全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-26
作者简介:李玉(1977-),女,汉,河北迁安,讲师,研究方向:酶工程;E-mail:liyu@tust.edu.cn
通讯作者:路福平,Tel:86-022-60272061;E-mail:lfp@tust.edu.cn
甾体激素类药物是临床上不可缺少的一类药物,对机体起着非常重要的调节作用[1]。目前甾体药物生
产常用的方法是利用化学合成和微生物转化相结合的工艺路线,即其中关键几步反应采用微生物转化法
实现,如 A环 C1,2-位脱氢、11α-羟基化、11β-羟基化等。微生物对甾体的转化不同于微生物的次级代谢,它
是通过微生物体内的一种酶或酶系而发挥作用的。人们已从不同微生物细胞内制备得到了甾体 C1,2位脱
氢酶,并对影响酶活性的有关因素进行了研究。
简单节杆菌(Arthrobactersimplex)3-甾酮-1-脱氢酶(KSDH),也称为甾体 C1,2位脱氢酶,是甾体母核降
解的关键酶,它是一种胞内酶[2],也是诱导酶[3],只有当培养基中添加了具有 C1,2位饱和键的 3-甾酮化合物
时,该酶才能表达。目前,编码该蛋白的全基因(ksdD)序列已被测出[4],并已被克隆到链霉菌的重组质粒
上,使链霉菌能大量合成 C1,2位脱氢酶,其酶活力大大提高。另外,Robert等[3]利用 pET-3表达载体,还实现
了红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的 kstD2基因(编码 3-甾酮-1-脱氢酶的同工酶)在大肠杆菌中的表
达。在此基础上,尝试利用大肠杆菌表达系统,实现简单节杆菌 ksdD基因在大肠杆菌中的表达,并对表达
产物及其酶活力进行分析,为实现甾体化合物的酶法体外脱氢奠定基础。
3-甾酮-1-脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达及甾体转化研究
李玉 王稳航 刘逸寒 路福平 杜连祥
(天津市工业微生物重点实验室 天津科技大学生物工程学院,天津 300222)
摘 要: 将简单节杆菌 3-甾酮-1-脱氢酶基因(ksdD)克隆到大肠杆菌表达载体 pET-22b(+)上,构建重组质粒
pET-ksdD,利用 IPTG诱导酶在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达,4h后取样,分别对超声破碎后的上清和沉淀进行 SDS-
PAGE和酶活分析,结果表明表达出的 3-甾酮-1-脱氢酶的分子量大约为56kD,超声破碎后的细胞破碎液对4-AD的转
化率较简单节杆菌提高了近10倍。
关键词: 3-甾酮-1-脱氢酶 大肠杆菌 表达 甾体转化
HeterogenousExpressionof3-Ketosteroid-△1-Dehydrogenase
Gene(ksdD)inE.coli
LiYu WangWenhang LiuYihan LuFuping DuLianxiang
(TianjinKeyLabofIndustrialMicrobiology,ColegeofBiotechnology,TianjinUniversityofScience& Technology,
Tianjin300222)
Abstract: 3-Ketosteroid△1-Dehydrogenasegene(ksdD)ofArthrobacterSimplexwasclonedintoexpresionvector
pET-22b(+)constitutingrecombinationvectorpET-ksdDwhichwastransformedintoBL21(DE3).Positivetransformant
wascultivatedandIPTG wasaddedintoculturetoinduceexpresionof3-Ketosteroid-△1-Dehydrogenase.After4h
induction,thesupernatantandsedimentationaftersonicdisruptionwereanalyzedbySDS-PAGE,andwereusedforin
vitrosteroidtransformationtest.Theresultindicated3-Ketosteroid-△1-DehydrogenasewasexpresedinE.colisuccesfuly.
Themolecularweightofexpresedproteinwasabout56kD.Thetransformationrateof4-AD bycelextractsofE.coli
recombinantsimproved10foldersthantheextractsofArthrobactersimplex.
Keywords: 3-Ketosteroid△1-Dehydrogenase E.coliExpresion Steroidtransformation
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
1 材料和方法
1.1 菌株与质粒
简单节杆菌(ArthrobacterSimplex)为 C1,2位脱氢酶基因的受体菌,大肠杆菌 JM109和 BL21(DE3)分别
为克隆和表达的宿主菌,克隆/表达载体 pET-22b(+)。所有质粒和菌株均为本实验室保存。
1.2 培养基
大肠杆菌培养用 LB培养基,简单节杆菌液体培养基组成为(W/V):1%葡萄糖,1%玉米浆,0.5%蛋白
胨和 0.25%的 KH2PO4,pH值 7.0。
1.3 酶与主要试剂
TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、DNA分子量标准和 DNA片段的琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购自
Takara公司,氨苄青霉素、PCR产物纯化试剂盒、UNIQ-10柱式 DNA回收试剂盒、promegaDNA纯化试剂
盒、T4DNA连接酶、蛋白质分子量标准等均购自上海生物工程有限公司。
1.4 引物设计与模板制备
参照 Genbank(序列号:D37969)上报道的简单节杆菌 C1,2位脱氢酶基因序列设计引物,上游引物 P1:
5-AAGGATCCATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3(下划线部分为加入的 BamHⅠ酶切位点,方框内为新组成的
NcoⅠ酶切位点),下游引物 P2:5-TTAAGCTTTCATCGCGCGTCCTCGG-3(下划线部分为加入的 HindⅢ酶切
位点)。基因组 DNA提取、质粒 DNA制备等方法及操作均见文献[5]。
1.5 PCR扩增及重组质粒构建
挑取平板上简单节杆菌的单菌落,接种于 5ml液体培养基中,37℃振荡培养过夜,按细菌小量快速提
取方法提取染色体 DNA,提取结果经 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。以提取的简单节杆菌染色体 DNA
(10ng)为模板,63℃退火,扩增目的基因。将 PCR产物以及提取的质粒 pET-22b(+),分别用 NcoⅠ和 Hind
Ⅲ进行双酶切,酶切产物经纯化回收后,用 T4DNA连接酶于 16℃连接过夜,利用电转化法转入大肠杆菌
JM109中,通过氨苄青霉素抗性平板筛选转化子,然后对转化子质粒分别用 PCR和双酶切法进行鉴定,并
挑取阳性转化子进行测序。再将验证完全正确的阳性转化子的质粒转入表达宿主菌 BL21(DE3)中诱导表
达。
1.6 重组 pET-22b/ksdD的诱导表达
将构建好的工程菌株 BL21/pET-ksdD和对照菌 BL21/pET-22b(+)分别接种于 2ml的 LB液体培养基
中,37℃水浴振荡培养过夜,按 1%的接种量转接于装有 30ml培养基的 250ml的三角瓶中继续培养 3.5h,
加入IPTG(终浓度为1mmol/L),30℃诱导表达[6]。4h后,4000r/min冷冻离心收集菌体,用磷酸缓冲液(pH7.4)洗
菌体两次,并悬于少量该缓冲液中,冰浴超声,破碎菌体,12000r/min冷冻离心 5min,取上清和沉淀分别
用于 SDS-PAGE和酶活测定。SDS-PAGE采用的分离胶浓度为 10%,浓缩胶的浓度为 5%,考马斯亮兰染
色。
1.7 KSDH酶活检测
酶活检测采用活性染色法[6]。活性染色法是一种简单定性的方法,样品经 12%非变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳后,用含有甾体底物 4-AD(4-烯-雄甾-3,17-二酮)、PMS(吩嗪硫酸甲脂)和 NBT(硝基蓝四氮盐)的
66.7mmol/L的 Tris缓冲液进行显色,出现活力条带后用 10%的乙酸终止反应,并以 ADD(1,4-二烯-雄甾-
3,17-二酮,4-AD脱氢后的产物)为底物作为对照。
1.8 甾体底物的体外转化
利用适当浓度的细胞破碎液对甾体底物 4-AD (300μmol/L)进行转化反应,反应混合物还包括
66.7mmol/LTris-HCl(pH8.5)和 15μmol/LPMS,37°C下反应 8h。用甲醇从反应液中提取出甾体化合物,并稀
释一定倍数后 HPLC法分析产物生成情况。采用的流动相为 75%的甲醇,检测波长为 254nm,利用内标法
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计算底物的转化率。
2 结果
2.1简单节杆菌基因组 DNA提取及 PCR扩增
以提取的染色体 DNA为模板,扩增出的目的条带如图 1所示。从图 1中
可知,目的片段出现在 1.5kb左右,大小与报道的 1 548bp相符。
2.2重组质粒 pET-ksdD的构建及转化大肠杆菌
将 PCR扩增得到的目的基因进行纯化,用 NcoⅠ和 HindⅢ双酶切,酶切产
物再经纯化后,琼脂糖凝胶电泳检测。同时也将质粒 pET-22b(+)用 NcoⅠ和
HindⅢ进行双酶切,纯化,最后采用 T4DNA连接酶 16℃过夜连接,构建成重组质粒 pET-ksdD。将重组质粒
利用电转化法转入大肠杆菌 JM109中,利用氨苄青霉素(Amp)抗性平板筛选转化子,分别用 HindⅢ和 Nco
Ⅰ-HindⅢ单酶切和双酶切转会子质粒,并以转化子质粒为模板,进行 PCR扩增,同时用 pET-22b(+)空质
粒作模板进行 PCR作为阴性对照,结果如图 2所示。电泳检测结果表明重组子质粒中已连接有目的基因
ksdD。
2.3序列测定
对重组质粒 pET-ksdD上的目的片段 ksdD进行核苷酸序列测定(上海博亚生物工程公司),所得到的
基因全长为 1 548bp,大小与 Genebank中所报道的一致,只是在 1 115bp的位置发生了碱基置换,T→C,相
应的氨基酸也发生了改变,Leu→Pro,但该氨基酸并不位于酶的活性中心,从理论上讲并不影响酶的活性。
KSDH的活性中心是位于 219位至 245位的 27个氨基酸残基:RRAIRARRGVLLAAGGFEANDELRQKY)[4]。
2.4 KSDH的诱导表达
将验证正确的重组质粒转入大肠杆菌 BL21(DE3)中,利用材料与方法中的步骤对重组子进行诱导表
达,分别对超声破碎后的上清液和沉淀进行 SDS-PAGE,结果如图 2所示。从图 2中可以看出,表达出蛋白
的分子量为 56kD,大小与 Choi等[7]所报道的 54.3kD一致。另外,从图中还可以看出,利用超声破碎得到的
上清液中也含有目的蛋白,只是含量较低,说明表达出的蛋白只有少数可溶,而大部分的目的蛋白存在于
沉淀中。
2.5酶活检测
利用活性染色方法对破碎后上清中的 KSDH酶活进行了检测,结果如图 3所示。从图 3中可以看出,
在大肠杆菌中表达出的 KSDH具有活性,但是与简单节杆菌相比,活力很低。而在显色添加底物 ADD的对
照样无活力条带出现,说明 KSDH对 C1,2位具有不饱和双键的 ADD不起作用。
图 1 PCR扩增结果
1:PCR产物 2:1kb DNA ladder
图 2 KSDH在大肠杆菌中的表达
1: BL21/ pET-22b(+)上清 : BL21/pET-ksdD上清 3: BL21/
pET-ksdD沉淀 4: BL21/ pET-22b沉淀 5:蛋白分子量标准
图 3 非变性凝胶的活性染色图
1: Arthrobacter simplex上清 2:重组 E.coli上清
3: ADD作为底物的阴性对照
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2.6 甾体底物的体外转化
分别利用超声破碎后的上清和沉淀对甾体底物 4-AD进行体外转化,37℃反应 8h,每隔 1h取样,并同
时比较了简单节杆菌诱导后的细胞破碎液对 4-AD的转化情况,结果如图 4所示。从图 4中可以看出,反
应时间为 4h时,4种不同组分对 4-AD的转化率均达
到最高,后 2h转化率基本不变。重组大肠杆菌胞内可
溶性部分的酶活较简单节杆菌低,而在大肠杆菌中表
达的 KSDH的酶活主要存在于细胞膜部分,且这部分
的酶活比简单节杆菌高出将近 10倍。这与睾丸酮假
单胞菌 (Pseudomonastestosteroni)3-甾酮-1-脱氢酶在
大肠杆菌中的情况类似,Patrich等[8]通过制备原生质
体、破碎细胞和超高速离心(100000g)等方法,对在
大肠杆菌表达出的目的产物进行精确定位,结果表明
有 82.7%的活性成分存在于内膜部分,12.3%存在于外膜部分,只有 3.3%的部分是可溶的。
3 讨论
利用简单节杆菌在甾体母环的 C1和 C2之间引入双键,在国内外医药生产中已得到了广泛的应用,而
对在此反应中起关键作用的酶,目前国内的报道还很少。简单节杆菌 3-甾酮-1-脱氢酶是一种单亚基酶,相
对分子质量为 54.3kD,等电点为 6.6,酶反应的最适温度和 pH值分别是 40℃和 10.0[9]。该酶既是胞内酶、
诱导酶,还是一种膜蛋白[10],2个位于 193~214和 379~401位的疏水性氨基酸区段可能构成了它的跨膜区[4]。
而膜蛋白的高效表达却一直是一个世界性的难题,过量表达时又很容易在膜内聚集形成不可溶的包涵体,
影响酶的正常结构和功能,造成酶的活力降低,目前多采用融合表达的形式来增加膜蛋白的可溶性[11]。
对 3-甾酮-1-脱氢酶在大肠杆菌中的克隆与表达做了初步的探讨,利用含有 T7启动子的分泌表达载
体 pET-22b(+),实现了 3-甾酮-1-脱氢酶在大肠杆菌中的活性表达,尽管表达量和可溶性部分的酶活不如
其在链霉菌中表达的高[12],但其位于细胞膜上的部分却比简单节杆菌高出将近 10倍。这一结果使利用重
组菌株的细胞破碎液对甾体底物进行转化成为可能。因为传统的甾体转化都是利用活细胞法,即在细胞生
长的一定时期直接向培养基中投入底物,待转化一定时间后再从中提取出转化产物,这一操作过程简便快
捷,但是可操作性和连续性差,产物的分离和提取困难。单纯利用酶法对甾体底物进行转化成本很高,细胞
破碎液则简化了操作过程,并且可以利用简单的柱式反应器对甾体底物进行转化,大大提高了转化反应的
连续性。另外,破碎了的细胞消除了底物与酶结合的障碍,使酶更容易作用于底物而发生催化反应。
参考 文献
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图 4 细胞不同组分对 4-AD的转化结果
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