全 文 ：聚谷氨酸!明胶生物胶生物学评价
王 欣"，陈国广"，姜 平#，韦 萍"，毛伟平#!
（" 南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 #"$$$%；# 南京师范大学 生命科学学院，南京 #"$$$%&）
摘 要：考察了聚谷氨酸!明胶生物胶的生物性能。从细胞毒性、急性毒性、皮肤刺激、溶血、热源、皮肤致敏等试验
对其进行生物学检测。结果发现：聚谷氨酸!明胶生物胶的细胞毒性、急性毒性、皮肤刺激、溶血、热源、皮肤致敏试
验均为阴性。这些结果表明聚谷氨酸!明胶生物胶具有良好的生物性能。
关键词：!!聚谷氨酸；明胶；生物胶；生物学评价
中图分类号：’(")*$) 文献标识码：+ 文章编号：",&# - (,&)（#$$.）$. - $$(" - $/
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5(6 7#483：;纤维蛋白胶（Y4TK45 ;D9B）在外科中的应用日益
广泛，包括组织粘附、止血、以及封堵气漏和体液泄
漏等，但其在临床应用中存在着不足，例如它的组成
成分纤维蛋白原和凝血酶都是从人类血液中提取
的，这就可能感染传染性疾病；用做外科粘附剂，其
对生物组织的粘附性较低等［" Z /］。因此研究一种可
用于人类的粘附能力强的生物胶是很有必要的。
!!聚谷氨酸（2一种由微生物大量生物合成的、具有优良生物相容
性、生物降解性及无毒无污染性的氨基酸聚合物，已
广泛用做药用载体材料［, Z "$］。我们已经制得了!!
?2+与明胶交联的生物胶［""］，其胶凝时间与纤维蛋
白胶相当，但有超越纤维蛋白胶粘附能力的性能，有
望作为纤维蛋白胶的替代产品。本文在制备的基础
上初步考察了 "!（(!二甲氨基丙基）!(!乙基碳二亚胺
（水溶性碳化二亚胺）交联的聚谷氨酸!明胶生物胶
的生物性能。
9 材料与方法
"*" 材料
!!?2+（分子量 ($ 万 Z /$ 万，由枯草芽孢杆菌
发酵，乙醇沉淀法所得）；"!（(!二甲氨基丙基）!(!乙
基碳二亚胺（深圳迈瑞尔化学技术公司进口分装）；
! 收稿日期：#$$.!""!$"
基金项目：国家“),(”课题（#$$#++(#&$($）
作者简介：王 欣（"%&)!），男，河南南阳人，硕士生，主要研究方向为药剂学。
第 #卷第 .期
#$$.年 ""月
生 物 加 工 过 程
6J45BQB =:9K51:P\ #$$.
·("·
万方数据
!""（#$%&’公司）；()!*+,-.培养基（/0123公司），
其它试剂均为国内产品。
+45 生物胶浸提液的制备［+5，+6］
将生物胶（7液：-. 89 : 80聚谷氨酸和 5. 89 :
80明胶混合液；1液：+,. 89 : 80 +;（6;二甲氨基丙
基）;6;乙基碳二亚胺，两液等量混合）注入平皿中，
室温下水平静止 +. 8<=，即可制得生物胶凝固膜，放
入培养瓶中，经高压蒸气灭菌 5. 8<=，按比例（.4+ >
.45 9 : 80）加入生理盐水（细胞毒性试验加 ();
!*+,-.培养液），置于恒温箱中 6? @浸提 ?5 A。
+46 细胞毒性实验［+- > +,］
0B5B细胞复苏传代后，贴壁生长良好，在对数
生长期，用 .45CD（质量分数）胰酶和 .4.-D的 EF;
"7消化后吹散，用血球计数板进行细胞计数，用
()!*+,-.培液稀释细胞浓度为 ? G +.- 个 : 80。用
微量移液器以 +..!0 :孔置于 B, 孔板中复种 , 孔，
在 CD235、6? @的标准环境下以含 +.D小牛血清
的 ()!*+,-.培养液孵育。当细胞长至 C.D（约 5-
A）时换液，空白对照用新鲜 +,-. 培养液交换，阴性
对照用生理盐水交换，阳性对照用 .4,-D的苯酚溶
液交换，试验组分别用体积分数 +..D、C.D、+.D的
生物胶浸提液，每孔 5..!0交换，然后置于培养箱
中继续培养。分别于第 5、-、? H 各取出一块培养
板，每孔加 C.!0的 C 89 : 80 !""溶液，继续培养 5
A，然后弃去孔内液体，用 IJ K ?4-的磷酸盐缓冲液
洗 5次，每孔加入 +C.!0的 F!L3。振荡 +. 8<=，用
酶标仪在 -B. =8波长检测 3F 值，取六孔平均值。
按下列公式计算相对增殖率（ MN$’O!"!）。
!"! K 实验组 3F 值 :空白对照组 3F 值 G
+..D
然后 !"! 值按表 +评分定出材料的毒性级别。
表 + 细胞毒性试验分级标准
"’S$N + 2M!"! : D !+.. ?C > BB C. > ?- 5C > -B + > 5- .
反应分级 . + 5 6 - C
+4- 全身急性毒性试验［+?，+Y］
取体重（5. Z 5）9的昆明种小鼠 -. 只，分为腹
腔注射组和尾静脉注射组。每组雌雄各半，禁食 +5
A，不禁水，分别注射生物胶浸提液和生理盐水（阴性
对照），每只小白鼠注射量为每 +. 9 .4C 80，给药速
度约为 .4- > .4C 80 : 8<=，分别于注射后 5-、-Y和 ?5
A称重，观察反应，记录结果。
+4C 热源实验［+?，+Y］
取生物胶的浸提液按 +. 80 : &9的剂量由耳静
脉缓慢注入新西兰家兔（体重 5 > 6 &9，雌性）体内，
在规定时间内观察家兔体温变化情况，以判断材料
中所含热源的限度是否符合标准。试验前，家兔应
在实验环境中适应 + > 5 A，实验环境的温度变化不
大于 C @。将家兔装于固定器中，防止骚动，6. 8<=
后测定家兔的正常体温，将肛门体温计插入兔肛门，
深度约 , U8，测温时间每兔至少 5 8<=。符合要求后
+C 8<=内，耳缘静脉缓慢注射生物胶浸提液，注射完
毕后每隔 + A测温 +次，共测 6次，以 6次体温中最
高的一次减去正常体温，即为该兔体温升高度，根据
标准对结果进行评定。
+4, 皮肤刺激实验［+?，+B］
采用局部封闭涂皮法。提前 5- A，将大耳白兔
（体重 5 > 6 &9，雌性）背毛用剪刀尽量剪短，用棉球
蘸 YD的硫化钠在脱毛部位涂成薄层，经 5 > 6 8<=
后，用温水洗去脱毛部位脱去的毛，再用干纱布将水
擦干，脱毛的皮肤备用。实验分 6组，实验组、阴性
对照组和阳性对照组。实验组：直径 + U8的生物胶
膜；阴性对照：生理盐水 .46 80 :块（滤纸）；阳性对
照：CD甲醛 .46 80 :块（滤纸）。然后分别在兔子背
部脱毛部位沿脊柱两侧对称贴敷相同的试验材料，
一层玻璃纸和两层纱布覆盖，两种贴敷材料相隔 5
U8，再用医用胶布固定好。5- A后去除。去除后 +、
5-、-Y、?5 A观察皮肤反应。
+4? 溶血实验［+?，5.］
取健康新西兰家兔一只，体重 54. > 54C &9，雌
性。用 .45 9 : 80的乌拉坦腹腔注射麻醉，剂量为 C
80 : &9，从颈动脉插管取血约 5. 80，加入 5 D的草
酸钾 + 80制成抗凝兔血。取 Y 80抗凝兔血加 +.
80生理盐水稀释。取生物胶的浸提液和蒸馏水（阳
性对照）、生理盐水（阴性对照）各 +. 80于玻璃离心
管内，重复 6 份。放入 ,. @水浴中，预热 ,. 8<=。
每个管中再加入 .45 80稀释抗凝兔血，于 6? @水
浴 ,. 8<=，以 5 ... M : 8<=速度离心 C 8<=，取上清液。
用分光光度计在 C-. =8波长测上清液的吸光度值
（#），取平均值。计算材料的溶血率，计算公式：溶
血率（D）K（材料组吸光度;阴性组吸光度）:（阳性
对照组吸光度;阴性组吸光度）G +..D。
+4Y 皮肤致敏实验［+5，+B］
实验用初成年的白化豚鼠，雌雄不限，体重 5C.
> -.. 9，分两组：生物胶组和阴性对照组，试验前 5-
·65· 生物加工过程 第 5卷第 -期
万方数据
!将豚鼠背部左侧脱毛剂去毛，范围 " # $ %&’。诱
导接触：受试物 ()’ &* 涂在实验动物去毛区皮肤
上，以两层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布
封闭固定 $ !，等 + ,和 -" ,以同样方法重复；激发
接触，末次诱导后 ’. ,，将约 ()" &*的受试物涂于
动物右侧约 " %&’去毛区（提前 ’" !去毛），用上述
方法固定 $ !，并与 -、’"、". !观察皮肤反应。阴性
对照组诱导时仅涂生理盐水，激发时涂以受试物。
观察时间、方法与试验组一致。
! 结果与讨论
’)- 细胞毒性试验
’)-)- 形态学观察
从形态学方面进行定性评价。培养 ’" !和 ".
!后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。结果表
明，实验材料（生物胶的浸提液）、阴性对照材料（生
理盐水）中，细胞形态正常，贴壁生长良好，细胞基本
上呈梭性或不规则三角形的典型形态，与正常细胞
形态相似。而阳性对照组（()$"/的苯酚溶液）细胞
基本不贴壁，细胞圆缩，很大一部分呈悬浮死细胞。
’)-)’ 011法（噻唑篮微量酶反应比色法）
表 ’是测得的各实验组的吸光度平均值，表 2
是与之相对应计算的相对增殖率及评分。
表 ’ 各实验组的吸光度（34）平均值
15678 ’ 34 598:5;8 957<8= >? 8@A8:B&8CD57 ;:>实验组 体积分数
两日
吸光值
四日
吸光值
七日
吸光值
空白对照组 E ()’2( ()2’F ()’’(
生物胶 -((/ ()-.’ ()’"F ()-$.
浸提液组 G(/ ()-F2 ()’$- ()-+G
-(/ ()’-+ ()’F’ ()-..
阳性对照组 E ()-G’ ()-’F ()(+G
阴性对照组 E ()’2F ()’F+ ()’(.
表 2 相对增殖率及毒性评分
15678 2 H875DB98 ;:>ID! :5D8 5C, %877 D>@B%BDJ D8=D ;:5,5DB>C
实验组
体积
分数
两日 四日 七日
!"! 评分 !"! 评分 !"! 评分
生物胶 -((/ +F)-/ - +G)+/ - +$)"/ -
浸提液组 G(/ .2)F/ - +F)2/ - +F)G/ -
-(/ F")2/ - ..)./ - .G)G/ -
阳性对照组 E $$)-/ ’ 2F)’/ 2 2")-/ 2
阴性对照组 E -(2)F/ ( F()2/ - F")G/ -
由表 2可以看出，生物胶浸提液组与阴性对照
组的毒性基本上都是 (级和 -级，而阳性对照组达
到 ’级和 2级。生物胶浸提液组与阴性对照组对照
无差别。说明生物胶毒性很低，可以安全使用。
’)’ 全身急性毒性试验
全身急性毒性试验结果见表 "。
表 " 小鼠平均体重（# K -(）的变化
15678 " 1!8 %!5C;8 >? &B%8 &B,,78I8B;!D（# K -(）
实验组 ( ! ’" ! ". ! +’ !
生理盐水组（腹腔注射） -F)F2 -F)$F -F).. ’()’+
生物胶浸提液组（腹腔注射） -F).2 -F)$2 -F)F. ’()2G
生理盐水组（静脉注射） -F)G’ -.)F- -F)’- -F)G+
生物胶浸提液组（静脉注射） -F)2$ -.)+. -F)-’ -F)G(
生理盐水及生物胶的浸提液注射后 ’"、".和 +’
!，小鼠体重均无明显的变化，静脉注射组的变化稍
大于腹腔注射组，但与生理盐水组相比均无差别；部
分小鼠在注射后出现竖毛反应，’" !后正常；也没有
出现死亡和昏迷、呼吸抑制、呼吸困难、四肢活动受
限等症状的中毒反应。生物胶浸提液注射组与阴性
对照生理盐水组无差别。表明生物胶在急性全身毒
性试验中均为阴性反应。
’)2 热源试验
热源试验结果见表 G。
表 G 热源试验结果
15678 G H8=<7D= >? AJ:>;8CB% :85%DB>C D8=D
试验
材料
兔子
编号
基础体温
L M
注射后体温 L M
- ! ’ ! 2 !
体温变化量
L M
生 - 2F)$ "()( 2F). 2F)F ()"
物 ’ 2F)’ 2F)$ 2F)" 2F)G ()"
胶 2 2F)" 2F)$ 2F)G 2F)G ()’
注射生物胶浸提液后，家兔体温升高均在 ()$
M以下，且升温总值在 -)" M以下，认为生物胶符合
热源检查的要求，热源实验合格。
’)" 皮肤刺激试验
皮肤刺激试验结果见表 $。
表 $ 皮肤刺激试验结果
15678 $ H8=<7D= >? =NBC B::BD5DB>C D8=D
组
别
- ! ’" ! ". ! +’ !
红斑 水肿 红斑 水肿 红斑 水肿 红斑 水肿
生物胶组 ( ( ( ( ( ( ( (
阴性对照组 ( ( ( ( ( ( ( (
阳性对照组 ’ ( - ( ( ( ( (
通过局部斑贴试验过程除去贴敷物后，发现材
料组各时段每一部位均无红斑和水肿反应，与阴性
’(("年 --月 王 欣等：聚谷氨酸E明胶生物胶生物学评价 ·22·
万方数据
对照组相比无明显差别。结果评定两种胶的刺激反
应都为 !级，认为两种胶刺激试验合格。
"#$ 溶血试验
溶血试验结果见表 %。
表 % 溶血试验结果
&’()* % +*,-)., /0 1*2/)3.45 6*’5.4/7 .*,.
组别
吸光度值（!）
8 " 9 平均值
溶血率 : ;
阳性对照 !#<=> !#<== !#<=% !#<=% ?
阴性对照 !#!$< !#!$% !#!$= !#!$= ?
生物胶 !#8!" !#8!8 !#8!! !#8!! @#%
溶血试验是用于评价长期与骨或软组织接触的
材料的体外急性溶血活性。通过对材料与血细体外
接触过程中所致红细胞溶解和血红蛋白游离程度的
测定，对材料的体外溶血性进行评价。因该试验能
敏感地反映试样对红细胞的影响，故为一种特别有
意义的材料筛选试验。通过对不同兔血的反复测
定，其平均溶血率为 $;，所以国际标准化组织
（ABC）的文件规定：溶血率小于 $;的均为合格。生
物胶的溶血率比较低，小于 $;，所以生物胶不会引
起溶血。
"#> 皮肤致敏试验
皮肤致敏试验结果见表 =。
表 = 皮肤致敏试验结果
&’()* = +*,-)., /0 D*62’ ,*7,4.4E’.4/7 .*,.
组别 观察时间 : 1动物数 :只 诱导剂 激发剂
红斑反应程度 水肿反应程度
! 8 " 9 @ ! 8 " 9 @
致敏率（;）
8 @ @ !
生物胶组 "@ @ 生物胶 生物胶 @ @ !
@= @ @ !
8 @ @ !
阴性对照组 "@ @ 生理盐水 生物胶 @ @ !
@= @ @ !
由表 =可以看出，移去斑贴物 8、"@、@= 1后，所
有动物贴敷部位均无红斑和水肿出现，其反应积分
小于 8，生物胶组和生理盐水组对照无差别。根据
皮肤致敏试验分级标准，生物胶对豚鼠皮肤无明显
的潜在致敏性。
! 结论
聚谷氨酸?明胶生物胶的细胞毒性为 ! 级或 8
级，全身急性毒性很低，无潜在的皮肤刺激和皮肤致
敏性，溶血率为 @#%;（小于 $;），热源试验也符合
要求，这些结果初步表明，聚谷氨酸?明胶生物胶具
有良好的生物性能。
参考文献：
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.*64’),（W7K)’7D），8<<=，8<（""）："!<8?"!<= G
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［F］# U4/2’.*64’),，8<<=，8<（"9）："8>%?"8%9 G
［>］ B*M47* &’M’,14，Y’M’2-6*&’.,-/，B1424E7 V’,-14M/，*. ’)#Y*Z .3J* /0
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’54D）［F］# F/-67’) /0 U4/2*D45’) P’.*64’), +*,*’651，"!!8，$@（"）：
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(/X3)’.*,?*00*5. /7 1-2’7 /I’64’7 5’6547/2’［F］# +*’5. H-75. T/)32，
8<<=，9>（8）：$< G
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64*6, /0 54,?J)’.47-2［F］# F/-67’) /0 5/7.6/))*D +*)*’,*（Y*.1*6)’7D），
8<=<，8!：%$?=% G
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［[］# 第一届全国化学工程与生物化工年会论文集（光盘版）
［SU : LS］，中国南京，"!!@：P!9$G
·9@· 生物加工过程 第 "卷第 @期
万方数据
［!"］苏 怡，候延文，高珉之 # 医用生物蛋白胶生物性能的研究［$］
# 预防医学杂志情报，"%%!，!&（’）：())*()+ ,
［!)］-. / 0 !’11’#!"*"%%%# 医疗器械生物学评价第 !"部分：样品制
备与参照样品［2］,
［!(］-. / 0 !’11’#+*"%%)# 医疗器械生物学评价 第 +部分：体外细胞
毒性试验［2］,
［!+］田 菲，吴军正，鲁开化，等 # 聚丙烯酰胺水凝胶对 34"4细胞
的细胞毒性研究［$］# 实用美容整形外科杂志，!444，!%（’）：)"’*
)"4 ,
［!’］王 昕，施燕萍，朱雪涛，等 # 500法评价医用高分子材料的细
胞毒性［$］# 山东生物医学工程，"%%)，!：(’*(&
,［!&］米 钰，惠 俊，范代娣，等 # 类人胶原蛋白生物相容性实验
研究［$］# 西北大学学报（自然科学版），"%%(，)(（!）：’’*’1 ,
［!1］-. / 0 !’11’#!!*!44&# 医疗器械生物学评价 第 !!部分：全身毒
性试验［2］,
［!4］-. / 0 !’11’#!%*"%%%# 医疗器械生物学评价 第 !%部分：刺激与
致敏试验［2］,
［"%］丛 锐，王全平，冯立宁，等 # 骨缺损修复材料可降解速固化骨
水泥的生物相容性研究［$］# 中国临床康复，"%%"，’（(）：+%"*
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
+%) ,
（上接第 "+页）
图 ’ 不动杆菌固定化细胞的操作稳定性
789#’ :6;<=>8?@ A>=B8C8>D ?E 8FF?B8C8G;H IJ8@;>?B=J>;< A6# J;CCA#
左右，此时，水解产物（"）*K5LM的 !! 值在 4%N左
右（视转化率不同有所差异）。从图中可以看出，固
定化细胞非常稳定，连续重复反应 !%批，其活力以
及选择性没有显著下降，显示了良好的工业应用前
景。
参考文献：
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［+］ RQ=? SO*T8=?（赵玉巧），VO $8=@*K;（许建和）# :6>8F8G=>8?@ ?E <;*
=J>8?@ J?@H8>8?@A E?< B8?J=>=CD>8J <;A?CO>8?@ ?E（[，2）*(*QDHF;>QDC*"*（"*6*"*;@?@; BD <;A>8@9 J;CCA ?E #$%&!’(,
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8@ = F;H8OF Z8>Q ?<9=@8J J?A?CX;@>［$］# $ 5? M=>=C .*Y@GDF=>8J，"%%(，
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万方数据