全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (3): 276-283, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-05-08; 接受日期: 2007-06-28
基金项目: 国家自然科学基金(No.30060038)
* 通讯作者。E-mail: lisuli88@s ina.com
.研究论文.
甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化
李志刚 1 , 张新成1, 林丽 1 ,2 , 李素丽 1*, 杨丽涛1 , 李杨瑞 2
1广西大学农学院, 南宁 530005; 2 广西农业科学院, 南宁 530007
摘要 利用改进的冰冻切片法结合间接免疫荧光标记技术对甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化进行了研究。结
果表明, 在甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中存在4种循序变化的典型微管列阵,即周质微管、早前期微管带、纺锤体微管及成膜
体微管。同时, 还观察到在各种典型微管列阵相互转变过程中存在各种微管列阵的过渡状态。甘蔗茎尖正在伸长的幼叶部位
细胞的周质微管主要为与细胞伸长轴相垂直的横向周质微管; 茎尖幼叶部位伸长缓慢细胞的微管主要为纵向及斜向排列的周
质微管,在甘蔗茎尖幼叶基部初生增粗分生组织处, 横向、斜向、纵向及随机排列的周质微管列阵均有分布。在少数分裂前期
的细胞中, 发现细胞具有2条早前期微管带, 其具体功能还不清楚。表明甘蔗茎尖细胞微管列阵的变化与许多双子叶植物及部
分单子叶植物具有共同的变化规律, 进一步证明微管骨架的周期性变化在植物中具有普遍性。
关键词 间接免疫荧光定位技术, 微管骨架, 有丝分裂, 初生增粗分生组织, 甘蔗
李志刚 , 张新成 , 林丽 , 李素丽 , 杨丽涛 , 李杨瑞 (2008). 甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化. 植物学通报 25, 276-283.
微管(microtubule, MT)是真核生物细胞中的主要细
胞骨架成分之一, 在植物的生长、发育等生命过程中起
到非常重要的作用(Cyr, 1994; Chafey, 1999; Tian et
al. , 2004 )。目前在植物微管的研究中,已有大量实验
证据表明微管参与植物的形态建成(Sakaguchi et al. ,
1988; Abe et al., 1995a, 1995b; Holdaway et al. ,
1995) 。周质微管(cortical microtubules) 可能参与细
胞壁中纤维素微纤丝的排列, 早前期微管带(p repro-
phase band microtubule) 预示着细胞分裂板的位置,成
膜体微管(phragmoplas t microtubules) 参与细胞板的形
成, 纺锤体微管(spindle microtubules)参与染色体的正
常排布和均等分离行为活动等(顾月华等, 1997a)。目
前对植物微管骨架的免疫荧光研究多集中在花粉粒
(管)、胚囊、根尖或胚轴等材料上,所采用的主要方法
是Wick 等(1981)开创的离析单个细胞的方法。在大的
组织或器官水平上, 对微管的研究相对较少, 其中一个重
要原因就是缺少方便且稳定可靠的技术(何群和尤瑞麟,
2004 )。至今还未见到有关单子叶植物茎尖细胞有丝
分裂过程中微管骨架研究的报道。本研究利用改进的
冰冻切片法结合间接免疫荧光定位技术对甘蔗茎尖微
管骨架的变化进行研究, 为植物细胞有丝分裂过程中微
管列阵变化的普遍性和规律性提供新的实验证据, 同时
也为甘蔗茎增粗的细胞学研究提供微管动力学方面的理
论基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为甘蔗粤糖86/368(Saccharum offic inarum L.
‘YueTang 86/368’)。
1.2 方法
1.2.1 固定剂及固定液的选择
目前国内外报道的研究植物微管的固定液多为 4%多聚
甲醛溶液。由于甘蔗茎尖材料较大且细胞分化特殊, 经
过实验发现 9%甲醛溶液的渗透速度要明显好于 4%多
聚甲醛, 且对蛋白质抗原性的损伤也较小。配制固定液
的缓冲液是 50 mmol·L-1Pipes(pH 7.0)。通过实验发
277李志刚等: 甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化
现单一的 Pipes 缓冲液比 Pi pes、EGTA 和MgS O4
(PEM)三者混合液对细胞形态的维持效果更好。
1.2.2 材料的固定及切片
取伸长初期的甘蔗茎尖, 剥去幼叶, 在实体解剖镜下将包
裹生长锥的几片大的幼叶剥去, 仅保留生长锥附近的第
1-6片幼叶或叶原基。将甘蔗茎尖剪成4 mm×1 mm×4
mm 的组织块, 即包括幼叶原基、生长锥、伸长区的
初生增粗分生组织和部分成熟区, 立即投入 9%甲醛(用
50 mmol·L -1Pipes 配制, pH7.0)固定液中并抽气 15-
20分钟。将材料从抽气机中取出, 振荡摇动直至材料
下沉为止。室温下继续固定 4-24小时, 然后将材料在
10%DMSO(二甲基亚砜)(用 50 mmol.L-1 PBS 配制,
pH7.0 )中冲洗3-5次, 每次30分钟, 中间真空抽气15-
20分钟。材料在最后一级冲洗液中停留 2-3小时,经上
述处理过的材料在低温下切片可以得到很大的保护。
待冰冻切片机温度为-25°C--35°C时切片,切片厚度
根据材料细胞的大小和样品的自发荧光来确定。甘蔗
茎尖切片厚度为 15-20 µm。选取茎尖正中且典型的纵
切片用 L-多聚赖氨酸(Sigma P8920)粘片, 保存在 50
mmol·L-1PBS(pH7.0)中。在 4°C条件下存放 1周不会
失去微管的抗原性。
1.2.3 微管的免疫荧光标记
将切片从 PBS中取出, 在含2%Nonidet P-40的去污剂
中处理 0.5小时以增加细胞膜通透性。在含 1%纤维素
酶和 0.5%果胶酶溶液中处理5分钟后, 立即用 PBS冲
洗 3次, 每次 20分钟。然后在含 2%NonidetP-40的去
污剂中再处理30分钟(以上溶液均用50 mmol·L-1 PBS
配制,pH7.0), PBS 冲洗 3次, 每次 20分钟。将切片在
anti-aTubulin单克隆抗体(Sigma, 1:200, 用PBS稀释,
内含 2% 小牛血清蛋白)中室温下孵育 1小时。用相应
的缓冲液冲洗 3次, 每次 30分钟。之后在 FITC标记的
兔抗鼠抗体(Sigma, 1:40, 用PBS稀释)中室温下孵育1
小时。反应结束后用 PBS 冲洗 1-2小时, 期间冲洗液
更换4-5次。用含有50%甘油及0.1%对苯二胺(用PBS
配制, pH 8.5)的封片剂封片。封好的片子在 4°C冰箱
中黑暗条件下可保存 1-2周, 存放半个月以上抗体荧光
大为减弱。
为了检验结果的真实性及观察样品的自发荧光, 设
置以下对照: 不加一抗(A)、不加二抗(B)及一抗和二抗
都不加(C)。实验程序和上述完全一致。
1.3 荧光显微镜观察及图像处理
将制备好的片子在荧光显微镜下观察, 所用荧光显微镜
型号为Olympus BX51(Japan), 激发光为蓝光, 物镜镜
头为 100倍油浸镜头。标记理想的片子利用 Olympus
Digital Camera DP70图像采集系统进行采集, 图片保
存格式为 JPG。图像的后期处理采用 Photoshop 7.0
软件, 用高分辨率彩色打印机打印。
2 结果和分析
通过冰冻切片法结合间接免疫荧光标记技术对甘蔗茎尖
细胞的微管列阵进行研究, 所得结果和前人通过普通压
片法观察到的其它高等植物细胞微管列阵基本相同
(W ick et al. , 1981; Wick and Duniec , 1983; 澂朱 等,
1986; 顾月华等, 1997b)。通过免疫荧光定位, 在甘蔗
茎尖细胞分裂周期中, 观察到以下几种典型的微管列
阵: 间期细胞的周质微管列阵、有丝分裂前期细胞的
早前期微管带列阵、有丝分裂中期的纺锤体微管列阵
和胞质分裂中的成膜体微管列阵等。同时, 还观察到
各种典型微管列阵相互转变过程中的中间过渡状态的
微管列阵。
2.1 间期细胞的周质微管列阵
荧光显微镜下可以观察到在甘蔗茎尖的间期细胞中, 细
胞质膜下方分布着呈 “纤丝”或“束”状的发射荧光, 即
为周质微管, 它们围绕细胞的轴成圈地排列(图 1A)。根
据这种“纤丝”状结构相对于细胞伸长轴的排列角度, 可
以把周质微管分为横向(60°-90°)、斜向(30°-60°)、纵
向(0°-30°)和网络状(随机状)等。本研究发现, 在甘蔗
茎尖间期细胞中, 处于不同生长状态的细胞其周质微管
的排列有很大不同。在甘蔗茎尖正在伸长的幼叶部位,
278 植物学通报 25(3) 2008
图 1
Figure 1
279李志刚等: 甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化
分布的周质微管以横向为主(图 1A); 而在伸长缓慢以及
开始膨大的幼叶部位分布的周质微管以纵向为主(图
1B)。在甘蔗茎尖幼叶基部的初生增粗分生组织中, 横
向、纵向、斜向及随机状排列的周质微管列阵
(cort ical microtubule array)都有分布(图 1C-F)。周质
微管一般在胞质分裂后出现, 而在分裂细胞出现早前期
微管带时消失。
Laskowaki(1990)对豌豆不同节间及节间不同部位
细胞的微管排列的研究结果表明, 在快速伸长的细胞中,
微管为横向排列; 而在停止伸长的细胞中, 微管为斜向或
纵向排列, 并且这种转变发生在伸长速率下降的时候。
甘蔗茎尖幼叶部位处于正在伸长状态细胞的周质微管的
排列主要为横向排列, 而茎尖幼叶部位开始膨大的细胞
的周质微管主要为纵向排列。横向及纵向排列的周质
微管列阵可能分别在细胞伸长及膨大过程中起重要作
用。本研究观察到的甘蔗茎尖幼叶不同生长状态的周
质微管列阵与前人研究结果基本一致。
在甘蔗茎尖幼叶基部的初生增粗分生组织中, 周质微
管有横向、斜向、纵向和随机排列等多种形式, 在同一
区域细胞中同时观察到如此多样的周质微管列阵的报道
还不多见, 这可能与甘蔗初生增粗分生组织的功能有关,
其在甘蔗茎增粗中的具体作用机理有待进一步研究。
2.2 早前期微管带列阵
分裂细胞由间期进入分裂早前期的过程中, 在荧光显微
镜下观察, 发现间期细胞的 “纤丝”状周质微管“消失”,
可以很明显地观察到在有些细胞的中部、围绕核的周
质中, 具有强烈荧光的环带, 这就是典型的早前期微管带
列阵(preprophase band microtubule array)(图 1G,
H)。虽然不同区域的细胞形态有很大差别, 但是所形成
的早前期微管带结构都基本相似, 均为围绕细胞核中央
的强荧光带。早前期微管带和周质微管相同, 也是由许
图 1 甘蔗茎尖细胞有丝分裂周期的微管骨架
(A)-(F) 间期细胞的周质微管骨架:
(A) 正在迅速伸长的幼叶细胞的横向排列的周质微管;
(B) 幼叶部位开始膨大细胞的纵向排列的周质微管;
(C)-(F) 初生增粗分生组织部位的横向、纵向、斜向及随机或网络状排列的周质微管;
(G), (H) 茎尖不同生长状态的早前期微管带列阵, 箭头所示为核被膜荧光;
(I), (J) 异常的早前期微管带, 箭头示 2条早前期带;
(K) 早前期微管带开始变短且荧光强度降低, 核被膜荧光开始移向细胞两极;
(L) 早前期微管带消失, 细胞两极的荧光开始明显增强;
(M )-(P) 前期微管带向纺锤体微管过渡的各种中间状态, 极点发出的荧光逐渐向细胞中央延伸, 微管的“纤丝”结构变得更加清晰可见
bar=4 mm
Figur e 1 Photographs of the microtubule cytoskeleton in shoot apex cells of Saccharum offic inarum ‘YueTang 86/368’ based on
improved cryo-sec tioning and indirect immunofluorescence microscopy
(A)-(F) Cortical microtubules in the shoot apex of sugarcane:
(A) Transverse cortical mic rotubule in the rapidly elongating young leaves;
(B) Longitudinal cor tical mic rotubule in the slow ly sw elling young leaves;
(C)-(F) Transverse, longitudinal, oblique and random or netw ork cor tical mic rotubules in the pr imary thickening meristem;
(G), (H) Preprophase microtubule bands (PPB) in dif ferent regions of shoot apex, ar row in f igure 1G and big arrow in f igure 1H
indicate the f luorescence in the envelope of nuc leus;
(I), (J) A bnormal PPB, the arrow s show the double bands;
(K) The PPB is becoming shorter and low f luorescence, w hile f luorescence is moving tow ards the poles;
(L) The PPB is disappear ing and f luorescence in the poles is becoming lighter;
(M )-(P) Var ious transit ional microtubules arrays betw een the PPB and spindle, w hich indicate microtubules are extending f rom the
poles to the centers of the nucleus, and the mic rotubules are becoming clearer and visible
bar=4 mm
®
280 植物学通报 25(3) 2008
多平行排列的微管细 “纤丝”组成, 由于排列十分紧密,
所以形成一个明亮的环带。此时, 在细胞其它周质区域
没有微管的分布, 同时发现在早前期微管带形成的过程
中, 核膜区域出现核被膜荧光区(图 1G, H)。此后, 早
前期微管带开始解聚或松解, 荧光环带的荧光开始减弱
并逐渐变暗, 核被膜荧光开始向两极移动并从两极向细
胞中央扩展, 形成尖顶状结构(图 1K)。两极的“纤丝”
继续向细胞中部延伸, 早前期微管带已经完全消失(图
1L), 两极的“纤丝”继续向细胞中央延伸(图 1M), 这就
是纺锤体微管的雏形。这些早前期微管带荧光图像和
前人通过普通压片法在洋葱和大蒜等植物中观察到的结
构基本一致。
在甘蔗茎尖细胞有丝分裂周期中, 早前期微管带发
育和转化过程呈现多种时相(图 1G-J)。在少数早前期
细胞中, 意外地发现细胞核周围有 2条早前期微管带(图
1I, J)。Picket t-Heaps(1969)在咖啡因处理过的小麦细
胞异常有丝分裂中观察到此现象。W i c k 和 Dun i ec
(1983)在洋葱根尖正常有丝分裂的细胞中也观察到类似
的现象。在甘蔗茎尖细胞周期中观察到 2条早前期微管
带的过程中没有发现异常有丝分裂细胞的出现, 这种特
殊的微管带的功能现在还不是很清楚, 有必要通过其它
技术手段如特异微管药物抑制剂等来进行深入研究。
2.3 纺锤体微管列阵
在早前期微管带的末期已经出现纺锤体微管的雏形(图
1O)。随着细胞的分裂, 从两极发出的纺锤体纤丝继续
向细胞中央延伸(图1O, P; 图2A), 并且对称排列在赤道
面两侧, 中间处无荧光区, 无荧光的染色体排列在此处,
这就是典型的纺锤体微管列阵(spindle microt ubule
array)(图 2A)。同样, 可以在甘蔗茎尖不同区域观察到
不同分裂状态的纺锤体微管列阵(图 1O, P; 图 2A, B)。
纺锤体微管牵引赤道板位置的染色体向两极移动, 纺锤
体开始缩短, 形成后期的纺锤体微管(图 2B)。后期的纺
锤体微管牵引染色体继续向极点移动, 形成末期的纺锤
体微管列阵,在其形成过程中, 纺锤体微管的荧光强度及
长度大为减少。末期纺锤体微管牵引染色体移向两极
的过程中, 在赤道板的位置出现大面积区域的微弱荧光,
即为早前期的成膜体微管(图 2C-F)。此时, 细胞两极
处仍有部分末期纺锤体微管存在。
纺锤体微管列阵与染色体的运动及均等分离等活动
密切相关(Bajer and Mole -Bajer, 1971; 顾月华等,
1997a)。纺锤体的运动方向决定了细胞的分裂方向, 进
而影响植物的生长发育。通过研究纺锤体微管列阵的
变化有助于为甘蔗茎增粗的细胞学研究提供微管动力学
方面的证据。
2.4 成膜体微管列阵
在纺锤体微管末期, 纺锤体微管呈帽状结构相对地分布
在两极。纺锤体微管缩短减少的同时, 在细胞中央区域
出现微弱的荧光带, 这就是末期纺锤体微管向成膜体微
管过渡的中间状态(图 2C-F)。接着, 末期纺锤体微管
逐渐减少直至消失(图2G, H), 细胞中央区域的荧光带发
育为早期的成膜体微管列阵(phragmoplast microtubule
array)(图 2H)。早期成膜体沿纺锤体的方向排列, 然后
逐渐向赤道板方向缩短, 荧光开始增强, 同时成膜体微管
之间出现一条暗的无荧光的狭区, 这就是细胞板的位置,
即已经形成了典型的成膜体微管列阵(图 2I)。在整个胞
质分裂过程中, 可以明显地观察到成膜体微管在垂直于
赤道面方向上的宽度变小, 而沿赤道面方向长度增加。
胞质分裂结束后, 在子细胞中又重复出现间期细胞的周
质微管列阵(图 2J)。利用免疫荧光标记技术研究成膜体
微管具有极大优势, 因为可以在光镜水平下观察成膜体
微管空间整体结构的变化。
澂朱 等(1986)通过电镜观察发现, 在成膜体微管形
成的过程中, 许多囊泡排列在细胞板的位置, 这些囊泡最
后融合形成细胞板, 由此认为成膜体微管在运输含壁物
质的囊泡过程中起向导作用。因此, 利用普通切片法研
究微管骨架, 特别是成膜体在植物组织水平的功能具有
重要意义。
3 讨论
本研究利用冰冻切片法和间接免疫荧光标记技术对甘蔗
茎尖有丝分裂过程中微管骨架的变化进行初步研究, 研
281李志刚等: 甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化
究结果和前人在大葱( 澂朱 等, 1986)、洋葱(W ick et al.,
1981; Wick and Duniec, 1983)和绿豆(顾月华等, 1997b)
等植物中通过压片法得到的结果基本一致。说明细胞
有丝分裂过程中微管骨架的周期性变化在植物中具有普
遍性和共同的变化规律。本研究为微管的周期性变化
提供了一个新的实例。以往对植物有丝分裂过程中微
图 2 甘蔗茎尖细胞有丝分裂周期的微管骨架
(A) 典型的纺锤体微管带列阵, 箭头所示无荧光区域即为染色体所在部位;
(B) 纺锤体微管开始从赤道板移向两极, 纺锤体微管变短, 荧光强度变暗;
(C)-(F) 纺锤体微管缩短的同时, 赤道板位置出现早期的成膜体微管;
(G) , (H) 纺锤体微管带逐渐消失, 成膜体微管列阵离心扩散生长成为成熟的成膜体, 围绕细胞一圈, 从某一个面上看“变长”;
(I) 典型的成膜体微管列阵, 箭头示无荧光区域为细胞板的位置;
(J) 胞质分裂结束, 细胞质中重新出现的周质微管列阵
bar=4 mm
Figur e 2 Photographs of the mic rotubule cytoskeleton in shoot apex cells of Saccharum offic inarum ‘YueTang 86/368’ based on
improved cryo-sec tioning coupled w ith indirect immunofluorescence microscopy
(A) The typical spindle microtubule ar rays, the ar row indicates the site of chromosomes;
(B) Spindle mic rotubules ar rays are mov ing from the plates to the poles, and the f luorescence is becoming darker;
(C)-(F) While the spindle microtubule ar rays are becoming shorter, ear ly phragmoplast mic rotubules appear;
(G) , (H) Preprophase phragmoplasts are becoming narrow er and longer , spindle microtubules are almost disappearing;
(I) The typical phragmoplast is developed, the ar row indicates the site w here the cell plate f orms;
(J) The developing cortical microtubule arrays af ter mitos is
bar=4 mm
282 植物学通报 25(3) 2008
管骨架变化的研究多采用Wick等(1981)开创的压片法,
该法在植物微管骨架的研究过程中起到了很大的作用,
至今仍然被广泛采用。但是, 应用普通压片法研究植物
微管骨架很难得知细胞在植物组织或器官中的准确位置,
而不同位置的细胞具有不同的生长发育状态或功能。
因此, 有必要通过结合传统的切片法开展对植物微管骨
架的研究。本实验结果表明, 利用冰冻切片法结合间接
免疫荧光标记技术可以很好地标记植物微管。
已有大量的实验证据表明, 周质微管列阵可能通过
参与细胞壁纤维素微纤丝的形成来进一步控制细胞的生
长分化(Abe et al. , 1995a, 1995b; Verbelen et al. ,
2001)。本研究结果初步表明, 甘蔗迅速伸长的细胞及
伸长缓慢细胞的周质微管列阵变化和前人在豌豆中的研
究结论基本一致(Laskowaki, 1990)。Mita和Shibaoka
(1983)通过对洋葱鳞茎发育过程中周质微管列阵的变化
研究发现, 未形成鳞茎前叶鞘细胞周质微管为横向排列,
当鳞茎形成叶鞘膨大时周质微管解聚, 呈分散状态分布,
继而分散的周质微管消失。因此, 细胞膨大时周质微管
到底是解聚、消失还是变为横向排列的周质微管, 以及
这些过程是如何发生的都不是很清楚。细胞周期中各
种微管列阵的形成和转换与细胞周期同步, 并与不同时
期微管的特定功能相适应。但是, 这些细胞周期中的微
管列阵是如何从一种状态转化为另一种状态的, 是微管
先解聚为微管蛋白, 然后再聚合形成另外一种列阵, 还是
微管不解聚直接转化为另外一种列阵？目前, 这些问题
都有待进一步研究。因此, 今后有必要通过微管特异药
物抑制剂结合荧光显微注射技术或分子生物学技术开展
微管动态方面的研究(Sammak and Borisy, 1988; Yuan
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Abstr act The microtubule cytoskeleton w as inves tigated by using improved c ryosectioning and indirect immunofluorescence
staining in the shoot apex of sugarcane (Saccharum off ici narum ‘YueTang 86/368’). We observed four basic types of microtubule
ar rays : cor tical, preprophase-band, spindle and phragmoplast microtubule arrays. Other trans it ional mic rotubule arrays w ere
observed, w hich constituted the typical mic rotubule cyc le in the div iding cells of plants . Cortical microtubule arrays w ere mainly
oriented transversely to the cell elongation axis in cells of elongating young leaves in the shoot apex of sugarcane. Longitudinal and
oblique cort ical microtubules to the axis are the main arrays in the slow ly elongating young leaves, and other cortical mic rotubule
arrays, such as transverse, longitudinal, oblique and random microtubules, w ere observed in the primary thickening meristem in the
pr imordium of the shoot apex in sugarcane. Unexpected w ere some double bands of preprophase-band microtubules in a small
population of cells; their f unctions are still unknow n. The results sugges t that sugarcane microtubule arrays have the same periodic
change patterns as those of many dicotyls and some monocotyls dur ing cell div ision. The relation betw een the change pattern of
microtubule arrays and development or morphogenesis in the shoot apex of sugarcane is discussed.
Ke y words in direct imm un of luo re scence stain in g, mi crotub ul e cytoske leton , m itosi s, p ri ma ry th icke ni ng me ri stem, sug arca ne
(Sa cch aru m o ffi cin aru m ‘Yu eTan g 8 6/36 8’)
Li ZG, Zha ng XC, Lin L, Li SL, Yang LT, Li YR (200 8). Mi crotubul e cytoskeleton chan ge d urin g mi tosi s in th e sh oot apex of suga rcan e.
Ch in Bull Bo t 25 , 27 6-28 3.
* Author for correspondence. E-mail: lisuli88@sina.com
(责任编辑: 白羽红)
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