全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2008年第 6期
收稿日期：2008-04-25
基金项目：北京市自然科学基金项目“马蔺抗旱种质鉴定及分子标记辅助筛选”（6062012），院所基本科研业务费专项基金创新团队（ywf-td-
3）
作者简介：王康（1982-），男，硕士研究生，专业方向：草地资源与草地管理工作；E-mail：wangkangkang224@yahoo.com.cn
通讯作者：董宽虎（1956-），男，教授，博导，Tel：0354-6287552，E-mail：dongkuanhu@sxau.edu.cn
DNA 分子标记是指能反映生物个体或种群间
基因组中某种差异特征的 DNA 片段，它能够直接反
映基因组 DNA 间的差异 [1~3]。自从 1974 年 Grozdicker
在鉴定温度敏感表型的腺病毒 DNA 突变体时首创
了 DNA 分子标记，即第一代 DNA 分子标记——限
制性片段长度多态性标记 （RFLP）以后 ，已经发展
了多种基于基因组 DNA 多态性的分子标记技术 [4]。
目前，在各种研究中使用的分子标记的数目已经有
几十种之多（表 1）[5~7]。
1 ISSR分子标记技术概述
微卫星（SSR）是一种高度串联重复序列，重复
基序仅为 2~6bp 如 （CA）n、（AT）n、（GGC）n 等，分
布于常染色质区，是真核生物基因组重复序列的主
要组成部分。 由于不同遗传材料重复次数的可变
性，导致了 SSR 长度的高度变异性，这正是 SSR 标
记产生的基础。 但是在 SSR 标记技术中，应用 PCR
技术必须知道扩增 DNA 片段两侧序列， 并且 SSR
两侧引物具有物种特异性， 引物设计费时耗力，所
以要检测多个基因座是不现实的，这就限制了该技
术的应用 [8]。
ISSR，即简单重复间序列（inter-simple sequence
repeat）也称为锚定简单重复序列 （anchored simple
sequence repeat，ASSR）标记或者称微卫星序列引物
PCR（microsatellite-primed PCR，MP-PCR），克服了上
述障碍，得到了较快的发展 [9，10]。它是在 SSR 基础上
产生的一类新型的分子标记技术，其引物开发费用
ISSR分子标记在牧草研究中的应用
王康 1，2 董宽虎 2 杨青川 1 康俊梅 1 董洁 2
（1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100094；2山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）
摘 要： ISSR（inter-simple sequence repeat）是在SSR标记基础上发展起来的一类新型的分子标记技术。在比较
ISSR和其它分子标记的原理和特点的基础上，主要对ISSR标记的原理、特点以及ISSR分子标记在牧草DNA指纹库的
构建、遗传多样性、种质资源鉴定、遗传作图和基因定位、分子标记辅助育种等领域的研究进展进行综述，并对其应用前景
进行简要概述。
关键词： ISSR 分子标记 牧草研究 应用
The Application of ISSR Molecular Marker in Forage Research
Wang Kang1，2 Dong Kuanhu2 Yang Qingchuan1 Kang Junmei1 Dong Jie2
（1Institute of Animal Science，CAAS，Beijing 100094；2School of Animal Science，
Shanxi Agriculture University，Taigu 030801）
Abstract： Inter-simple sequence repeat（ISSR）has been known as a new kind of molecular marker method based
on micro-satellites（SSR）. On the basis of comparing ISSR with other molecular markers，a summary was given about the
principle，characteristics，and the application of ISSR molecular marker involved in forage research，such as the studies of
DNA fingerprinting construction，genetic diversity，cultivar identification，genetic mapping，gene localization，marker-aided
selection，were also introduced. Meanwhile，the application prospect was shown briefly，thus being able to provide help for
the scholars engaged in the study of forage genetics and breeding.
Key words： ISSR Molecular marker Forage research Application
·技术与方法·
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
PCR DNA Southern
DNA
mRNA
RFLP SSCP-RFLP
DGGE-RFLP SNP
VNTR ISH FISH
DD RT-PCR DDRT-
PCR RAD EST STS
Satellite DNA SSR ISSR
Microsatellite DNA Mini
satellite DNA SSLP SRS
TRS
RAPD STS SCAR RP-PCR
AP-PCR OP-PCR SSCP-PCR
SODA DAF AFLP SRA
TRAP Indel or I/D
表 1 主要的分子标记技术
低， 具有操作简单， 比 RAPD 和 RFLP 能揭示更高
的多态性。 目前，ISSR 标记已广泛地应用于遗传作
图、品种鉴定、遗传多样性、基因定位、系统发育和
分子标记育种等方面 [11~13]。
2 ISSR分子标记技术原理及特点
ISSR 分子标记技术是由加拿大蒙特利尔大学
的 Zietkiewicz 等于 1994 年提出的一种利用 PCR 扩
增进行检测的 DNA 标记技术， 所用的引物是基于
简单重复序列而设计的寡核苷酸引物，用来检测 2
个 SSR 之间的一段短 DNA 序列的差异 [14，15]。 其基
本原理就是在 SSR 的 3 端或 5 端加锚 1~4 个嘌
呤或嘧啶碱基，并以此作为引物（通常为 16~18bp）
对两侧具有反向排列 SSR 的一段 DNA 序列进行扩
增。 在 PCR 反应中锚定引物可以引起特定位点退
火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列
间 DNA 片段进行 PCR 扩增。 然后进行电泳、染色，
根据谱带的有无及相对位置 ， 来分析不同样品间
ISSR 标记的多态性 [16]。
与其他主要的分子标记相比（表 2），ISSR 分子
标记技术结合了 RAPD 技术的优点， 克服了 RAPD
及其 SSR 标记技术的某些缺点，概括起来具有以下
几个方面的特点：①可在没有任何分子生物学研究
的基础上进行基因组指纹构建，为物种演化和分类
研究提供 DNA 水平上的证据； ②可同时检测基因
组多个 SSR 位点；③可采取类似 RAPD 的方法寻找
与所定位基因相连锁的 DNA 标记， 快速完成基因
定位 ； ④可在生长周期的任何时段进行检测 ，且
DNA 用量少； ⑤为显性标记， 符合孟德尔遗传规
律；⑥实验操作简单、快速 、高效，不需要繁琐的构
建基因文库、杂交和同位素显示等步骤 [17，18]。
RFLP RAPD SSR ISSR AFLP SNP EST
DNA 2~10g 10~25ng 50~120ng 25~50ng 1~2g 10~25ng 1~100ng
DNA
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表 2 几种主要分子标记的特性比较
3 ISSR分子标记在牧草中的应用
3.1 DNA 指纹库的建立
由于 ISSR 分子标记快速 、简便 、可靠 、多态性
高及重复性好，因此它可以用来建立 DNA 指纹库。
在同一物种的各个品种间存在大量的多态性标记，
某一品种具有区别于其它品种的独特标记即一些
特异性 DNA 片段的组合就称为该品种的 “指纹”，
各品种独特的指纹片段构成该物种的 DNA 指纹
库，它具有类似于人的指纹那样高度的个体特异性
和稳定性。 Charters[19，20]利用 ISSR 分子标记构建了
可可豆种质指纹库， 通过在 SSR 的 3 或 5 端加锚
碱基发现该库具有很高的重复性。
DNA 指纹库在牧草遗传育种方面将会发挥更
广泛的作用。首先，每个品种 DNA 指纹差异可直接
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提供与目标性状有关的 DNA 水平的信息， 避免了
环境干扰，从而可以大大提高杂交育种中对亲本及
后代理想单株的选择效率；其次 ，通过检测品种是
否具有该种特有的指纹标记片段，可以有效地鉴定
品种纯度与真伪以及用于新品种登记和品种知识
产权保护等。 魏臻武 [21]在苜蓿 （Medicago sativa L.）
基因组 SSR 和 ISSR 分析的基础上 ， 筛选出 8 对
SSR 引物和 12 个 ISSR 随机引物，构建了苜蓿基因
组 DNA 指纹图谱，为苜蓿引种、亲本选配和种质资
源评价提供了依据。
3.2 牧草遗传多样性与分类进化上的研究
植物的遗传多样性是其生存和发展的前提，它
是长期进化的产物。对于遗传多样性和遗传结构的
研究，是探讨其适应性、生存力的基础，同时也是分
析濒危物种致濒机理的基础。 ISSR 是一种非常有
效、 理想的能够揭示材料间遗传差异的分子标记，
因而在遗传多样性研究方面具有广泛的应用前景。
Joshi[22]认为 ISSR 标记在研究稻属植物进化关系中
非常有用。 Huang 和 Sun[23]认为 ISSR 标记可以揭示
更高的多态性，可以更好地区分种下分类群间的关
系。 Wolfe[24]等用居群取样的方法在玄参科吊钟柳
属 Penstemon 杂种复合体中得到了 10~24 个种专一
的 ISSR 标记， 清楚地支持了物种 P. clevelandii 的
二倍体杂种起源。
珊丹等 [25]通过使用 ISSR 分子标记对不同放牧
压力下大针茅种群进行遗传多样性分析时发现放
牧会导致部分基因位点丢失，但整个种群仍能表现
出丰富的多态性，其多态性条带比率可达 89% 。 夏
婧等 [26]在对邓氏马先蒿 （Pedicularis dunniana）的 2
个自然居群的遗传分化以及遗传多样性的研究中，
发现其遗传变异绝大部分来源于两居群间，居群间
表现出强烈的遗传分化，从而揭示了造成邓氏马先
蒿目前遗传结构的主要原因可能是自交的交配方
式以及小居群产生的遗传漂变。 此外，ISSR 分子标
记技术已广泛的应用在鸭茅 [27]、砂珍棘豆 [28]、中间
锦鸡儿 [29]、披碱草（李永祥，2005）、黑麦属（尚海英，
2004）和结缕草 [31]等植物的遗传多样性 ，结果表明
ISSR 标记可以有效的揭示种群间及种群内的遗传
多样性，进而分析其系统分化规律，研究群体遗传
结构、多样性程度 ，了解基因流动和渗入的方向和
作用为种源区划提供分子上的依据。
3.3 牧草种质资源鉴定中的应用
在我国各地不同的自然条件和栽培条件的长
期影响下，主要是通过自然选择形成了不少的牧草
地方品种，如苜蓿属。 这些地方品种在生产上一直
发挥着重大的作用， 是一批极为宝贵的种质资源。
但是， 在相当长的时期内地方品种的现状十分混
乱，名称繁多、性状不明、家底不清。 卢欣石 [30]认为
应当采用现代数量分类的方法和现代分子标记的
方法深入研究苜蓿属、葫芦巴属、扁蓿豆属以及黑
荚豆属等各属之间在形态学、生理学、农艺学的区
别，同时研究其各自繁殖系统、DNA 分子序列和进
化路线，借鉴国外的苜蓿属分类标准，重新划定目
前众说纷异的苜蓿属及其近缘属的界限，从而摸清
其遗传资源家底，统一分类标准，改进目前比较混
乱的现状。
ISSR 技术可以比 RFLP、SSR、RAPD 等技术更
多地揭示基因组中的多态性， 是一种很好的 DNA
指纹标记，因此该技术在种质资源鉴定方面显示出
比其他方法更高的优越性。胡雪华 [31]利用 14 个 ISSR
引物对上海结缕草和结缕草属进行研究发现，上海
结缕草 JD-l 与细叶结缕草、 沟叶结缕草和-结缕草
3 个种之间不存在亲缘上的直接联系，并初步断定
上海结缕草 JD-l 是一个新的变异材料。赵杨等 [32]利
用 ISSR-PCR 方法对 9 种胡枝子的种间变异进行了
研究，从 60 条引物中筛选出 12 条能扩增出清晰带
型并具有多态性的引物， 共扩增出 202 个 DNA 片
段，其中 198 个片段呈现多态性 ，占总扩增片段的
98%。 同时依据扩增结果进行遗传距离分析，构建
了系统树 ， 但与形态学分类的结果不完全一致 。
Gilbert 等 [33]利用 ISSR 分子标记技术研究了羽扇豆
种质资源检测的效率，他们认为进行 2~3 次 5 个个
体 DNA 混合检测可以充分反映羽扇豆种质中样品
内和样品间的遗传多样性，因此在对大量植物样品
进行评估时把来自同一样品不同个体的 DNA 混合
后进行检测是最为有效的策略。
3.4 遗传作图和基因定位
构建遗传图谱研究的目的是寻找足够的多态
分子标记，从而将所有基因定位到特定染色体的特
定区域，最好是在染色体步查（walking）距离内。 由
王康等：ISSR分子标记在牧草研究中的应用 67
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于 ISSR 标记可以揭示高度多态性， 且遍布于整个
染色体上，因此，它是绘制遗传连锁图的理想标记。
在连锁图的绘制上 ，ISSR 可以填补连锁图上较大
间隙，是更易为育种家们接受的经济、实用的分子
标记。同时，也可利用已有的连锁图进行标记，一旦
发现某一目的基因被定位在某一染色体上，就可以
选择分散在染色体不同位点的标记，逐渐逼近找到
该目的基因的分子标记。
利用 ISSR 标记进行基因定位的研究已在小麦
和水稻中取得了一定的成果，但在牧草上的研究甚
少。 Kojima 等 [34]用 ISSR 标记找到了 7 个与小麦籽
粒 QTL 连锁的分子标记，3 个标记与小种子性状连
锁 ，4 个标记与大种子性状连锁 。 Liu 等 [35]利用 33
个 ISSR 引物定位小麦品种 LK783 中的 K 型恢复
基因， 结果发现 UBS-845 标记与该恢复基因连锁，
定位在 1B 染色体上。在标记基因方面，Ratnaparkhe
等 [36]在鹰嘴豆中找到了抗镰刀菌萎蔫病的 ISSR 标
记，并将其转化为 SCAR 标记。由此可见，ISSR 技术
在寻找与控制农艺性状连锁的分子标记中非常有
用。
3.5 分子标记辅助育种
植物育种中分子标记辅助选择 （MAS）就是用
DNA 水平上的选种来代替以表型为基础的选种 ，
即通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记来判
断目的基因是否存在。 通过 ISSR 标记分析可筛选
出与目的基因（性状）紧密连锁的 DNA 片段或 QTL，
作为辅助育种的分子标记。由于它不受环境、性别、
生长发育的限制可进行早期选种，从而缩短了世代
间隔，提高了选种强度、选种效率和准确度。 另外，
对某些不期望的性状也能够及时地发现和淘汰，因
此应用这些分子标记进行间接选种将会得到事半
功倍的效果，特别是抗性育种。
ISSR 分子标记辅助选择刚刚起步， 但若与现
有的育种程序和其它标记相结合，育种学家就能以
前所未有的速度和精度来鉴定、转移、整合基因，育
成目标品种，在产生巨大经济效益和社会效益的同
时，可使牧草遗传改良学科发生深刻变革。
4 展望
随着草业科学的蓬勃发展，无论是宏观生态还
是微观分子上都将会成为研究热点，特别是产业化
后，对于种质资源的鉴定、保护以及产权的归属等
都需要进一步的完善，使其合法化。由于 ISSR 分子
标记技术在品种鉴定上具有高效性，可以检测出更
多的等位基因差异， 并且可以产生足够的多态性，
因此可用于大规模 DNA 指纹分析， 在解决我国牧
草品种混杂现状、品种鉴定以及品种登记方面将发
挥越来越大的作用。
遗传连锁图谱无论在理论上或实践上都具有
十分重要的价值，它使人们对遗传物质的观察进入
了一个更深的层次，从而使某些性状的分析更加详
实准确，亲本的选配更加合理。 目前有关牧草连锁
图谱的构建主要基于 RFLP、RAPD、AFLP 和 SSR 4
种分子标记技术以及传统的形态学、细胞学和同工
酶等方法。 ISSR 这一经济、实用分子标记的应用将
会填补遗传连锁图谱上较大的间隙，在整理分析前
人的研究数据基础上绘制出一个个饱和度较高的
遗传图谱。
ISSR 分子标记在生物学中最主要的应用是分
析和评估种群的遗传多样性，由于能够提供较大数
目的 DNA 片段，可以扫描基因组内的多态位点，因
而也是一种用于分析物种、种群、不同品系、甚至是
个体间遗传差异的理想方法。我国牧草资源种类繁
多、品系复杂，利用分子标记揭示其遗传多样性可
以帮助我们了解牧草种质资源多样性情况，了解品
种的遗传背景、 遗传结构及品种间的亲缘关系，为
种质资源的利用与开发提供帮助，为育种材料的选
择提供信息。
综上所述，ISSR 标记因其引物容易设计、实验
重复性强、操作简单、成本低、不需要同位素、可以
揭示更高的 DNA 多态性， 从而将会在牧草研究中
具有广阔的应用前景。但任何一种分子标记都不能
解决所有问题，在今后进行分子多态性标记的研究
中，应该用至少 2 种以上标记技术结合起来进行比
较研究，综合数据得出结论 ，这样实验结果的可靠
程度将会大大提高。
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