 扩增出单一条带，PCR 产
物回收纯化后，经 DNA测序，序列长度为 1 426 bp，
与 GenBank中现有的菌种的 16S rRNA 基因序列比
对，进一步确定 ZW4、ZW8 菌株为枯草芽孢杆菌
(Bacillus subtilis) ，与 sfp 基因 PCR 结果、Tris-tricine
凝胶电泳结果吻合。
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M． Marker;1． ZW1;2． ZW2;3． ZW3;4． ZW4;5． ZW5;6． ZW6;7． ZW7;8． ZW8;9．阳性对照;10．阴性对照
图 3 sfp基因的 PCR扩增
1．菌株 ZW-4 发酵液;2． Surfactin;3．蛋白质分子量标准
图 4 菌株 ZW-4 发酵液的聚丙烯酰胺凝胶电泳
2． 4 脂肽薄层层析(TLC)结果
将纯化脂肽进行薄层层析，使用氯仿 /乙酸为展
开剂，以 Surfactin标准样为对照，层析结果如图 5 所
示，样品与 Surfactin 相当，并且只呈现 1 个斑点，证
明样品被纯化，菌株代谢产物为脂肽(Surfactin)。
1． Surfactin;2．菌株 B． subtilis代谢产物
图 5 菌株代谢的脂肽的薄层层析
2． 5 脂肽高效液相色谱(HPLC)检测结果
细菌发酵液经纯化后得到脂肽纯品采用 HPLC
与标准品进行检测。由图 6 可见，脂肽经 HPLC 分
离后出现了 5 个主要的峰，保留时间分别为
14. 386、19. 982、24. 680、27. 392 和 28. 098 min，标准
品 HPLC结果在 14. 562、21. 280、24. 091、29. 081 和
29. 827 min处也各有 5 个峰，这 5 个峰可能是表面
活性素(Surfactin)的同系物，因此初步认定纯化样
品中保留时间为为 14. 386、19. 982、24. 680、27. 392
和 28. 098 min的峰为表面活性素(Surfactin)。因此
证明 Tris-tricine电泳的正确性。
3 讨论
脂肽的生物合成是由表面活性素合成酶基
因操纵子(srf operon)复合多酶体系催化进行的，
其中，SrfA-C 起硫酯酶的作用，SrfA-C-TE 基因位
于它的 C-末端，直接参与脂肽生物合成，其他一
些研究认为 sfp 基因在脂肽合成中也起重要作
用［10］。换言之，srfA-C-TE 和 sfp 基因在脂肽的合
成中都是必不可少的。所以在本研究中，针对
sfp 基因序列和 srfA-C-TE 基因序列设计了探针，
试验发现 sfp 基因 PCR 结果相对于 SrfA-C-TE 基
因 PCR 结果更加稳定，说明它是严格保守的基因
序列，所以本研究选择该段基因序列设计了一组
探针。
本研究采用 SDS-PAGE对细菌代谢物进行快速
分离和鉴定，但脂肽分子多为 1 kD 左右，而常规的
Tris-甘氨酸 －盐酸系统中电泳分离分子量小于10 kD
的多肽效果差。国外曾经报道了分离小分子肽的三
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A．脂肽标准品;B．纯化脂肽
图 6 脂肽生物表面活性剂的 HPLC检测
羟甲基氨基甘氨酸(Tricine)-SDS-PAGE 方法(有效
分离 1 kD 小肽 Tricine-SDS-PAGE 方法-1) ，用
Tricine代替甘氨酸作为尾随离子，在 pH8. 45 的浓
缩胶中，它的迁移速度远远快于甘氨酸，使快慢离子
间的区域更窄，其结果是对小分子蛋白质的浓缩更
有效。凝胶制作采用二层不连续胶的结构，由致密
胶 +夹层胶 +浓缩胶构成，静置以聚合形成三明治
式的不连续梯度凝胶。通过调整聚丙烯酞胺凝胶的
分子组成后，可以改善分离脂肽的效果;同时进一步
加入尿素后，凝胶能清晰地显示 1 kD 的带型，可见
尿素能增强分离效果。
脂肽是一类重要的生物表面活性剂。相比于化
学合成表面活性剂，生物表面活性剂具有可生物降
解和低毒的特点，但目前由于生产成本，生物表面活
性剂在食品、农业化工、石油开发方面的应用还不广
泛。因此，进行目前的研究有利于快速发现产脂肽
生物表面活性剂的菌种对于降低脂肽生产成本意义
重大。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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