全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第4期
收稿日期:2007-12-21
作者简介:张艳丽(1982-),女,硕士研究生,研究方向:天然活性物的提取及应用研究
通讯作者:高华,教授,硕士生导师,电话:0532-83812435,E-mail:gaohua63@126.com
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由 D-和 L-谷氨酸
通过 γ-谷氨酰键结合而成的一种特殊的阴离子聚
合物,通常由 5000个左右的谷氨酸单体组成,相
对分子量一般在 10万～200万之间。最早于 1937
年 Ivanovic等发现炭疽芽孢杆菌(Bacilusanthracis)
的荚膜物质的主要成分是 D-谷氨酸的聚合物。而
1942年 Bovamick等首次发现枯草芽孢杆菌能够产
生 γ-聚谷氨酸,以后进一步发现短小芽孢杆菌及
地衣芽孢杆菌等也能产生 γ-PGA。由于微生物合成
的 γ-PGA是一种水溶性的、生物可降解的、对人体
和环境无害的生物高分子,因此具有广阔的应用前
景:可作为增稠剂、保湿剂、苦味掩盖剂、防冻剂、缓
释剂、生物粘合剂、药物载体、高分子纤维、高吸水
树脂、生物絮凝剂和重金属吸附剂而应用于食品、
化妆品、医药、农业及工业等众多领域[1]。
1 γ-PGA的理化特性
1.1 γ-PGA的化学结构
PGA以形成肽键的羧基类型为依据可分为 #-
PGA(化学合成)和γ-PGA(微生物合成),结构如图1。
由于 γ-PGA的谷氨酰基通过 γ-键连接,不同
于前者的 $-酰胺键,它能耐受蛋白酶的降解作用
(也与蛋白质不同)。到目前为止,已发现 γ-PGA有
微生物合成的聚谷氨酸及其应用
张艳丽 高华 刘小红
(青岛大学医学院药学系,青岛 266071)
摘 要: γ-聚谷氨酸是一种全天然的、可食用的、具有多功能性的阴离子聚合物,可由微生物发酵合成。随着材料
科学、聚合物化学和生物医学的不断发展和紧密融合,生物可降解高分子材料的研究得到长足发展,γ-聚谷氨酸的开发
研究则日益深入。但国内研究仍处于实验室阶段,还未实现工业化生产。介绍了γ-聚谷氨酸的结构、理化性质及其影响
因素,综述了其合成菌株、培养方法、相关基因及在医药、食品、化妆品、农业、工业等方面的应用。
关键词: γ-聚谷氨酸 微生物合成 发酵菌株 基因 应用
BiosynthesisandApplicationofPolyglutamicAcid
ZhangYanliGaoHua LiuXiaohong
(Dept.ofPharmacology,MedicalColegeofQingdaoUniversity,Qingdao266071)
Abstract: γ-polyglutamicacidisapromisingbiodegradablepolymer,whichisnatural,unusualanionicandedible.
With the developmentofChemistry aboutpolymers,biomedicine and theirconfluens,biodegradable polymersare
developedgreatly.Thustheresearchaboutγ-polyglutamicacidhasatractedmuchatention.Thesituationofresearching
inChina,however,isstilinlaboratory.Thispaperintroducedthestructureandphysico-chemicalpropertiesofγ-
polyglutamicacid.Furthermore,thestrains,culturalmethods,genesinvolvedin thebiosynthesisofthepolymerand
applicationsinmedicine,food,cosmetics,agricultureandindustrywerereviewed.
Keywords: γ-PGA(Polyglutamicacid) BiosynthesisStrainsGene Application
图 1 PGA的结构
2008年第4期
3种不同的立体化学结构:D-PGA(由 D-谷氨酸组
成的均聚物)、L-PGA(由 L-谷氨酸组成的均聚物)、
DL-PGA(D-和 L-谷氨酸随机连接构成的共聚物)[2]。
其主要取决于所用菌种及培养基组成。炭疽芽胞杆
菌合成的 γ-PGA仅由 D-谷氨酸组成;而地衣芽孢
杆菌产生的 γ-PGA中 D-谷氨酸所占比例随着培养
基中金属离子(尤其是 Mn2+)的变化而变化(10%~
100%);枯草芽胞杆菌的一些菌种包括从纳豆(日
本一种传统的发酵食品)中筛选的纳豆芽孢杆菌产
生的胞外粘液的主要成分则是 DL-PGA(D-谷氨酸
占 60±15%;L-谷氨酸占 40±15%);枯草菌亚种
Chungkookjang的培养基中加入 (NH4)2SO4时 D-谷
氨酸、L-谷氨酸各占 42.5±7.5%、57.5±7.5%,而当
不加入 (NH4)2SO4时 D-谷氨酸占 72.5±7.5%[3];近
来所发现的依赖 NaCl合成 PGA的巨大芽胞杆菌
在高盐环境下合成的 PGA富含 L-谷氨酸,且随培
养基中盐浓度的降低,L-谷氨酸的比例也逐渐降低。
1.2 γ-PGA的物理性质
用游离酸型的 γ-PGA,根据滴定量测定 pKa
值,约为 2.23,这与谷氨酸的 # 羧基的大体一致。金
属盐(钠型)的 γ-PGA的比旋光度为-7.0(C=1.0,
H2O)。相对分子质量为 10万~200万。游离酸型的
γ-PGA能够溶于二甲亚砜、热的 N,N-二甲基酰胺
和 N-甲基吡咯烷酮。用 DSC(示差热量分析)及 CA
(热重量分析)法研究了它的热性质,得出分解温度
为 235.8℃、熔点为 223.5℃,热分解物为茶褐色。
2 γ-PGA的合成
2.1 γ-PGA的产生菌
自从 1937年 γ-PGA的发现以来,众多学者相
继开展了 γ-PGA高产菌株的选育、代谢途径、发酵
工艺、分离纯化工艺以及应用的研究,但至今 γ-
PGA的代谢途径仍然是推测途径,生产菌株的合成
能力较低,导致生产成本高,影响其在各领域的广
泛应用。目前生产方法主要包括化学合成法、提取
法、利用传统菌种进行发酵法[4]。
2.1.1 化学合成法 是肽类合成的重要方法(最早
由匈牙利学者采用),但合成路线长、副产物多、收
率低、难度大,尤其是含 20个氨基酸以上的纯多肽
合成,因此无工业应用价值。
2.1.2 提取法 合成早期,日本生产 γ-PGA大多采
用提取法,用乙醇将纳豆中的 PGA分离提取出来。
由于纳豆中所含的 γ-PGA浓度甚微,且有波动,因
此提取工艺十分复杂,生产成本甚高,同样难以大
规模生产。
2.1.3 微生物发酵合成法 是最常用的方法,但迄
今为止的发酵生产仍处于实验室阶段。
发酵菌株主要是芽胞杆菌属的一些细菌(均为
G+菌),如最早发现的炭疽芽孢杆菌随环境中 CO2
浓度的增加而合成 γ-PGA,且连于细胞壁上,在细
胞周围形成一层荚膜,但此菌由于自身的毒性而不
适于 γ-PGA的工业生产。而枯草芽胞杆菌和地衣
芽孢杆菌合成的 γ-PGA能分泌至培养基中,因此
成为目前研究最广泛的菌种(表 1)。分泌的 γ-PGA
可作为一种胞外营养储备,促进生物被膜的形成,
而且能保护细胞免受吞噬细胞的侵袭和高盐损伤。
除了一些能产生芽胞的细菌,还发现两种嗜盐真菌
也能合成 γ-PGA。此外真核细胞(如水蛭的刺细胞)
也能合成 γ-PGA,但其仅发生于荚膜壁中(仅在荚
膜壁中检测到),且晚于荚膜形成,伴随发生的是渗
透压增大导致荚膜隆起[12]。
目前研究者还利用一些菌株来合成 γ-PGA的
衍生物、混合物,扩展了其应用前景。如 Shih[13]等人
发现枯草芽孢杆菌 C1(一种非谷氨酸依赖性细菌)
能合成一种甘油和 γ-PGA相结合的衍生物,γ-PGA
中 D-谷氨酸占 97%以上,且所占比例与 Mn2+浓度
无关(这与地衣芽孢杆菌不同)。另外 WangQ.J.[14]
等人还以大豆和甘薯为原料通过枯草芽孢杆菌
B6-1合成脂肽和 γ-PGA的共聚物,可作为生物控
制剂和肥料增效剂,抑制植物的枯萎和病菌的感染。
上述 γ-PGA产生菌通常可按照其营养要求分
为两大类:谷氨酸依赖型和非谷氨酸依赖型。需谷
氨酸的 γ-PGA产生菌,其培养基一般要求谷氨酸
维持一种较高的水平,同时混合加入葡萄糖和甘油
会增强谷氨酸和柠檬酸 (是大部分 PGA生产菌的
最适碳源)的代谢,相应提高了 γ-PGA的产率[15]。目
前研究较多的为前者,以 B.licheniformisATCC9945a
和 B.subtilisIFO3335为代表,其产率相对比非谷氨
酸依赖型的较高,但从生产成本考虑,不需谷氨酸
作为发酵底物的菌株更有优势,具有工业化应用前
景。
张艳丽等:微生物合成的聚谷氨酸及其应用 59
生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第4期
表 1 γ-PGA产生菌的主要特性
研究者还采用传统的物理、化学的诱变手段,
例如紫外、亚硝基胍及 60Coγ射线诱变等获得 γ-
PGA的高产菌株。Nagai[16]等人发现由纳豆菌衍生
而来的无质粒的 NAF4菌株也能产生 γ-PGA,质粒
并不编码 γ-PGA生产所需的基因,因此他们提出
γ-PGA的基因可能存在于 B.subtilis的基因组 DNA
上[1]。由枯草芽胞杆菌 ISW1214构造出的 MA41重
组体(含有 PGA合成体系的质粒)能在富含 L-谷氨
或 D-谷氨酸的培养基中合成大量 PGA。这是迄今
所知的能在 D-谷氨酸存在下合成 γ-PGA的第一个
例子,这使大规模生产成为可能。因为自然条件下
γ-PGA合成菌株如枯草芽孢杆菌在发酵过程中会
因 γ-PGA的累积而使富含 L-谷氨酸的培养基高度
粘稠[17]。因此我们认为与传统的诱变育种相比,新
兴的基因工程手段有望成为 γ-PGA高产菌株的有
效改造方式。
2.2γ-PGA的培养条件
由于到目前为止 γ-PGA的合成机制还不明
确,以致于发酵菌株的培养基组成不尽相同,其合
成的 γ-PGA分子量和化学结构也差异较大。现以
如下菌株为例,说明培养条件的差异。
2.2.1 B.licheniformis ATCC9945a其最常用的为
培养基 E及将其组成稍加调整的培养基。培养基 E
的组成为(g/L):甘油 80,L-谷氨酸 20,柠檬酸 12,
NH4Cl 7,适量无机盐(包括 MgSO4、K2HPO4、CaCl2、
MnSO4、FeCl3)。Ko等研究发现在培养基中添加葡萄
糖可增加谷氨酸和柠檬酸的代谢强度,提高 γ-PGA
的产率,尤其是以 NH4Cl为氮源,谷氨酸的加入尤
为重要。培养基中 Mn2+的浓度对 γ-PGA的产量和
结构有极为重要的影响,枯草菌中尚未发现此现
象。1.5×10-7M的 Mn2+对 γ-PGA的产量有明显的影
响,而当其浓度达 6.15×10-4M时 γ-PGA的产量便
可达最大;当 Mn2+的浓度从 1.54×10-7M增至 2.46×
10-3M时,γ-PGA中 D-谷氨酸所占的比例由 38%增
至 86%。且研究发现在 γ-PGA的合成过程中葡萄
糖、柠檬酸和甘油的量比谷氨酸的量降低显著[1]。
Cromwick等研究发现 B.licheniformis ATCC9945a在
pH为 6.5时,柠檬酸的消耗量明显增加,γ-PGA的
产量达最大且增加通气量也使产量增加[6]。
2.2.2 B.subtilis IFO3335从豆制品中分离的枯
草菌 IFO3335是目前研究较多的另一菌种。尽管其
也是谷氨酸依赖菌,但不同于地衣芽胞杆菌的是在
——:表示分子量未测
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2008年第4期
γ-PGA的合成过程中谷氨酸的浓度维持不变,不作
为合成 γ-PGA的底物,但谷氨酸的添加能明显促
进 γ-PGA的合成,且没有副产物的生成,是因为其
在合成过程中作为一种酶活性调节剂而起作用。还
发现柠檬酸、(NH4)2SO4是该菌发酵生产 γ-PGA的
最佳碳氮源,当 (NH4)2SO4的浓度为 2.5g/L时,γ-
PGA的产量便明显增加,但同时有副产物如多糖的
形成;(NH4)2SO4的浓度增至 5.0g/L时,其产量达最
大,且无多糖等副产物的形成[7]。
2.2.3 B.subtilis(nato)OgawaY.等[9]用 30L发酵罐
生产 γ-PGA,采用 MSG培养基,含有 6%麦芽糖、
7%大豆汁、3%的谷氨酸钠、0.25%K2HP04、0.05%
MgS04·7H2O和 3%NaCl(有效阻止发泡,且能保证
γ-PGA发酵稳定)随着振荡速度的加快和加入培养
基中谷氨酸量的增加,γ-PGA的产量随之增加。或
用 6%的葡萄糖代替麦芽糖,降低成本,适于生产。
近年来有些研究者以纳豆芽胞杆菌为出发菌
株,通过大豆固体发酵生产 γ-PGA,可明显减少生
产成本,而且能充分利用资源,具有开发前景。
2.2.4 非谷氨酸依赖性细菌 如 B.subtilisTAM4
在 M培养基 (组成:1.8%NH4Cl,7.5%果糖,0.15%
K2HPO4,0.035% MgSO4.7H2O,0.005% MnSO4.H2O,
3.0% CaCO3,pH7.2)500ml的 摇 瓶 、30℃、150r/min
摇床培养 96h,产量达最大。而 B.licheniformisA35
(也是非谷氨酸依赖菌)在有机酸作碳源的情况下
不能合成 γ-PGA,培养基成分同上,但再添加 2%
HNO3。该菌株是一种能在硝酸呼吸条件下合成 γ-
PGA的特殊菌株 (其他细菌通气量均对 γ-PGA的
产生有影响)。
在 γ-PGA的培养基中,除上述碳氮源、谷氨
酸、Mn2+、Mg2+的影响外,盐对聚合物的合成和分子
量也存在影响。枯草菌 C1在高盐环境下优先合成
低分子量的 γ-PGA,随着盐浓度的升高,γ-PGA的
分子量显著降低。当 NaCl的浓度从 0.05%升至 5%
时,其分子量从 7.94×106降至 0.73×106 [13]。这与
Chungkookjang的研究一致,即 NaCl的浓度<0.5%
时 γ-PGA的分子量>2000kD,NaCl的浓度>10%时
γ-PGA的分子量为 10~200kD[18];纳豆芽胞杆菌也
具有此规律,当 NaCl的浓度<5%时,随 NaCl浓度
的增加,γ-PGA的产量显著升高,分子量降低,分子
结构保持不变[19];而 B.licheniformisATCC9945a对盐
的反映则相反[13]。
3 与 γ-PGA合成有关的基因
最初将编码 PGA合成的基因定位于 Bacilus
anthracis的 pXO2质粒上,称为 capBCA基因[20],而后
AshiuchiM[21]等在 B.subtilisIFO3336的染色体 DNA
上发现高度同源的基因 pgsBCA。基因组测序发现
capBCA基因也位于 B.subtilis168,但其不合成 γ-
PGA,可能是由于缺乏cap基因的表达[22]。Urushibata[23]
等人从枯草芽孢杆菌 IFO16449(从发酵大豆中分离
出的菌株)中克隆出 γ-PGA生成所需基因 ywsC、
ywtA、ywtB,其中 ywsC基因编码一种 PGA生物合
成的关键酶(YwsC蛋白,活性依赖于 ATP、Mn2+)。
随后 TakaoSuzuki等人又从 IFO16449中克隆出编
码 γ-PGA降解酶的基因即 ywtD基因 (现称为
pgdS),其正好位于 ywsC和 ywtABC下游,其编码的
YwtD蛋白是一种专门降解 L-谷氨酸和 D-谷氨酸
之间的谷氨酰基的新型酶。现已确定了参与 γ-PGA
合成的最小基因组合,有两种命名方法,取决于
PGA的最终状态:cap(指的是荚膜)基因和 pgs(指
的是聚谷氨酸合成酶)基因。当 PGA位于膜表面
时,参与其合成的基因称 cap基因;当 PGA释放至
培养基中时,则称 pgs基因。最小基因组合包含 4
个基因,称 capBCAE或 pgsBCAE。总的来说反
应分两步:PGA的合成和其转运,前者主要依靠
CapB-C(PgsB-C),后者则需要 CapA-E(PgsA-E)。
capE(pgsE)基因曾被忽略,后 Candela等证实其与
capBCA(pgsBCA)一样,都是 PGA合成所必需的
基因。
4 γ-PGA的应用[1,24]
γ-PGA作为一种全天然、多功能性、生物可分
解性的生物高分子产品可以制成不同的相对分子
质量、应用于各种不同领域的产品。分子量>106的
γ-PGA应用更广泛。除了医学应用,其它应用对 D/
L比无要求。
4.1 医药领域
γ-PGA在自然界或人体内能被生物降解成内
源性物质谷氨酸,不易产生积蓄和毒副作用。它的
分子链上具有活性较高的侧链羧基,易于和一些药
物结合生成稳定的复合物,是一类理想的体内可生
张艳丽等:微生物合成的聚谷氨酸及其应用 61
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
物降解医药用高分子材料,如 CelTherapeutics公
司开发的抗肿瘤药物-聚谷氨酸紫杉醇;还可以作
为药物载体和医用粘合剂;利用其超强吸水性可制
成和生物体含水量相近的各种组织材料,而且此材
料吸水后形成的凝胶比较柔软,具有人体适应性。
已明确的是 γ-D-PGA荚膜是炭疽芽胞杆菌的致病
因素之一,它能保护细胞免受机体自身的免疫系统
的攻击,故可用作疫苗,增强机体的被动免疫。
4.2 食品和化妆品领域
γ-PGA具有食品安全性,能作为苦味掩盖剂而
改善果汁和其它饮料的口感;而仅由 D-谷氨酸组
成的低分子量的 γ-PGA可作为一种食品添加剂而
发挥各种作用,因为 D-谷氨酸和 D-谷氨酰低聚物
几乎是无味的[3];能增强面粉的抗冻性,延缓面粉
(用来制作蛋糕、面包等)变质、改善其质地;还能促
进钙的溶解而增加其吸收,可用于治疗骨质疏松。
γ-PGA能促进皮肤对水溶性、非水溶性维生素
的吸收,并且由于其高吸水性和持水力、对皮肤无
刺激性,可作为化妆品用的保湿剂、表皮因子缓释
剂、天然美容面膜等。
4.3 农业领域
γ-PGA作为一种对环境无害的肥料增效剂而
用于增加营养的利用、提高农作物的产量和质量,
缓和肥料的过度使用,最终减轻环境污染[14];在珍
稀花卉、苗木的运输中,可保持根系水分,有保鲜作
用;在干旱地区,可用其处理种籽,使其外部形成
PGA保湿膜,利于种子发芽、出苗;在沙漠改造中,
利用超强吸水树脂(可吸水达 3500倍)来减少沙
土的水分蒸发量,以防止沙质土壤水分的过分流
失,加强土壤对水的吸收能力,而且可以保持土壤
结构的稳定性,改良土壤。γ-PGA的出现给沙漠变
绿洲带来了新的希望。
4.4 工业领域
γ-PGA可作为重金属吸附剂、螯合剂来处理重
金属离子溶液以便回收贵重金属,对冶金、工矿污
水、电镀废水等的处理极有价值,可用于突破环境
污染这一难题。在石油工业中用作油田处理剂、油
水分离剂、油田勘探中用作钻头的润滑剂、泥浆的
凝胶剂。其还可作为出色的绿色塑料,广泛用于从
食品包装到一次性餐具及其他各种工业用途中,在
自然界可迅速降解,不会造成环境污染。
另外一般来说,生物材料的热塑性随同分异构
体的同质性及聚合程度的增加而增加,γ-PGA的羧
基经酯化后便可成为极好的热塑性材料。γ-PGA还
可作为生物催化剂而广泛应用于各种有机合成和
生物反应器加工过程。
5 发展前景
近年来,PGA的应用已受到国内外研究者的重
视,尤其是 PGA的产生菌、发酵条件、应用范围以
及生物合成机制方面的研究,但仍有许多问题有待
解决。如目前有效合成高分子量的 γ-PGA的研究
进展不大,因合成 PGA的常用菌(包括纳豆菌)在
合成 PGA过程中其降解也同时被启动[3];对药物靶
向输送机制的进一步明确将促进 PGA作为药物载
体的广泛应用。将来可利用基因工程方法构建聚谷
氨酸工程菌、修饰参与 γ-PGA合成的酶复合物,从
而实现高效、低成本生产 γ-聚谷氨酸的目标。
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