全 文 ：植物学通报 2005, 22 (6): 703~707
Chinese Bulletin of Botany
①山西省归国留学基金(2004-67)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: biochem@xztc.edu.cn
收稿日期: 2005-01-18 接受日期: 2005-04-30 责任编辑: 于昕
实 验 简 报
沙棘果皮多糖清除氧自由基的活性研究①
张海容②
(山西省忻州师范学院生化分析技术研究所 忻州 034000)
摘要 沙棘(Hippophae rhamnosides)果皮经80℃恒温水浴提取, 乙醇沉淀得粗多糖。Sevag法去蛋白,
经50%和70%乙醇分级, 得3种级分沙棘多糖H1、H2和H3; 以Fenton 反应, 即H2O2/Fe2+/水杨酸为.OH产
生和检测体系; 以邻苯三酚/EDTA/Tris-HCl为O2
-. 产生体系, 对沙棘多糖H1、H2和H3进行抗氧自由基活
性研究。结果表明, 沙棘多糖对.OH和O2-. 有较显著的清除能力。不同级分多糖H1、H2和H3浓度达200
mg.mL-1时, 对.OH的清除率分别为44.9%、49.0%和26.4%, 抗O2-. 活性分别为36.9%,15.4%和23.1%。多
糖质量浓度增大时,两种自由基清除率增加, 且呈量效关系。
关键词 沙棘, 多糖, 超氧阴离子, 羟自由基, 自由基清除率
Study of the Scavenging Radical Activities of Polysaccharide
of Hippophae rhamnosides Fruit Peel
ZHANG Hai-Rong②
(Institute of Biochemical Analysis, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000)
Abstract To study the scaventing radical activities of polysaccharide of Hippophae rhamnodides
fruit peel, crude polysaccharide was isolated from the fruit peel of H. rhamnosides with hot water
at 80 ℃, then precipitated by ethanol, and the protein in the extracts was removed by the Sevag
method. The fractions of H1、H2 and H3 of H. rhamnosides polysaccharide were obtained by
adding 50% and 70% ethanol, respectively. The Fenton reaction was used to produce and detect
hydroxyl radicals (.OH), and pyrogallol/EDTA/Tris-HCl was used to produce and detect super-
oxide anion(O2
-. ). H. rhamnosides polysaccharides had a strong scavenging capacity for both
.OH and O2-. oxygen radicals. When the fractional concentrations of H1、H2 and H3 were at 200
mg.mL-1, their scavenging rates to hydroxyl radicals were 44.9%, 49.0%, and 26.4%, respectively,
and to superoxide anion 36.9%, 15.4%, and 23.1%, respectively. The scavenging rates to oxygen
radicals increased with increasing the polysaccharide concentration; there appeared a propor-
tional relation between effect and quantity.
Key words Hippophae rhamnosides, Polysaccharide, Superoxide anion free radical, Hydroxyl
radicals, Free radical scavenging rate
704 22(6)
氧自由基主要指超氧阴离子(O2-. )、羟自
由基(.OH)、单线态氧(1O2)和过氧化氢(H2O2)
一类化学性质活泼、半衰期极短、能夺取其
他敏感分子电子的氧化剂。氧自由基过多的
有害作用, 表现在可使许多生物大分子如核
酸、蛋白质、多糖及膜多聚不饱和脂肪酸发
生过氧化物反应, 使生物大分子出现交链或断
裂, 引起细胞结构和功能的损害(雷学军, 1997;
Mathé, 1999; Magnani et al., 2000; Thomas,
2000)。氧自由基的这些毒性反应被认为与炎
症、自身免疫、肿瘤、心脑缺血和衰老等
疾病的成因直接有关。因此, 寻找可以用于
临床、能够清除活性氧自由基的天然药物有
极其重要的价值。
沙棘(Hippochase rhamnoides)属胡秃子
科植物,分布在欧亚大陆的温带、寒带及亚热
带高山区。我国的东北、华北、西北和西
南等地区是沙棘属植物的主要分布区。沙棘
作为药材含有多种活性物质,是我国古代藏医
和蒙医用来治病的常用药。我国早在唐代的
《月王药珍》和公元 8 世纪的《四部医典》
就详细地记载了它的药性, 它具有祛痰、利
肺、养胃、健脾、活血等生理功效。现代
药理证实, 沙棘可以治疗多种疾病, 并具有抗
疲劳、增强机体免疫力、延缓衰老等作用(徐
铭渔等, 1994)。目前, 沙棘已将被广泛用于食
品、化妆品、保健品和医药等多个领域。多
糖为天然高分子化合物, 存在于各种植物、
动物和微生物组织中, 具有许多重要的生理功
能。陈玉香等(1997)研究发现, 沙棘多糖对柯
萨奇病毒B3有明显的抑制作用, 但有关沙棘多
糖清除氧自由基(.OH、O2-.)活性未见报道。
本文尝试从沙棘果皮中提取多糖, 经乙醇分级
后, 研究它们对.OH、O2-.的清除能力, 为更好
地研究沙棘药理作用机理、扩大沙棘资源的
综合利用提供依据。
1 实验部分
1.1 材料与仪器
沙棘果皮由山西岢岚县酸溜溜厂提供(10
月下旬)。
DKZ电热恒温振荡水槽, 上海一恒实验仪
器有限公司; LD4-2型离心机, 北京医用离心
机厂; 722型光栅可见分光光度计, 上海精密科
学仪器有限公司分析仪器总厂; FTIR-8400傅
里叶变换红外光谱仪, 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 沙棘多糖的提取工艺 粗多糖的提
取: 称500 g沙棘果皮, 用95%乙醇1 000 mL
在50 ℃恒温水浴18小时脱脂, 倾倒剩余乙醇
浸泡液, 沥干; 用80 ℃恒温水浴提取2次(沙棘
果皮:水=1:6), 每次8小时, 合并提取液, 离心
除杂, 浓缩; 用95%乙醇沉淀; 纯化: 粗多糖用
Sevag法(氯仿:正丁醇=1:4)去蛋白多次, 直至
紫外光谱检不出蛋白质为止; 真空干燥, 得去
蛋白沙棘多糖 1.3608 g,样品呈褐黄色。沙棘
多糖分级: 将粗多糖配成1%(g.mL-1)溶液, 80
℃恒温水浴加热1小时, 静置, 去除不溶物, 上
清液用于乙醇分级。乙醇终浓度达50%时离
心, 沉淀即为H1; 乙醇浓度达70%时离心, 沉
淀即为 H2; 上清液浓缩, 沉淀即 H3。
1.2.2 沙棘多糖清除羟自由基的测定 实
验中, 在10 mL比色管中依次加入7.5 mmol.L-1
硫酸亚铁铵1 mL, 7.5 mmol.L-1水杨酸1 mL,
0.1% H2O2 1 mL, Tris-HCl 缓冲液2 mL, 最后分
别加入一定量 1 000μ g.mL-1 沙棘多糖H1、
H2和H3 , 室温静置2小时, 在722型光栅可见
分光光度计测吸光值。清除率(尹学琼等 ,
2002 )按下式进行计算:
清除率= ×100%
式中, A样品为加入多糖后的羟自由基体系
的吸光度值; A对照为不加多糖时羟自由基体系
的吸光度值。
1.2.3 沙棘多糖对超氧离子自由基抑制率
的测定 邻苯三酚在碱性条件下, 能迅速自氧
A对照-A样品
A对照
7052005 张海容: 沙棘果皮多糖清除氧自由基的活性研究
化, 生成一系列在400~425 nm处有强烈光吸收
的中间产物(许申鸿等, 2001), 同时释放出O2-.。
在5 mL pH8.34 0.01 mol.L-1 Tris-HCl缓冲溶
液(含 2 mmol.L-1 EDTA ) 中, 加入 1 mL 0.2
mmol.L-1邻苯三酚, 2次水定容至刻度。每隔
30秒记录一次吸光度A420值, 时间为 4分钟。
根据邻苯三酚自氧化速率计算抑制率(许申鸿
等, 2001 ):
抑制率(%)= ×100%
式中, ΔA1/Δt为邻苯三酚自氧化反应速
率; ΔA2/Δt为加入多糖后邻苯三酚自氧化反
应速率。
2 结果与讨论
2.1 沙棘多糖的红外光谱特征
沙棘多糖 H1、H2和 H3均呈现多糖的特
征吸收(表1), 且在833 cm-1附近有明显的吸
收, C1 构型系 a-D-吡喃型葡萄糖。
2.2 不同沙棘多糖对氧自由基清除率影响
的测定
按照实验方法1.2.2和1.2.3节, 分别加入
多糖H1、H2和 H3 (1 mg.mL-1)各 2 mL, 测体
系的吸光值或Δ A/Δ t,结果见表 2。
结果表明 , 沙棘多糖 H 1、H 2 和 H 3
对 .OH、O2-.均有一定的清除能力, 且在相同
多糖浓度条件下, 3种多糖对.OH 清除率优于
对O2-.的清除率。本文所采用的自由基模型体
系产生的.OH 和O2-.远大于生物体内自由基的
浓度, 因此, 沙棘多糖是一种良好的自由基清
除剂, 这与临床实践中沙棘多糖具有增强免疫
功能、抗肿瘤和抗感染活性的结论相一致。
H3对.OH清除率明显低于H1和H2, 可能由于
在分级纯化处理过程中, 许多原本与多糖结
合的糖肽、蛋白质成分被除去了, 而这些成
分一般具有较强的抗氧化性(李贵荣和杨胜
国, 2001)。H1对O2-.的清除能力则优于H2和
H 3。
2.3 质量浓度对沙棘多糖清除.OH、O2-.的
影响
分别考察了 3种沙棘多糖在 0~300 mg.
mL-1及0~600 mg.mL-1范围内对.OH 、O2-. 自
由基的清除率, 实验结果见图 1和图 2。由
图1易知, 随多糖浓度增加, 3种沙棘多糖清
ΔA1/Δ t-ΔA2/Δ t
ΔA1/Δ t
表 1 3种沙棘多糖的红外光谱数据(cm-1)
Table 1 IR spectral data of three kinds of Hippophae rhamnosides polysaccharides
Groups Characteristic peaks (cm-1) H1 H2 H3
O-H stretching vibration 3 600-3 200 3431 3410 3425
C-H stretching vibration 3 000-2 800 2854 / 2849
C=C framework vibration of benzene ring 1 900-1 650 1633 1626 1630
C-H bending vibration 1 400-1 200 1400 1404 1410
C-O stretching vibration 1 200-1 000 1010 1033 1017
a-D- glucopyranose 855-833 8 3 3 8 3 8 8 3 4
Isomeric pyranose symmetrical stretch 766 ± 10 7 6 9 / /
表 2 3种沙棘多糖清除氧自由基活性的测定
Table 2 Determining of scavenging ability of O2
-. Free radical with three kinds of
Hippophae rhamnosides polysaccharides
Hippophae rhamnosides polysaccharides Control H1 H2 H3
Absorbency(A) 0.704 0.388 0.356 0.518
.OH scavenging rate(%) 0 44.9 49.0 26.4
Δ A/Δ t 0.013 0.0082 0.011 0.010
O2
-. scavenging rate(%) 0 36.9 15.4 23.1
706 22(6)
除.OH、O2-.的活性增加, 呈现一定的正相关
性。如果用清除率达50%时所需抗氧化剂浓
度作为多糖清除氧自由基活性判断依据, 则
对.OH 自由基清除率 IC50%大小顺序为: H2 >
H1 > H3, 对O2-.自由基清除率的顺序为: H1 > H3
> H 2。
3 作用机理探讨
众所周知, 在生命活动的新陈代谢过程中,
.OH、O2-.及脂自由基(ROO.)是 3种有代表性
的自由基, 其中.OH氧化能力很强, 是仅次于
氟的一种非选择性氧化剂。 O2-.极不稳定, 其π
g*2p反键轨道中有一个未成对的电子,它既可
以得到电子,又可以失去电子, 还可与有单电子
的化合物结合。中性介质中, O2-.与O2 及H2O2
的电极电势如下:
O2 + e = O2
-. , E =-0.33V; O2-.+ H+ + e =
H2O2, E = 0.87V
抗氧化作用指能够使自由基的氧化作用
减缓或停止自由基氧化的各种过程, 它包括: 1)
自由基的清除和阻止增殖; 2)酶水解脂质中酯
键以除去过氧化脂肪酸; 3)过渡金属离子的阻
断; 4) 酶催化过氧化物的还原。常见的抗氧
化剂醛、Vc、VE、胡萝卜素及黄酮类化合
物易被O2-.氧化(Thomas , 2000)。沙棘多糖具
有清除.OH、O2-.的活性, 说明多糖中的半缩
醛还原基团、伯仲羟基等与氧自由基有明显
的化学作用, 此结论对临床药物筛选、抗衰
老、抗肿瘤、防病治病有重要的参考价值。
值得指出的是, 生物体内在各种酶存在的情况
下, .OH、O2-.和H2O2间可以相互转化, 已知的
化学反应如:
过氧化氢酶催化: 2H2O2 = 2H2O + O2
超氧化物歧化酶催化: 2O2-. +2H+ = H2O+ O2
Haber-Weiss 反应: O2-. + H2O2 = .OH + OH-
+ O2
Fenton 反应: Fe2+ + H2O2 = .OH +OH- +
Fe3+
谷胱甘肽过氧化物酶催化: H2O2 + 2GS-H
+GS = H + GS-GS
.OH 的浓度至少受O2-.、H2O2和金属离子
3个因素的影响; 反过来, O2-.的存在与其他氧化
还原剂、介质酸碱性有密切的关系(邵勇和宋
俊峰, 2001)。尽管人们无法模拟生物体内各
种生物酶和活性氧自由基的浓度大小及真实
的反应机理, 选择不同抗氧化剂清除氧自由
基、保护细胞和组织免受损伤或减轻其受损
图 1 浓度对沙棘多糖清除.OH活性的影响
Fig. 1 Effect of concentrations of Hippophae
rhamnosides polysaccharide on the activity of scav-
enging .OH
图 2 浓度对沙棘多糖清除O2
-. 活性的影响
Fig. 2 Effect of concentrations of Hippophae
rhamnosides polysaccharide on the activity of scav-
enging O2
-.
7072005 张海容: 沙棘果皮多糖清除氧自由基的活性研究
程度, 无疑是抗衰老药理学、生物医学领域
参 考 文 献
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充满希望的一个研究课题。
《植物学通报》征稿启事
《植物学通报》是中国科学院植物研究所和中国植物学会主办, 科学出版社出版的高级学术刊
物, 生物学、农学、农作物类核心期刊, 目前已被国内外多家数据库收录。期刊定位是以中文(英
文摘要)及时、快速和全面地反映我国植物科学及其相关学科研究的最新成果。根据《中国学术期
刊综合评价数据库》5716种源期刊的统计, 《植物学通报》2003年载文量 97, 总被引频次 742, 影
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2005年10月