全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
芘降解质粒提取方法的研究
蔡丽希 许桂芬
(莆田学院医学院,莆田 351100 )
摘 要: 采用碱裂解法、化学改良方法、CTAB法、酚氯法等 4种方法提取从泉州红树林沉积物中筛选出多环芳烃降解
菌群 YL的质粒,并分别转化至大肠杆菌感受态细胞,然后采用富集筛选的手段, 最终确立最佳方案得到一组质粒转化菌群。
该转化菌群可以利用芘作为其生长的惟一碳源和能源, 并能在 21 d内将 50 mg L- 1的芘降解 85 69%。而受体菌 E coli
DH5的芘降解率仅为 2 006%。由此可以证明, 降解质粒已成功转化进宿主细胞, 并发挥降解作用。YL的质粒含有降解芘
的基因。
关键词: 多环烷烃 红树林 芘 降解质粒
Isolation and Research of Pyrene Degrading P lasm ids
Ca iL ixi Xu Guifen
(College of M edical, Putian University, Putian 351100)
Abstrac:t A lka line lysis, pheno l and ch lo ro fo rm ex traction , CTAB and m odified chem icalm e thods from chem istry were used fo r
iso lation of plasm id DNA from a k ind o f pyrene degrad ing bacter ia iso lated from the sed im ent o fm angrove in Quanzhou c ity A fter plas
m id preparation , the p lasm id were transform ed into Eco li DH 5 and found tha t the transform ed bacteria have the ab ility of py rene
deg radation and utilize py rene as so le carbon sources The degrading rate o f pyrenew as 8569% w ith in 21 days, com pared to theE coli
DH5 tha t degraded 2 006% o f py rene on ly w ith in 21 daysTherefore, the transfo rm ed bacter ia presented a good pyrene deg rada tion
capab ility, and the plasm ids conta in the gene that can be able to encode fo r the deg radation of py rene
Key words: Po ly cyc lic arom atic hydrocarbons( PAH s) M ang rove Pyrene Degradativ e p lasm id
收稿日期: 20081215
作者简介:蔡丽希 ( 1980) ,硕士研究生,研究方向:环境生物修复; Em ai:l cail ixi06@ 163 com
多环芳烃 ( PAH s)普遍存在于环境中, 并在环境
中呈不断累积的趋势,其化合物多属强致癌物,因此
其生物降解受到广泛关注, 目前主要集中在降解基
因 [ 1, 2]和降解途径 [ 3, 4]等研究方面。研究表明, 负责
PAHS降解的基因簇有的位于染色体上 [ 5, 6] , 有的位
于质粒上 [ 7~ 9] , 能降解芳香族化合物的代谢酶通常
是由细菌的质粒基因编码的 [ 10]。本研究通过一种
简便的质粒提取方法最终获得含有降解芘的基因的
质粒, 为下一步克隆其相关基因打下了基础。
1 材料与方法
11 菌株来源
芘降解菌群 YL从泉州红树林表面沉积物中筛
选得到。
12 化学试剂与培养基
芘 ( Py rene)购于 S igma公司; 甲醇、二氯甲烷均
为色谱纯,购于江苏汉邦科技有限公司。
无机培养基 (MSM ) (mg /L ): (NH4 ) 2SO4 ( 1 000),
Na2HPO4 ( 800), KH2PO4 ( 2 00), M gSO4 H2O ( 200);
CaC l2 2H2O( 100); FeC l3 6H2O ( 5), ( NH4 ) 6MoO24
4H2O( 1), pH为 72, 121 灭菌 15m in。海洋细菌培养
基:蛋白胨 5 g,酵母浸膏 1 g,磷酸高铁 001 g,陈海水
1 000m ,l pH76~ 78芘丙酮母液: 用丙酮溶解芘,配
制成 5mg /m l的母液,经有机相一次性滤器过滤后封
口避光备用。PAH sMSM培养基:配制时,移取一定的
母溶液到己灭菌的无机培养基中,至芘的终浓度为 50
mg /L,过夜待丙酮挥发后接菌。碱裂解液 I(GTE): 50
mmo l L1葡萄糖、25 mmo l L1 TrisHC l( pH80)、10
mmo l L1 EDTA( pH80)。配制方法:称取 09 g葡萄
2009年第 5期 蔡丽希等:芘降解质粒提取方法的研究
糖, 2 m l 500 mmo l L1 EDTA ( pH80)加入 5 m l 500
mmol L1 TrisHC l( pH80), 用 ddH2O溶解并定容至
100m l。碱裂解液 II(现配现用 ): 02mol L1 NaOH,
1% SDS。配制方法:量取 2m l 1mol L- 1 NaOH溶液,
1 m l 10% SDS溶液,再加入 7m l ddH2O混匀。碱裂解
液 III(乙酸钾 ): 3 mol L1钾离子, 5 mo l L1乙酸根。
配制方法:量取 60 m l 5mo l L1乙酸钾,冰乙酸 115
m ,l 285m l ddH 2O溶解。
STET ( Tr itoux100 05% v /v; EDTA 50 mmo l/
m ;l T risH cl 50 mmo l/m ;l蔗糖 8%; pH 80)。
13 主要仪器
Ag ilent 1100 series高效液相色谱仪 ( G13 llA
泵, G1322A自动脱气机, G1315B紫外检测器 ), 色
谱柱为依利特 H ypersil 40 mm /250 mm ODS柱,粒
径 5 m, AL204型电子分析天平 (梅特勒 托利多仪
器 (上海 )有限公司 )。
14 质粒的提取
1. 4. 1 化学的改良方法 取芘降解菌群 YL液体培
养菌液 15m l置于已灭菌的离心管中, 4 , 12 000 r/
m in,离心 30 s;弃上清液 (尽量吸干培养液 ) ;用 TAE
洗下菌体, 4 , 10 000 r /m in,离心收集菌体于 Eppen
dorf( EP)管,加入 100 lTAE充分混匀菌体, 室温静
置 3~ 5 m in; 加入 300 l( 3% SDS, 50 mmo l/L Tris
Hc,l pH126) ,混匀, 65 水浴 10m in,至液体清亮;加
入等体积的氯仿 异戊醇 ( 241) , 混匀, 4 下
12 000 r/m in,离心 10 m in; 吸取上清液,加入两倍体
积的无水乙醇, 4 静置 30 m in, 4 下 12 000 r/m in,
离心 10m in,倒去上清乙醇溶液,把离心管倒扣在吸
水纸上,吸干液体。 1 m l 70%乙醇洗涤 1次, 4 下
12 000 r/m in,离心 1 m in, 弃上清液, 干燥 ( 37 烘箱
中,平放、开盖干燥 )。加入 20 l无菌去离子水 -
20 保存。
142 碱裂解法提取质粒 取液体培养菌液 15
m l置于已灭菌的离心管中, 4 12 000 r/m in, 离心
30 s;弃上清液 (尽量吸干培养液 ) ,加入 100 l预冷
的碱裂解液 I(GTE ), 涡旋振荡 (充分扩散菌体 ) ,室
温放置 5 m in。使用 EDTA是为了去除细胞壁上的
Ca
2+
, 使溶菌酶更易与细胞壁接触。配溶液 II(现配
现用, 取 200 l碱裂解液 II缓慢滴加入离心管,轻
轻混匀,颠倒 3~ 4次 (切勿振荡 ), 冰浴 5 m in使悬
浮液变澄清 ) ;取 150 l冰预冷的碱裂解液 III(乙
酸钾 )滴加入离心管, 反复颠倒数次, 涡旋振荡 1
m in, 立即冰浴 5 m in; 取出离心管, 4 12 000 r/m in,
离心 4 m in,取上清液 300 ,l移至已灭菌的新离心
管中;向上清液中加入等体积酚 /氯仿, 振荡混匀,转
速 10 000 r/m in, 离心 2m in, 将上清液转至新的离心
管中。用酚与氯仿的混合液除去蛋白,效果较单独
使用酚或氯仿更好。再加入 2倍体积的无水乙醇混
匀, 室温放置 2m in;离心 5m in,倒去上清乙醇溶液,
把离心管倒扣在吸水纸上, 吸干液体。 4 12 000
r/m in, 离心 10 m in,弃上清液; 1 m l 70%乙醇洗涤 1
次, 4 12 000 r /m in离心 1 m in, 弃上清液, 干燥
( 37 烘箱中,平放、开盖干燥 )。加入 20 l无菌去
离子水 - 20 保存。
143 CTAB法 取液体培养菌液 15 m l置于已
灭菌的离心管中, 4 , 12 000 r/m in, 离心 30 s; 用
200 l STET ( Tritoux100 05% v /v; EDTA 50 mmo l/
m ;l TrisHc l 50 mmol /m ;l蔗糖 8% ; pH 80)重悬菌
体;加入 5 l溶菌酶 ( 25mg /m l) ,充分混匀, 37 水
浴 5~ 7 m in;沸水浴 1 m in, 4 13 000 r /m in15m in;
用牙签小心挑去粘稠物;加入 10 l CTAB溶液, 混
匀, 在室温放置 2 m in。 13 000r/m in离心 5 m in, 弃
上清。用 300 lNaC l溶解沉淀。加入 750 l用冰
预冷的无水乙醇, 混匀后在冰上放置 20 m in。
13 000 /m in离心 15m in,弃上清。用 1 m l 70%的乙
醇洗涤沉淀。 13 000 r/m in离心 5 m in,弃上清。敞
开离心管盖子,室温将沉淀凉干。用 20 lTE溶解
DNA沉淀, - 20 保存。
144 酚和氯仿抽提法 (简称酚氯法 ) 将含菌接
种于 LB 培养基, 37 摇床过夜, 分装于 EP 管
( 10 000 r/m in 10 s) ,弃上清,沉淀用 150 l无菌水
悬浮,振荡混匀, 加等量酚 氯仿 异戊醇 ( 2524
1), 充分混匀, 12 000 r /m in 5 m in,吸取上清加入 2
倍体积的无水乙醇充分混匀, 12 000 r /m in, 10m in,
弃上清, 沉淀用 50 l含胰 RNA酶 (无 DNA酶 ) 10
g /m l的 TE悬浮,混匀, - 20 贮存备用 (张龙翔,
等, 1981)。
15 感受态细胞制备与转化
取 30 lEco li DH5菌液, 接种于 3 m l LB培
养液中,置恒温培养摇床中 37 培养约 3 h, 转速为
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
200 r /m in;将上述菌液平均分装入 2只 15 m l EP
管中, 于 4 4 000 r /m in离心 10 m in, 弃上清液;加
入预冷的 100mmol L- 1 CaC l2溶液 1m ,l振荡使菌
体悬浮,以台式高速离心机最大转度离心 30 s, 弃上
清液; 最后加入 100 l预冷的 100 mmo l- 1 CaC l2溶
液,使菌体悬浮, 置于 4 冰箱保存备用, 16 h后使
用,可保存 7 d。
于 50 l感受态细胞中加入 2 l连接反应物
(改良方法提取的质粒 ) , 轻缓转动混匀, 冰浴 30
m in, 42 热击 90 s, 迅速置冰上 2m in。加入 450 l
SOC液体培养基, 37 复苏 45~ 60 m in。
16 降解芘质粒的筛选与鉴定
将分别用 4种方法从混合菌液 YL提取的质粒
转化到 Ecoli DH5所得的转化菌, 取 30 l接种于
含 01mg /L芘的 PAH sLB培养基中, 37 , 150 r/
m in摇床避光培养。移取 2 m l培养液到 18m l含有
芘 50 mg /L的无机盐培养基中, 25 , 150 r /m in。
黑暗摇床培养,定期观察三角瓶中发生的浊度、颜色
的变化。约一个月后如发生明显变化后, 分别移取
2 m l的上层液到新配制的 18m l含有芘 ( 50 mg /L )
的无机盐培养基中,进行再富集培养约一个月,再重
复以上步骤;如此富集培养共进行 4次。得到能够
以芘为惟一碳源与能源的质粒转化菌。
将经诱导含降解芘的基因克隆株及原大肠杆菌
EcoliDH5。,分别接种至芘含量为 50mg /L的无机
培养基中, 25 , 150 r/m in摇床避光培养, 定时
取样 [ 12]。
2 结果与分析
21 质粒的提取
因为菌株是从环境中筛选出来的混合菌株,对
菌株和质粒都知之甚少,因此需要尝试不同的方法,
找到合适的、提取效果好的方法。一般来说,主要是
根据细菌种类、质粒的大小以及质粒提取后纯化的
方法来决定使用哪一种方法 [ 13]。其中质粒的大小
是决定质粒提取方法的关键。大质粒 ( > 15 kb)容
易受损,应采用温和裂解法使质粒能够温和的从细
胞中释放出来,避免由于裂解和释放过程过于剧烈
而造成破损;而小质粒,如载体质粒可以采用更为剧
烈的方法,让细胞暴露于去污剂,通过煮沸或碱处理
使之裂解 [ 14, 15]
1裂解法提取的质粒; 2化学改良方法提取的质粒; 3酚氯法提取
的质粒; 4CTAB法提取的质粒
图 1 菌群 SS5质粒的琼脂糖凝胶电泳图谱
从电泳结果看,化学的改良方法、碱裂解法提取
效果最好,有清晰的条带, 而 CTAB法、酚氯法提取
效果较差,几乎看不到条带。从电泳图可知本试验
驯化菌的质粒大小大约是 23 kb, 属于大质粒, 而
CTAB法采用煮沸的方法使细胞裂解, 较为剧烈, 适
合小质粒的提取 (图 1)。酚氯法操作过于简单, 细
胞未能完全裂解, 提取的量比较少, 所以质粒 DNA
的含量不高,几乎看不到条带。
22 降解芘质粒的筛选与鉴定
221 降解芘质粒的筛选 将分别用 4种方法从
混合菌液 YL提取的质粒转化菌群移接到含有芘
( 50 mg /L )的无机盐培养基中,最终只有化学改良
方法提取的质粒,转化到大肠杆菌后,能够以芘为惟
一的碳源与能源生长。该转化菌在富集培养 3个月
后, 培养液的颜色由乳白色逐渐出现白色混浊,然后
逐渐变为粉红色,最后培养液的颜色稳定不变,表明
质粒转化菌在降解芘的过程中产生某种或某些中间
产物,使培养液的颜色发生变化 [ 16]。
随后各阶段的富集培养, 培养基均可以看到以
上颜色变化过程,但所需要的时间逐渐变短,表明培
养液中的微生物利用 PAH s的能力在增强, 发生阳
性反应的时间在缩短, 微生物的酶体系己适应了
PAHs存在的环境, 并可将其作为生长基质。因此,
随着暴露于以 PAH s时间的延长, 微生物生长的延
滞期缩短。
2. 2. 2 降解芘质粒鉴定 将经质粒转化菌及原大
肠杆菌 E coliDH5。分别接种至芘含量为 50mg /L
的无机培养基中,其芘降解率的比较结果列于表 1,
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2009年第 5期 蔡丽希等:芘降解质粒提取方法的研究
在处理 21 d后, 质粒转化菌培养物中芘含量从 50
mg /L下降到 7115 mg /L, 芘去除率达 8569%, 而
受体菌 Ecoli DH5的芘降解率仅为 2006%。由
此证明降解质粒已成功转化进宿主细胞, 并发挥降
解作用 [ 8, 17]。
表 1 大肠杆菌 DH5与质粒转化菌芘降解率的比较
菌株 处理时间
( d)
处理前
(m g /L)
处理后
(m g /L)
芘降解率
(% )
大肠杆菌 7 49358 1284
DH 5 14 50 49561 0878
21 48977 2006
7 27014 4597
质粒转化菌 14 50 14333 7133
21 7155 8569
目前研究发现 PAHs的降解基因与质粒有密切
联系 [ 18]。质拉 DNA提取的方法较多,但稳定性差,
时有核 DNA的渗入或质粒的损伤干扰。选用几种
质粒提取法加以研究, 经对比发现, 该改良方法简
单、快速比常用的碱裂解法更适用本试验驯化菌质
粒的提取。并且成功地通过导入质粒的方法创造新
菌株, 获得新的的降解能力,为下一步克隆其相关基
因打下了基础。
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