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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 5期
人参总皂苷对人红白血病细胞株
(K562)中 STAT5表达的影响
罗春燕 1
官涛1
王红宁1
杨艳 2
姜蓉 1
胡晓舒 1
华自森 1
王建伟 1
( 1 重庆医科大学 干细胞与组织工程实验室,重庆 400016; 2 重庆市医药高等专科学校,重庆 400016)


摘
要:
旨在探讨人参总皂苷对 K562细胞 STAT5表达的影响。M TT法显示 TSPG对 K562细胞增殖抑制程度呈剂量
与时间依赖性增加, 且呈正相关关系。流式细胞术表明 TSPG能阻止 K562细胞从 G0 /G1期向 S、G2 /M期移行。激光共聚焦显
微镜观察可见, TSPG 200 mg /L作用 K562细胞 24 h,胞浆中的 STAT5荧光强度增加, 而胞核内 STAT5荧光强度减弱。W estern
b lo tting结果显示, TSPG作用 K562细胞 6、24、48 h,胞核中 STAT5表达较对照组减少, TSPG作用 72 h胞核蛋白中 STAT5表
达增加; TSPG作用 K562细胞 6、12、24、48、72 h,胞浆内 STAT5表达增加。TSPG能减少 K562胞核中 STAT5的表达, 这可能
是 TSPG抑制 K562细胞增殖的作用机制之一。
关键词:
人参总皂苷
STAT5
K562细胞
胞质
胞核
Effect of STAT5 in the Regulation of Total Saponins of
Panax G inseng to K562 Cells
Luo Chunyan
1
Guan T ao1
W ang Hongning1
Yang Yan2
Jiang Rong1
Hu X iaoshu
H ua Z isen1
W ang Jianwei1
(
1
Chongqing M edical University, Laboratory of Stem Cell and T issue Engineering, Chongping 400016;
2
Chongq ing M ed ical and Pharmaceutical College, Chongqing 400016)


Abstrac:t
The research w as to investiga te the effec t o f tota l sapon ins of panax g inseng on express ion of STAT5 in K562 ce lls
The
effect o f TSPG on pro liferation o fK562 ce lls was exam ined byM TT, flow cy tom etry
The expression o f STAT5 in K562 ce lls was investi

ga ted by laser scann ing confocal m icroscope( LSCM ), and STAT5 in the cy top lasm a and nuc leus o f K562 ce lls w ere determ ined by
W estern b lo tting ana lysis, respective ly
M TT show ed tha t pro liferation o fK562 ce llsw as inh ib ited by TSPG in tim e
dependent and con

centration
dependent m anner
F low cytom etry ana lys is indicated that TSPG b locked K562 ce ll cycle from G0 /G1 to S and G2 /M phase

Under LSCM, fluo rescence intensity in cytoplasm a o fK562 ce lls stim ulated by 200 m g /L TSPG fo r 24 h w as stronger than tha t of con

trol group, wh ile fluorescence in tensity in nuc leus of K562 ce lls becam e weake r
A s de term ined byW estern blotting, the expression of
STAT5 in nucleus of K562 ce lls decreased a fter TSPG treatm ent fo r 6 , 24 and 48 h, how ever, the expression of STAT5 in nucleus of
K562 ce ll induced by TSPG for 72 h increased compared w ith contro l group
The expression of STAT5 in cytoplasm of K562 ce lls in

creased afte rTSPG treatm ent for 6, 12, 24, 48 and 72 h
These results suggested that TSPG reduced the expression o f STAT5 in nuc le

us o f K562 ce l,l wh ich m ight be based on m echan ism s by wh ich TSPG inh ib it K562 ce lls to pro liferate

Key words:
To tal sapon ins o f panax g inseng
STAT5
K562 ce ll
Cy toplasm a
Nucleus
收稿日期: 2008
10
28
基金项目:重庆市科委自然科学基金课题 ( 2007BB5304) ,重庆医科大学课题 ( NSFLX200616)
作者简介:罗春燕 ( 1982
) ,女,硕士研究生,研究方向:干细胞生物学
通讯作者:王建伟, E
m ai:l w jw cq@ yahoo
com
cn


人参是祖国传统医学的
补气
要药, 人参总皂
苷 ( to tal saponins of panax g inseng , TSPG )是人参的
主要药理活性成分。以往研究表明, TSPG既能促进
造血干 /祖细胞增殖分化及其信号转导,又能抑制白
血病细胞增殖,并可诱导白血病细胞凋亡和向较成
熟细胞分化 [ 1, 2] ,但其作用机制尚不清楚。 STATs信
号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡关系密切,该
通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化。本
2009年第 5期 罗春燕等:人参总皂苷对人红白血病细胞株 ( K562)中 STAT5表达的影响
研究初步探讨 TSPG对 K562细胞 STAT5表达的影
响,为阐述 TSPG抗白血病机制提供实验依据。
1
材料与方法
1
1
材料
1
1
1
人红白血病细胞株 K562细胞 (H um an erythro
leukem ia cell line)本校基础医学研究所惠赠, 用含
10% (体积分数 )小牛血清 RPM I 1640培养,每 2~ 3 d
换液传代,取对数生长期的细胞进行试验。
1
1
2
人参总皂苷 ( total saponins of panax g inseng,
TSPG) :重庆中医研究所惠赠,纯度 98%以上, RPM I

1640培养液配成 1 g /L的工作液,正压过滤除菌。
1
1
3
主要药品与试剂
RPM I 1640培养基 (美国
GIBGO公司 ) ,小牛血清 (杭州四季清公司 ), STAT5
抗体 (美国 Ce ll Signal公司 ),四甲基偶氮唑盐 (MTT )
(美国 M luka公司产品 ), 二甲基亚砜 ( DM SO ) (美国
M erk公司产品 ), F ITC标记山羊抗兔 IgG ( Santa Cruz
公司 ) , P I( Ce llS ignal公司 ), GAPDH抗体 ( Ce ll S ignal
公司 ), SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS
PAGE )次高
分子量标准蛋白质购自中国科学院上海生物化学研
究所,聚偏二氟乙烯印记膜 ( PVDF膜, 0
45
m )购自
美国 NEN公司,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG
(H + L) (北京中杉金桥生物技术有限公司 ),胞浆、核
蛋白提取液 (美国 B ioV ision公司 ) ,聚丙烯酰胺凝胶
试剂盒 (碧云天生物公司 )。
1
2
方法
1
2
1
细胞增殖试验 (MTT法 )
取对数生长期的
K562细胞, 加入培养体系, 使细胞终浓度为 1
105
个 /m ,l按每孔 100
l接种于 96孔培养板。对照组:常
规培养; TSPG组:在 96孔板培养体系中加入 TSPG (终
浓度分别为 100、200、300、400 mg /L )。每组设 6个复
孔,分别培养 72 h和 120 h。然后加入 MTT ( 20
l/
孔 ),继续培养 8 h, 1 000 r /m in 15 m in离心,弃上清;加
入 DM SO 200
l/孔,震荡 10 m in,以自动酶标读数仪 (

= 570 nm )测定 A值,检测不同浓度的 TSPG对 K562
细胞增殖的影响,同时也可推测各浓度 TSPG对 K562
细胞的抑制率:
抑制率 ( IR ) = ( A无药组
A 用药组 ) /A 无药组

100%。
1
2
2
细胞周期测定
取对数生长期的 K562细
胞,加入 2 m l培养体系中, 使细胞终浓度为 1
106
个 /m l。对照组: 常规培养; TSPG组: 加 TSPG, 使终
浓度分别为 100、200、300、400 m g /L。置 37
含 5%
CO 2的孵箱中培养, 于第 3 d(即 72 h)取出。用冷
的 PBS洗涤 2次, 70%冰乙醇固定, 4
存放。测定
前去除固定液,加入 RNA酶工作液和碘化丙啶, 4

染色处理 30 m in,过 300目滤网后上流式细胞仪,每
例标本测定 3
104个细胞, 数据经计算机处理, 分
析得出细胞周期各时相比例。
1
2
3
激光共聚焦显微镜
实验分组,对照组: 常规
培养; TSPG组:在培养体系中加入 TSPG (终浓度为
200 mg /L) ,培养 24 h, 4%多聚甲醛固定 10 m in, PBS
洗涤 3次,调节细胞浓度为 1
106个 /m ,l离心图片。
用 0
5%小牛血清 ( PBS稀释 )室温封闭 30 m in, 加
1
Triton PBS稀释的兔抗人 STAT5一抗,室温孵育 1
h, 4
过夜, PBS漂洗后加入 FITC标记的山羊抗兔
IgG二抗,室温孵育 40 m in,加入 PI,室温作用 2 m in,
PBS漂洗后甘油封片,激光共聚焦显微镜 (MRC
1024
B ioR ad, W atford, UK )观察并采图。
1
2
4
W estern b lo tt ing法
实验分组: 对照组 (常
规培养 )和 TSPG组 ( 200、300、500 m g /L )。调节各
组细胞浓度为 1
106个 /m ,l分别培养 6、12、24、48
和 72 h,收集细胞。用核浆蛋白提取试剂盒裂解细
胞, 分别提取核、浆蛋白, Bradford法测定蛋白浓度,
用相应的蛋白提取液将各组蛋白总蛋白浓度调整一
致。取每组样品 40
l与 10
l上样缓冲液充分混
匀, 100
煮 5~ 10 m in,上样进行 SDS
PAGE电泳:
积层胶恒压 60 v, 分离胶恒压 80 v,转移到 PVDF膜
上, 电转 2 h,恒流 250 mA。5%脱脂奶粉 37
封闭
PVDF膜 1 h, 加入兔抗人 STAT5一抗 1
500及
GAPDH 1
500, 室温孵育 1 h, 4
过夜, 次日 TTBS
漂洗后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG二
抗, 37
作用 1 h。TTBS充分洗膜 3次, DAB显色、
晾干、拍照,采用 Quantity One
4
4
0图象分析软件
进行图像分析,数据进行统计学处理。
1
3
统计学分析
所获实验数据采用 SAS统计软件进行方差分
析、相关分析和 Dunnet t检验。P < 0
05为差别有
显著性意义。
2
结果
2
1
TSPG体外作用对 K562细胞增殖的影响
97
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 5期
以不同浓度 ( 0、100、200、300、400 m g /L )的
TSPG作用于 K562细胞 72 h和 120 h,用 MTT比色
法检测其对 K562细胞增殖的影响。结果如表 1、2,
K562细胞增殖抑制程度随着 TSPG浓度的增加和
培养时间的延长而增加, 呈正相关关系。各浓度组
与对照组相比差异具有显著性 (P < 0
05)。友尔逊
( Pearson Corre lation)相关系数分别为 0
925( 72 h)
和 0
916( 120 h) (表 1, 表 2)。
表 1
TSPG对 K562细胞增殖的影响 (A值 ) ( n= 3)
TSPG( mg /L ) 72 h 120 h
0 2
20
0
37 2
53
0
38
100 1
68
0
15* 1
98
0
45*
200 1
27
0
28** 1
63
0
30**
300 0
95
0
078** 0
91
0
24**
400 0
69
0
053** 0
63
0
085**
与对照组比较, * P < 0
05
** P < 0
01
表 2
TSPG对 K56112细胞体外增殖的影响抑制率 (n= 3)
TSPG( mg /L ) 72 h 120 h
0 - -
100 23
64* 21
74*
200 42
27** 35
57**
300 56
82** 64
03**
400 68
64** 75
10**
与对照组比较, * P < 0
05
** P < 0
01
2. 2
TSPG对 K562细胞细胞周期的影响 (流式细
胞术 )
对照组细胞 G 2 /M + S期占 58
30% , 而 G0 /G1
细胞占 41
70%, 表明 K562细胞处于增殖旺盛状
态。经 TSPG200 m g /L作用 K562细胞 72 h, G2 /M
+ S期占 36
73% ,而 G0 /G1细胞占 63
27% ,即 G2 /
M + S期细胞数有所减少, G0 /G1细胞增多,与对照
组 ( TSPG 0 mg /L )相比有统计学意义 (P< 0
05),表
明 TSPG能阻止 K562细胞从 G0 /G1期向 S、G2 /M
期移行。经 TSPG300 mg /L、400 m g /L作用 72 h,亚
二倍峰 (凋亡峰 )所占比例明显增大, 与对照组相比
差异有显著性 (P < 0
05) (表 3)。
表 3
TSPG对 K562细胞细胞周期的影响 (n= 3)
TSPG( m g/L) G 0 /G 1 (% ) G 2 /M + S(% ) 死亡率 ( 100% )
0 41
70
4
32 58
30
4
32 0
01
0
02
100 43
04
3
18 56
96
3
18 0
02
0
03
200 63
27
9
03* 36
73
9
03* 0
03
0
04
300 45
69
2
39 54
31
2
39 4
60
1
03*
400 54
02
6
34 45
98
6
34 12
40
2
15**
与对照组比较, * P < 0
05
** P < 0
01
2
3
激光共聚焦显微镜观察 TSPG对 K562细胞
STAT5分布表达的影响
对照组观察显示, K562细胞胞浆和胞核均可见
STAT5表达荧光, TSPG 200 m g /L作用 K562细胞 24
h,细胞浆中的 STAT5荧光强度增加, 而细胞核内
STAT5荧光强度明显减弱 (图 1)。
A
对照组; B
TSPG 200 m g/L(A 1中荧光为 STAT5的表达, A 2中荧
光 PI染色为细胞核 )
图 1
TSPG对 K562细胞胞浆和胞核
STAT5表达的影响 (
1000)
A
6 h; B
12 h; C
24 h; D
48 h; E
72 h;
1 ~ 4泳道为浆蛋白表达, 依次为对照组、TSPG 200、300、500 m g /L;
5 ~ 8泳道为核蛋白表达,依次为对照组、TSPG 200、300、500 m g /L
图 2
不同浓度 TSPG作用 K562细胞不同时间后
细胞浆、核蛋白中 STAT5的表达变化
98
2009年第 5期 罗春燕等:人参总皂苷对人红白血病细胞株 ( K562)中 STAT5表达的影响
表 4
不同浓度 TSPG作用 K562细胞不同时间对浆蛋白中 STAT5表达的影响
时
间 n 各组阳性灰度值对照组 TSPG 200 m g /L TSPG 300 mg /L TSPG 500 m g /L
6 h 3 0
779
0
008 0
933
0
047* 0
957
0
015* 0
911
0
022
12 h 3 1
529
0
062 2
042
0
101** 2
082
0
161** 1
702
0
019*
24 h 3 0
822
0
032 2
184
0
056** 1
245
0
040** 1
412
0
098**
48 h 3 2
185
0
045 2
316
0
067 2
983
0
069** 4
291
0
241**
72 h 3 2
311
0
030 3
173
0
109** 4
029
0
148** 2
456
0
094
与对照组比较, * P < 0
05
** P < 0
01
表 5
不同浓度 TSPG作用 K562细胞不同时间对核蛋白中 STAT5表达的影响
时
间 n 各组阳性灰度值对照组 TSPG 200 m g /L TSPG 300 mg /L TSPG 500 m g /L
6 h 3 0
911
0
022 0
258
0
016** 0
133
0
008** 0
194
0
019**
12 h 3 0
787
0
037 0
912
0
044* 0
807
0
033 0
709
0
061
24 h 3 0
613
0
041 0
307
0
019** 0
535
0
031 0
432
0
022**
48 h 3 2
339
0
086 2
202
0
074** 2
002
0
150** 1
929
0
046**
72 h 3 0
857
0
100 0
973
0
073* 0
987
0
026** 1
109
0
023**
与对照组比较, * P < 0
05
** P < 0
01
2
4
W estern blott ing检测 TSPG对 K562细胞的细
胞浆和细胞核中 STAT5蛋白表达的影响
TSPG作用 K562细胞 6、12、24、48、72 h,浆蛋白
中 STAT5表达较对照组增加, 6、24、48 h核蛋白中
则表达减少, 12 h核蛋白表达先增加后减少, 72 h
核蛋白表达则增加, 且各组间差异有统计学意义。
TSPG作用 K562细胞 48 h浆蛋白中 STAT5的表达
增加呈剂量依赖性,而核蛋白中 STAT5的表达呈剂
量依赖性下降 (图 2,表 4,表 5)。
3
讨论
STAT蛋白由于具有信号转导和转录激活双重
活性, 作为一种重要的转录调控因子, STAT蛋白一
直是近年来研究的热点。在哺乳动物中已经鉴定出
7种 STAT蛋白, 即 STAT1~ STAT6, 其中 STAT5包
括 STAT5a与 STAT5b两种异构体, 结构上具有
95%的同源性 [ 3]。 STAT5表达与活化不仅与多种
肿瘤的发生、发展密切相关, 在髓样白血病、前列腺
癌及头颈部鳞状细胞癌中均发现 STAT5异常表达
与活化 [ 4~ 7]。
慢性髓系白血病 ( CM L)是一种髓系增生性疾
病,以 Ph染色体或 (和 ) bcr /abl融合基因和 ABL酪
氨酸激酶活化为特点。目前研究发现 CML的发病
机制是 bcr /abl融合基因促进细胞生长, 抗凋亡,并
导致 DNA修复缺陷。K 562细胞系来源于 CM L急
变的患者, 在 K562细胞系中, bcr /abl能够激活
STAT5信号分子, STAT5的激活可使 bcr /abl转化细
胞获得增殖和生存能力, 并能使转化细胞对化疗药
物产生耐药。 bcr /abl基因序列区域含有 STAT5,
Ras, M yc, cyclin D和 P13(磷脂酰肌醇 3激酶 )等致
白血病活化信号,这在 CM L发病机制中可能起重要
作用 [ 8]。其中 Stat5作为上游酪氨酸激酶通过调控
靶基因而诱导某些关键产物的表达来影响肿瘤的发
生, 活化的 STAT5既可增强 Cyclin
D1、c
fos和 c
jun
等的表达,促进肿瘤增殖, 还可激活抗凋亡途径中
Bcl
xL、M cL
1、cyc lin D1 /2的表达, 抑制肿瘤凋
亡 [ 9~ 11]。可见, STAT5的表达和活性与白血病
K562细胞的发生、发展密切相关。
通过 MTT和细胞周期测定进一步验证 TSPG能
够抑制 K562细胞的增殖, 但其作用机制是否与
TSPG影响 K 562细胞 STAT5有关尚未见报道,本实
验初步探讨不同浓度 TSPG作用 K562细胞不同时
间 STAT5表达的变化。通过 W estern B lotting分别
检测胞浆、胞核中 STAT5的表达发现, TSPG作用
K562细胞 6、24、48 h核蛋白中 STAT5表达较对照
组表达减少。已知 STAT5调控细胞增殖的作用方
式是 STAT通过分子的 SH 2功能域与另一 STAT分
子的磷酸化酪氨酸发生作用, 形成同源或异源二聚
体, 此二聚体转入细胞核内, 结合于 DNA上对应的
靶基因序列反应元件, 影响转录 [ 12]。因此, TSPG可
能使核蛋白中 STAT5表达减少,影响基因转录从而
99
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 5期
抑制 K562细胞增殖。 72 h核蛋白表达则增加, 推
测可能与药物浓度有关, 随着时间延长, TSPG药效
逐渐衰减所致。研究表明, 在非刺激的情况下,
STAT5蛋白绝大多数位于细胞质中, 而在接受刺激
的情况下, STAT5蛋白迅速转运到细胞核内,进而诱
导相应基因表达,在信号终止后, STAT5蛋白又迅速
转运回细胞质中。 6、12、24、48、72 h, 浆蛋白中
STAT5表达较对照组增加,考虑可能与以下因素有
关: ( 1)逆转位, 即 STAT5从核里面转至胞浆; ( 2)
转位阻滞,即 TSPG影响 STAT5从胞浆到胞核的正
常运转, 但是否影响 K562细胞 STAT5总量表达与
活性尚待进一步研究。
总之, 在 TSPG调控 K562细胞增殖中影响了
STAT5的表达模式, STAT5的异常表达激活与抑制
K562细胞增殖的关系还有待于进一步明确,深入研
究 STAT5信号转导通路作用机制有可能为治疗
CM L提供新的理论和实验基础。
参 考 文 献
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王建伟,李荣,等
解剖学杂志, 2006, 29 ( 4) : 430 ~ 432, 449

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Genom e In form, 2006, 17( 1 ) : 152 ~ 162

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La iSY, Ch ilds EE, X i S, et a.l On cogene, 2005, 24: 4442~ 4449

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Sun SL, et al
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J Gen V iro,l 2007, 88: 956~ 966

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San tosMD, et al
M ol Imm uno,l 2007, 44 ( 13) : 3355~ 3363

(上接第 91页 )
度与地理的远近无关。利用最大简约法对来自我国
广西、福建、湖南、台湾和美国佛罗里达州的 6个柑
橘黄龙病样品 ( GX1、GX69、FJ1
1、HN 46、T3和 FL2

1)的 23S /5S rDNA序列及来源于 NCB I数据库的

变形菌纲其他病原菌相应的碱基序列构建系统进化
发育树显示黄龙病病原菌亚洲种 7个菌株单独聚为
一类并与
变形菌纲其他病原菌分开, 该结果与
Teixeira等 [ 17 ]基于 rp lJ基因和 Doddapanen i等 [ 11]基
于 16S rRNA基因的 DNA序列构建的分子系统进化
树结果一致。
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