全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-09-01
基金项目：大庆市科技计划项目“大庆地区抗旱耐盐绿化树种资源的选择、引种及产业化繁殖技术研究”
作者简介：王巍巍（1981-），女，硕士研究生，研究方向：植物细胞工程；E-mail：wangweiwei198124@163.com
通讯作者：詹亚光，女，教授，博士生导师；E-mail：yaguangzhan@126.com
沙枣（Elaeagnus angustifolia L）是胡颓子科胡颓
子属的落叶小乔木 ，分布广阔 [1]，其耐旱防风是重
要的绿化树种。 沙枣除具有食品 [2]饲料和制胶工业
等用途外还含有丰富的鞣质、抗坏血酸、黄酮类化
合物、阿魏酸和新绿原酸等大量有机酸。 在医药 [3]，
化妆品等方面因而具有较高的经济价值。但由于其
来源受环境和季节影响较大，不利于次生代谢产物
的规模化生产。因此，建立具有培养周期短、材料均
一、重复性好等优点的悬浮培养体系成为解决这一
问题的有效途径。虽然沙枣组织和细胞培养的研究
很多 [4，5]但主要是用于植物的繁殖 ，关于沙枣细胞
悬浮培养技术尚未见报道。本研究旨在建立沙枣悬
浮细胞培养技术，为沙枣次生物质的开发利用提供
理论依据和技术支持。
1 材料和方法
1.1 植物材料
沙枣幼嫩材料取于哈尔滨市第一苗圃。
1.2 沙枣愈伤组织诱导
沙枣细胞悬浮培养体系的建立
王巍巍 宋继园 詹亚光
（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）
摘 要： 分别以沙枣幼嫩叶片，茎段为外植体诱导沙枣愈伤组织，选择生长旺盛的松散愈伤组织进行细胞悬浮培
养，探讨了培养基种类和激素组合对其产生的影响。结果表明，最适的沙枣愈伤组织诱导培养基为 NT（包括 0.1 mg·L-1
BA和 0.1 mg·L-1 TDZ）；沙枣悬浮细胞在 MS，NT，WPM，B5和 IS培养基中均可生长，其中在 NT 培养基中生长状态最
好，呈现生长均一的绿色疏松状态。激素组合对沙枣细胞生长影响很大，其中附加 BA 0.1 mg·L-1和 TDZ 0.1 mg·L-1组
合的 NT液体培养基可获得大量繁殖速度快、生长均匀一致的悬浮细胞，细胞增长系数达 5.73。HPLC 测定结果证明沙枣
细胞中含有一定量的浓缩鞣质达 5.2022 mg/ gDW，这为利用沙枣悬浮细胞生产次生代谢产物提供了一条有效途径。
关键词： 沙枣 外植体 愈伤组织 悬浮培养 培养基 激素
Establishment of the Cell Suspension Culture of
Elaeagnus angustifolia
Wang Weiwei Song Jiyuan Zhan Yaguang
（College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin 150040）
Abstract： The young leaf and stem of Eaeagnus angustifolia L were taken as the explants for callus induction.
Friable callus in the bloom of Growth vigorous was selected for cell suspension culture，in which the effect of media and
the hormone combination were studied. The results showed that the suitable medium for callus formation was NT with
0.2 mg·L-1 BA and 0.1 mg·L-1 TDZ. The suspension cells could grow in all the media of MS，NT，WPM，B5 and IS. In
NT medium，the cell grew better than that of in others. Hormone combinations had significant effect on cells growth，
and plenty of incompact and rapid growing suspension cells were obtained from cultures grown in liquid medium of NT
supplemented with 0.1 mg·L-1 BA and 0.1 mg·L-1 TDZ. In addition，it is found that Elaeagnus angustifolia contained
amount of condensed tannins up to 5.2022 mg/ gDW. It provided an efficient base for Elaeagnus angustifolia cell
suspension culture to produce secondary metabolite.
Key words： Eaeagnus angustifolia L Explant Callus tissue Suspension culture Media Hormone
2009年第 3期
取幼嫩材料在流水下冲洗 1 h，用 75 %酒精浸
泡 30 s，将叶片、茎段分别用质量浓度为 10 %的 Ca-
（ClO）2 消毒 10~15 min，无菌水冲洗 5 次。茎段切成
长约 0.5 cm 的小段 ， 幼叶切成 0.5 cm2 的小块 ，
分别接入以 MS 为基本培养基 [4]附加 NAA （0.08~
1.0 mg·L-1），2，4-D （0.5 ~1.0 mg·L-1），TDZ （0.001 ~
0.1 mg·L-1）3 种激素与 BA，KT（0.05~1.0 mg·L-1）的
不同浓度组合的培养基中， 进行愈伤组织的诱导。
在此基础上进行培养基 （MS，1/2MS，NT，IS） 的优
化。 每 1 个处理接种 10 瓶，每瓶接种 3 个外植体，
培养温度：25±2℃；光照强度 ：58.4 mmol·m-2·s-1；光
照时间：12 h·d-1。
1.3 愈伤组织生长曲线的测定
将诱导出的愈伤组织继代培养在优化后的愈
伤组织最适生长培养基上， 接种量 1.5 g/瓶， 连续
培养 30 d，每 5 d 取样称重 1 次 ，每个处理 5 次重
复，5 次结果取平均值。
1.4 细胞悬浮培养
取继代多次绿色疏松，具有光泽的沙枣愈伤组
织接种于附加 0.1 mg·L-1 BA 和 0.1 mg·L-1 TDZ 的
MS，NT，WPM，B5 和 IS 5 种基本培养基中进行悬浮
培养。 观察培养物状态，测定细胞生长量及浓缩鞣
质含量。 确立最佳培养基后，测定最佳培养基+BA，
TDZ 不同浓度组合对细胞生长量及浓缩鞣质含量
的影响，并观察培养物状态。 悬浮培养条件：110 r/
min，100 ml 摇瓶中培养基装液量为 60 ml， 接种量
为鲜质量 20 g·L-1。
1.5 沙枣愈伤组织浓缩鞣质含量的检测
将样品 60℃烘干至恒重，研成细粉，加入 50 %
甲醇 ，超声振荡处理 20 min，提取液经 0.45 μm 滤
膜过滤 ，采用高效液相色谱 （HPLC）法测定浓缩鞣
质的含量 ，色谱仪为 Waters600-717-2487 型 ，色谱
柱为 HiQsilC18V 型 （416 mmφ×250 mm），检测波长
为 260 nm，流动相为乙腈-1%冰醋酸酸水溶液（10 ∶
90），流速 0.8 ml·min-1，进样量 10 μl，外标法定量 。
建立回归方程为 y = 2199443.3376x-2701.0833（R2=
0.9999），其中 y 为峰面积、x 为浓缩鞣质浓度。浓缩
鞣质在 0.039~0.625 mg·ml-1 线性关系良好。
2 结果与分析
2.1 沙枣愈伤组织诱导
2.1.1 激素组合对沙枣愈伤组织诱导培养的影
响 以相同浓度梯度的 BA，KT 两种激素与 NAA，
2，4-D 及 TDZ 3 种激素进行组合，考察激素组合对
沙枣茎段、叶片愈伤组织诱导培养的影响。 结果表
明，不同外植体接种在附加 KT，BA 与 2，4-D，NAA、
TDZ 的不同组合及浓度配比的诱导培养基上，愈伤
组织诱导率存在显著差异。 KT 与 2，4-D，NAA，TDZ
组合中， 除 KT 0.25 mg·L-1 与 NAA 0.05，1.0 mg·L-1
组合中获得少量绿色颗粒状愈伤组织外，其余诱导
率均为 0。 在 BA 与 2，4-D，NAA、TDZ 的组合中（表
1），BA 与 2，4-D 组合基本难以获得愈伤组织。 BA
与 NAA 组合中， 低浓度 BA 与高浓度 NAA 的激素
组合中愈伤组织诱导率为 0， 有分化出根现象；在
高浓度 BA，低浓度 NAA 的激素组合中愈伤组织诱
BA
(mgL )
2,4-D
(mgL)
NAA
(mgL)
TDZ
(mgL )
(%)
AAA
A 0.05 0.5 - - 0 0 - -
A 0.25 0.5 - - 26.66 6.66 AAAAAAAAA AAAA
A 0.25 1.00 - - 3.33 0 AAAAAAAAA -
A 0.05 - 0.50 - 0 0 - -
A
0.25 - 0.50 - 0 0 - -
A
0.25 - 1.0 - 0 0 AAAA AAAA
A
0.5 - 0.2 - 83.33 63.33 AAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAA
AA
A
1.0 - 0.08 - 100 93.33 AAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA
A 0.1 - - 0.001 0 0 A AAA A AAA
A
0.1 - - 0.005 100 56.66 AAAAAAAAA AAA
A
0.1 - - 0.01 100 63.33 AAAAAAAAAA AAAA
A
0.1 - - 0.1 100 83.33 AAAAAAAAAA AAAA
A
表 1 激素组合对沙枣愈伤组织诱导培养的影响
王巍巍等：沙枣细胞悬浮培养体系的建立 75
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
导率在 60%以上，其中在 MS +BA 1.0 mg·L-1+ NAA
0.08 mg·L-1 培养基上叶诱导可达 100%， 但分化出
芽现象严重不能维持稳定的脱分化状态不适于继
代培养 。 在 BA 与 TDZ 组合时叶片诱导率高于茎
段 ， 诱导率随 TDZ 浓度的升高而上升 。 在 BA 与
TDZ 浓度均为 0.1 mg·L-1 时茎段和叶片的诱导率
均较高且状态较好，因此 BA 与 TDZ 组合为诱导沙
枣愈伤组织的最佳激素组合。
2.1.2 培养基对愈伤组织诱导培养的影响 研究
发现在将 A13，A14 组合获得愈伤组织进行继代培养
时，愈伤组织在培养过程中生长状态差，有出芽和
褐化死亡现象出现不能维持稳定的生长状态，因此
分别以 MS，1/2MS，NT 和 IS 4 种不同培养基附加
0.1 mg·L-1 BA 和 0.1 mg·L-1 TDZ，考察不同培养基
对愈伤组织诱导的影响。 结果表明，在 4 种培养基
上叶源愈伤组织的诱导率均为 100%， 茎在 NT 培
养基上诱导效果最好为 90%， 其次是 1/2MS，IS 培
养基诱导效果最差仅为 76.66%（表 2）。
2.2 沙枣细胞的生长曲线
将茎段和叶片诱导出的愈伤组织进行继代培
养， 发现叶片诱导出的愈伤组织虽然体积较大，但
难以维持稳定的脱分化状态，继代培养几次后均分
化出芽。茎段诱导出的愈伤组织在优化后的生长培
养基上连续培养几代后未见有分化 ， 褐化死亡现
象，且生长旺盛状态均一，因此可作为悬浮培养材
料。
接种 1.5 g 继代 5 代以上的茎源愈伤组织到优
化后的生长培养基上。沙枣愈伤组织培养过程如图
1 所示，培养周期为 30 d。 细胞的生长曲线呈 S 形，
0～10 d 为延迟期，细胞生物量增加缓慢。 10 d 后进
入对数生长期，对数生长期持续在 10～25 d，此期间
细胞生长速度快，是生物量积累的主要阶段。 25 d
后开始减慢，25 d 以后为细胞生长平稳期，在第 25
d 时达到最大生物量 16.69 g/瓶， 即鲜重增值倍数
为 11.13 倍。
2.3 细胞悬浮培养
2.3.1 培养基对悬浮培养细胞培养的影响 结果
如表 3 所示，沙枣细胞在 B5 培养基中生长量最低，
在 WPM，MS 培养基中细胞生长量较大但在生长过
程中有褐化死亡现象出现，且培养基中有黑色代谢
物质产生使培养基呈黑色混浊状态，继代培养均褐
化死亡。 因此 MS，WPM，B5 3 种培养基不适于作为
悬浮培养基质。 NT，IS 两种培养基质获得的细胞生
长量 ，二者没有较大差异 ，但 NT 培养基中悬浮培
养物更为均一， 呈黄绿色且没有黑色代谢物质积
累，次生代谢产物浓缩鞣质积累量较高达 5.07 mg/
gDW， 因此 NT 培养基可作为沙枣细胞悬浮培养的
最佳培养基质。
2.3.2 激素组合对悬浮培养细胞培养的影响 取
绿色疏松沙枣愈伤组织分别接种于附加有不同激
素配比的 NT 最适培养基中，比较不同激素配比对
(%)
BA
(mg ·L )
TDZ
(mg ·L )
MS 0.1 0.1 100 83.33
1/2MS 0.1 0.1 100 86.66
NT 0.1 0.1 100 90.00
IS 0.1 0.1 100 76.66
!"#
$%
&’"#
$%
表 2 培养基对愈伤组织诱导培养的影响
16
12
8
4
0
0 5 10 15 20 25 30愈
伤
组
织
鲜
重
（ g
）
培养时间 （d ）
图 1 愈伤组织生长曲线
(g)
(mg/gDW)
1 NT 4.86±0.18 5.0700±0.0190
2 WPM 5.58±0.63 1.4990±0.5650
!"#
$%&’
()
3 B
3.52±0.72 1.2000±0.0670 *+
# ,
-
4 IS 4.92±0.89 2.7170±0.9650
!."
$%&’
()
5 MS 4.11±0.27 8.1111±0.8870.
/0
"12
表 3 培养基对悬浮细胞培养的的影响
76
2009年第 3期
沙枣悬浮细胞培养的影响。 结果发现，6-BA 和 TDZ
的不同浓度组合对沙枣细胞存在较大影响。 在 1、
5、6 号组合中， 悬浮细胞有部分褐化不易生长，生
长量低。在 3、4 号组合中细胞生长量大，呈深绿色，
但有大量不定芽发生在继代培养过程，不能维持稳
定均一生长状态，因此不能用于建立稳定的细胞培
养体系。 2 号组合虽然生长量低于 3、4 号组合但没
有分化芽及褐化现象，颜色状态均一且有一定浓缩
鞣质积累，因此可作为悬浮培养最佳激素组合 （表
4）。
(mg·L )
(g)
(mg/gDW)
1 6-BA0.1+TDZ0.05 2.96±0.41 5. 0147±0.0768
2 6-BA0.1+TDZ0.1 5.73±0.41 5.2027±0.0067 !"# $!%
3 6-BA0.2+TDZ0.05 7.93±0.79 6.9125±0.0356 !"# &$!’()*+,-
4 6-BA0.2+TDZ0.1 8.23±0.85 11.0152±0.0254 .!"# &$!’()*+,-
5 6-BA0.2+TDZ0.15 3.80±0.68 12.6418±0.0979 /0 ’123 $!
6 6-BA0.4+TDZ0.1 3.94±0.14 2.72420±0.0119 .!"# /03 !’12( $!456,-
表 4 激素对悬浮细胞培养的的影响
3 讨论
获得生长旺盛、状态均一的愈伤组织是进行植
物细胞悬浮培养的基础。 以幼茎，叶片为外植体时
发现叶片的诱导能力较强，这与苗永美等 [6]报道的
结果相一致。但沙枣叶片可能由于自身内源激素浓
度较高，在诱导和继代培养过程中较难与茎段诱导
的愈伤组织一致，保持脱分化，生长旺盛的稳定状
态，不适于作为悬浮培养的材料来源，但因其产生
的愈伤组织体积大，生长快，易分化出芽，因此可在
沙枣植株快速繁殖中加以利用。
培养基作为植物细胞生长的不可缺少的基质，
在植物生长过程中起着关键的作用。不同培养基又
因其组分的不同对细胞产生不同的影响。很多研究
报道了培养基类型对细胞生长和次级代谢产物的
影响。 王关林等 [7]对栀子悬浮细胞合成多糖的调控
因子研究中报道 B5 为最适培养基；赵德修等 [8]在研
究了 8 种不同的基本培养基对水母雪莲细胞生长
和黄酮形成的影响时发现 MS 培养基既有利于细
胞生长又黄酮形成， 可作为生产黄铜的最佳培养
基；Abdullah 等 [9]报道了 MS 培养基对于提高蒽醌的
含量是最有效的，但是对于细胞的生长却不是最好
的。本试验结果也得出相似结论，MS 培养基利于浓
缩鞣质的积累但由于在培养过程中有黑色代谢物
质的产生，细胞在继代培养过程死亡，所以不适合
作为沙枣悬浮培养的基质，因此最终选用可获颜色
一致，生长量和浓缩鞣质积累量相对较高的 NT 培
养基作为悬浮培养的最佳培养基。
激素通过调节培养基中的激素种类与浓度来
促进悬浮细胞的生长，是筛选快速繁殖的优良细胞
株系及进行植物细胞大量培养和次生代谢产物工
业化生产的基础 [10]。 岳彩鹏等 [11]提出 MS 附加 0．1
mg·L-1 2，4-D，1．5 mg·L-1 NAA 和 0．3 mg·L-1 6-BA
适于烟草细胞悬浮培养；Marcela 等 [12]提出苦艾酒细
胞悬浮培养时，最有利于细胞生长和倍半萜烯类化
合物积累的激素组合是 20.0 μmol·L-1 IBA 和 18.0
μmol·L-1 BA。本试验以 6-BA 和 TDZ 的不同浓度组
合研究其对沙枣的细胞影响， 结果表明在 TDZ 浓
度范围为 0.05~0.1 mg·L-1 时沙枣细胞随其浓度的
升高生长量逐渐增大， 但伴随不定芽的大量分化。
6-BA 在 0.1~0.4 mg·L-1 浓度范围时，沙枣细胞生长
量呈先增加后降低的趋势，当 6-BA 浓度为 0.4 mg·
L-1 时细胞出现褐化死亡现象。 只有当激素组合为
0.1 mg·L-1 BA + 0.1 mg·L-1 TDZ 时沙枣细胞才能持
久维持一个良好的生长状态。
参考文献
1 常兆丰，屠振栋，等. 甘肃林业科技，1994，（2）：38~40.
2 徐德树. 食品科学，1992，（8）：834~39.
3 张万年，刘泽鹰，王哲民，等. 中草药，1986，17（7）：41~44.
4 张克.宁夏农林科技，1990，（4）：423~25.
5 杨育红，张文辉，等.植物研究，2006，26（4）：435~441.
6 苗永美，简兴，石静，等.生物技术通报，2008，（1）：147~150.
7 王关林，石若夫，方宏筠，等.生物工程学报，2001，17（6）：688~
692.
8 Abdullah MA，et a1. J Plant Cell，1998，54（3）：173~182.
9 赵德修，李茂寅，等. 生物工程学报，2000，16（1）：99~102.
（下转第 94页）
王巍巍等：沙枣细胞悬浮培养体系的建立 77
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第 77页）
10 唐巍，吴绛云，等.生物技术，1992，2（1）：32~36.
11 岳彩鹏，等. 烟草科技，2007，（10）：56~59.
12 Marcela BKS，et a1. J Plant Cell，2003，73（2）：123~129.
抗菌作用 [11，12]，还能通过促进上皮细胞增殖和成纤
维细胞有丝分裂 [13]，促进胶原 mRNA 表达 、降低基
质金属蛋白酶的表达、增加细胞外基质的沉积和控
制其降解等方式加速伤口愈合 [14]。 通过超声处理诱
导家蝇幼虫产生抗菌肽，初步纯化后，药物敏感试
验证明其具有良好的体外抗菌效果，其中对铜绿假
单胞菌高度敏感。其抗菌效果与磺胺米隆组无显著
性差异。促伤口愈合的多种指标进一步论证了抗菌
肽比传统用药的优越性。但抗菌肽在高浓度使用时
是否具有细胞毒性还须进一步论证。
抗菌肽作为蛋白质有其独特的理化性质及作
用机制，以外源性形式应用时，伤口环境里的蛋白
酶 、电解质和 pH 的变更可能减低肽的活力 ，影响
抗菌肽的稳定性。 因此，有必要通过分子结构的修
饰和改造 [15，16]，增强抗菌肽在不同环境中的稳定性，
使之最大的发挥抗菌作用。
参考文献
1 lzadpanah A，Gallo RL.J Am Acad Derma Tol，2005，52：38l~392.
2 Cudic M，Condie BA，Weiner DJ，et al.Peptides，2002，23（12）：
2071~2083.
3 Kanost MR，Jiang H，Yu XQ et al.1mmunol Rev，2004，198：97~
105.
4 Lamberty M，Zachary D，Lanot R，et al.J Biol Chem，2001，276
（6）：4085~4092.
5 国果，吴建伟，付萍，等.昆虫学报，2006，49（6）：918~923.
6 周义文，尹一兵，涂植光，等 .中国抗生素杂志，2004，29（5）：
272~274.
7 陆婕，汪俊汉，钟雅，等.微生物学报，2006，46（3）：406~411.
8 叶应妩，王毓三，全国临床检验操作规程 .南京：东南大学出版
社，2006，896~912.
9 夏成德，赵耀华，牛希华，等.西南军医，2007，15（4）：263-267.
10 张嵘，金亚平，韩春茂，等.中华烧伤杂志，2002，18：285~287.
11 J Turner，Y Cho，NN Dinh，et al.Antimicrobial Agents and Chemo-
therapy，1998，42（9）：2206~2214.
12 Gennaro R，Zanetti M.Biopolymers（Peptide Science），2000，55：
31~49.
13 Van WS，Sterk PJ，Rabe KF，et al.J Allergy Clin Lmmunol，1999，
104：1131~1138.
14 Oono T，Shirafugi Y，Huh WK，et al.Arch Dermatol Res，2002，
294：185~189.
15 周红，郑江，鲁永玲，等.中华烧伤杂志，2003，19：86~88.
16 Chalekson CP，Neumeister MW，Jaynes J，et al.J Trauma，2003，
54：770~774.
94