全 文 ：2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法·
收稿日期:2007-11-26
基金项目:生物环境科学与技术研究所科研启动项目“纳米生物技术在重金属污染生物修复中应用的研究”(编号06A02)
作者简介:李樊(1980-),女,湖南永州人,研究生,从事生物技术研究
通讯作者:何钢(1965-),男,湖南湘潭人,教授,硕士,从事生物技术教学和科研;E-mail:hegong262@yahoo.com.cn
引言
基因敲除作为近几十年新兴的一种重要的重
组 DNA技术,在微生物代谢工程研究中,利用 λ
噬菌体的 Red系统在细菌中进行的基因敲除技术
和 PCR介导的酵母基因中断技术,广泛应用于构
建具有特定突变的工程菌,改变生物代谢途径,阻
断副反应的进行,防止副产物或有毒产物形成,促
进目的产物积累等方面;在生物医学研究中,RNAi
现象广泛存在于真核生物体内,操纵着许多细胞功
能,如参与了细胞正常的生长、发育调控,稳定转座
子,同时调控机体抵御外来病毒的入侵。总之,基因
敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最
前沿,并已对生物学和医学的许多研究领域产生深
刻的影响,成为革命性的研究工具,具有极其重要
的理论意义和实践意义[1]。
1 原核中断系统
1.1 Red系统的机制
Red系统是原核中断系统的代表,由 λ噬菌体
exo、bet、gam3个基因组成,它们分别编码 Exo、
Beta、Gam3种蛋白质。Exo蛋白是一种核酸外切酶,
单亚基的分子量为 24kDa,这种蛋白的活性形式是
一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道
的一端可容纳双链 DNA分子,另一端只可容纳单
链 DNA[2,3]。Exo蛋白可结合在双链 DNA的末端,从
DNA双链的 5′端向 3′端降解 DNA,产生 3′突出
端。Beta蛋白是一种退火蛋白,单亚基的分子量为
25.8kDa。在溶液中,Beta蛋白自发地形成环状结
构,紧紧地结合在单链 DNA3′突出端,防止 DNA被
基因敲除技术研究进展
李樊 1,3 刘义 1,2 何钢 2
(1中南林业科技大学生命科学与技术学院,长沙 410004;2中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙 410004;
3中南林业科技大学实验中心,长沙 410004)
摘 要: 基因中断技术是研究基因功能和实现基因的精确缺失重要手段。原核中断系统最近发展较快的是利用
λ 噬菌体的Red系统在细菌中进行的基因敲除技术,但多在大肠杆菌中进行;真核中断系统属PCR介导的酵母基因中
断技术和RNAi干涉技术发展最快。这几种中断技术都大大简化了实验操作,缩短了实验时间,在研究生物基因组中未
知基因及蛋白质的功能等领域具有诱人的应用前景。
关键词: 基因敲除 Red系统 酵母 RNAi干涉
StatusofGeneKnockout
LiFan1,3 LiuYi1,2 HeGang2
(1ColegeofLifeSciences&Technology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004;
2InstitueofBiologicalandEnvironmentalScience&Technology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,
Changsha410004;3ExperimentCenter,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004)
Abstract: Geneknockoutwasaimportantwayingene’sfuctionandpreisedisruption.Themostdevelopmentof
prokaryocytegeneknockoutwasRedsystem usingλphagebutusualyinEcoli.Whilethatofeukaryocytegene
knockoutwasPCR-mediatedgenedisruptiontechniqueinYeastandRNAi.Thesekindsoftechquessimplifiedoperation
andneededlestime.Theyhadagoodprospectinstudinggenomicunknowninggenesandfuctionofproteins.
Keywords: GeneknockoutRedsystem YeastRNAi
2008年第2期
单链核酸酶降解,同时介导互补单链 DNA的退火[4],
双链 DNA退火完成后,Beta蛋白从 DNA双链上解
离下来。Beta蛋白在 Red同源重组过程中起着决定
性的作且重组效率远高于 RecA重组(图 1)。
1.2 Red同源重组及报告基因的剔除(图 2)
Ha和 Hb:同源重组区域;Pa和 Pb:引物位点;
sm:筛选标记 Red重组技术利用较短的同源序列,
即可使外源 DNA片段与靶标分子完成重组作用,
但通常在靶标分子上留下筛选标记基因,染色体或
载体上含有筛选标记,有可能影响其生物功能。Red
重组技术与其它基因工程技术结合运用,有效地解
决了以上问题。目前利用 Red重组技术进行基因工
程研究的策略主要有以下 4种[6]:(1)一步筛选(2)
筛选+反向筛选 (3)筛选+位点特异性重组 (4)筛
选+限制性酶切反应。其中第三种策略应用更为广
泛,首先是,筛选标记基因的两侧含有可被 Cre或
FLP位点特异性重组酶识别的特殊位点,经过第一
次筛选的重组分子可通过位点特异性重组酶的作
用将筛选标记基因删除,但在重组分子上留下 34
(或 36)bp的特殊序列。Red同源重组技术同其它
DNA实验技术的组合使用,大大丰富了基因操作
的技术手段。研究人员可灵活的运用这些实验技
术,以达到不同的实验目的。
2 真核中断系统
2.1 酵母中断系统
酵母中断系统是真核中断系统的代表之一。
1993年 Baudin等提出了一种后人称之为短侧翼同
源区 PCR(shortflankinghomologyregion-PCR,SFH-
PCR)介导基因中断的方法。这种方法既不需要克隆
目标基因,也不需要寻找酶切位点,整个中断盒的
构建只需一次 PCR即可完成。 PCR的引物由两部
分构成,外侧部分与目标基因 5或 3非编码区同
源,用于与酵母内的目标基因重组,内侧部分与报
告基因互补,用于 PCR扩增报告基因,构建中断
盒。SFH-PCR中断法虽然更加简便,但受引物长度
的限制,用于体内重组的酵母同源序列不可能很
长,中断的效率往往较低。1996年 Wach提出了长
侧翼同源区 PCR (longflankinghomologyregion-
PCR,LFH-PCR)介导的基因中断法。该方法通过两
轮 PCR完成中断盒的构建。第 1轮 PCR扩增目标
基因的 5和 3不翻译区,第 2轮 PCR以第 1轮
PCR产物作为引物扩增报告基因。这样构建的中断
盒内酵母同源部分可达数百 bp,大大提高了中断
效率。与传统的中断方法相比,PCR介导的中断最
大的优点是不需克隆目标基因,只要知道该基因的
序列信息,即可以实现精确的缺失[7](图 3)。
2.1.1 位点特异重组酶介导报告基因的剔除 1989
年 Cregg[9]等在报告基因和酵母同源序列之间加入
图 1 Red重组机制示意图[5]
图 2 Red同源重组技术用于基因打靶[5]
图 3 PCR法构建中断盒[8]
李樊等:基因敲除技术研究进展 81
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了 2μ质粒中的位点特异重组酶识别序列 FRT。缺
失目标基因后,再转入 2μ质粒编码的位点特异重
组酶基因 FLP,FLP基因的表达造成 FRT序列之
间的重组并剔除报告基因。1994年 Sauer[10]在报告
基因和酵母同源序列之间加入了 E.coli噬菌体 P1
的位点特异重组序列 loxP,利用其位点特异重组酶
Cre剔除报告基因。但这两种方法只是提高了剔除
报告基因的效率,不能解决残留序列之间重组造成
的染色体重排。1999年 Storici[11]等成功解决了这一
问题。以往的研究表明,由 8bp核心序列加上两端
各 13bp的反向重复构成的最小 FRT序列就可以在
FLP酶的作用下完成定点重组,而两个 FRT的 8bp
核心序列中一个碱基的差异即可导致重组不能发
生。Storici等用不同的突变 FRT构建中断盒以中断
不同的基因。由于各突变 FRT核心序列不一样,避
免了残留 FRT之间的重组。而且,他们把 FLP基因
直接克隆在中断盒里,而不是由另外的质粒携带,大
大简化了操作,减少了对报告基因种类的需求[12]。
2.2 RNAi系统的分子机制
RNAi系统是真核中断系统的另一代表。其分
子机制现在还没有完全弄清楚,在线虫、果蝇、植物
和动物卵细胞的 RNAi试验中,相继发现了一些与
RNAi作用相关的酶和蛋白质。RNAi在哺乳动物中
的机制基本上与果蝇和其他低等生物中 RNAi的
机制相似[13]。现在公认的 RNAi的分子机制模型,把
RNAi发生的基本过程分为起始阶段和效应阶段。
在起始阶段,RNAII家族的双链特异的核糖核酸
酶(在果蝇中命名为 Dicer)及其可能的 dsRNA结合
因子,以 ATP依赖的方式将长片段 dsRNA切割成
21bp~23bp的 siRNA。在效应阶段,siRNA组装成一
个 siRNA-核糖核蛋白复合体(siRNP),siRNP重排形
成 RNA诱导的沉默复合物 (RNA-inducedsilencing
complex,RISC)。这一重排推测是在 Argonaute蛋白
家族中的一个成员与其他辅助因子(如催化亚基)协
助下完成的。RISC以 ATP依赖的方式催化双链
siRNA解旋。利用 RISC内部的单链 siRNA,通过碱
基配对识别与之互补的靶 RNA,切割靶 RNA,并由
RNA酶降解,从而导致目的基因的沉默。RISC可再
次激活以催化另一轮的 RNA切割。大多数哺乳动
物细胞中转染长于 30nt的核苷酸会激活抗病毒的
干扰素途径,引起非特异性基因表达抑制,所以多
采用直接导入 RNAi的效应分子 siRNA,诱导哺乳
动物细胞产生基因特异性表达抑制。由于在原核细
胞中共翻译,所以在原核细胞中不能使用 RNAi技
术[14]。
3 展望
以 Red重组系统为基础的基因敲除是最近研
究较热的技术方法,对研究微生物基因的功能具有
重要的促进作用。它与传统的基因敲除方法相比,
重组效率明显提高。Muyrers在实验中利用 Red重
组系统时获得的候选株 80%是正确的重组子。
Swaminathan[15]也在其一篇论文中阐述了利用 Red
重组可达到较高的成功率,且无需采用筛选基因即
可鉴定正确的重组子。此方法利用线性打靶 DNA,
不需构建打靶质粒。因此,实验周期大大缩短。但到
目前为止,此系统还主要应用于大肠杆菌的基因整
合和敲除,在其它菌株获得成功的实例较少。酵母
基因中断技术是研究酵母基因功能的重要手段,自
80年代初诞生以来经历了不断的改进和发展。PCR
介导的酵母基因中断技术,实现了酵母基因的精确
缺失;酵母基因的多重中断技术,可在酵母内实现
多个基因的中断;可进行大规模基因中断和功能分
析的酵母基因中断技术,适应了在酵母全基因组测
序完成的情况下进行功能基因组学研究的要求。酵
母基因中断技术对人类基因功能研究也有很大启
示作用。RNAi技术的应用刚刚起步即已显示了广
阔的应用前景,但仍面临一些尚未解决的问题,如
可能存在一些基因或组织具有抵抗 RNAi的能力;
哺乳动物中 RNAi的抑制效果不如低等生物的效
果好,并对丰富表达的靶基因抑制效果不高;RNAi
技术在哺乳动物整体水平的研究还只是涉及了大
鼠和小鼠 RNAi并不是完全靶特异性的,一些研究
中出现脱靶的负效应;还应当进一步提高 siRNA或
shRNA导入细胞的效率等。我们相信,随着人们对
RNAi研究的不断深入,RNAi技术将对医学和生物
学的发展产生深远的影响,有着更加广阔的应用前
景。
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逆转录酶治疗(HARRT)、免疫疗法等各种疗法、新
药物开发及新型疫苗开发、工程材料科学、等各种
手段和技术充分结合,进行优势互补,才可能尽快
打赢艾滋病的这场战争。我们相信,随着对 HIV-1
各种研究的不断深入、成熟和融合,RNA干扰这一
有力武器,将帮助人类在对艾滋病战争中更快走向
胜利。
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