全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(2)：250— 255 2010年 3月
增强 UV-B辐射和 He-Ne激光对
小麦原生质体微管骨架的影响
郭爱华，高丽美，李永锋，韩 榕
(山西师范大学 生命科学学院 细胞工程研究所，山西 临汾 041004)
摘 要 ：以小麦叶片原生质体为材料 ，采用问接免疫荧光定位法标记其微管 系统 ，并利用激光共聚焦扫描显
微系统进行观察。研究了低剂量 He—Ne激光(5mW ·mm )、增强 UV—B辐射(1o．08kJ·m ·d )及二者的
复合处理对小麦幼苗叶肉细胞中微管骨架的影响。结果表 明，增强 UV—B辐射后 ，小麦叶片细胞 中微管骨架
发生解聚，呈短棒状或点状分布，微管束弥散且荧光强度减弱；而增强 uV—B辐射后再施以 He—Ne激光处理 ，
小麦叶肉细胞微管骨架有部分断裂，但较单独 UV—B处理组的损伤程度轻 ，说 明低剂量的 He—Ne激光可以部
分修复增强 UV—B辐射对微管骨架的损伤，且对微管的聚合有促进作用。
关键词：微管骨架 ；免疫荧光定位 ；小麦；He—Ne激光；UV—B辐射
中图分类号：Q245 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)02—0250—015
Influence on microtubule in wheat mesophyll
cell exposed to enhanced ul traviolet-B
radiation and He-Ne laser irradiation
GUO Ai—Hua，GAO Li—Mei，I I Yong-Feng，HAN Rong
(Institute of Cell Engineering．Colege of Life Science，Shar~i Normal University，I．infen 041004．China)
Abstract：In this paper，the protoplasts from fresh leaves of wheat seedlings was acted as material，which was exposed
to enhanced UV-B radiation(1O．O8 kl·rr2·d一1)，He_Ne laser irradiation(5 mW ·mm‘2)and the combined treat—
ments of UV-B and He-Ne laser．Effects of diferent treatments on microtubule(MT)cytoskeleton，which was Iabded
with indirect immunofluorescence localization，was studied through confoeal laser scanning microscope(CLSM)．The
results showed that microtubule of protoplast in wheat seedlings was depolymerized significantly to stick and spot un—
der the condition of enhanced UV-B radiation，the MT bundles was trend to dispersivity and decreasing of fl uorescence
intensity．However．the depolymerization of MT was decreased by He_Ne laser irradiation after enhanced UV—B radi—
ation．Therefore，the damage of microtubule in wheat seedlings induced by enhanced Uv_B radiation that can be re—
paired partly by He-Ne laser irradiation．
Key words：microtubule；immunofluorescence localization；wheat；He-Ne laser；Uv_B radiation；
大气平流层 中臭氧层 的破坏 ，导致到达地球表
面的 UV—B辐射大量增加(吴永波等 ，2004；Kakani
等，2003；Jeremy等，1996)。臭氧量每减少 1 Yo，地
球表面的UV—B辐射强度就将增加 2 (吴永波等，
2004；Kakani等，2003)。UV—B(28O～320 nm)辐射
的增加 ，对地球上的动 、植物以至人类本身都构成严
重威胁(韩榕 ，2002)。研究表明，增加的 UV—B辐射
对植物，特别是对紫外线敏感植物在生长发育，生理
收稿 日期：2009-12-15 修回日期：2O1O—O3 03
基金项 目：国家自然科学基金(30671061)；山西省自然科学基金(2008011059—1，20041101)[Supt~rted hythe National Natural Science Foundation of
china(30671O61)；the Natural Science Foundation of Shanxi Pmvince(2。O8O11059—1，20041101)]
作者简介：郭爱华(1983一)，女 ，山西人，硕士研究生 ，研究方向为植物细胞学 ，(E-mail)guoaihua2000@163．toni。
通讯作者(Author for correspondence)：男 ，博士，教授 ，研究方向为环境植物学，(E—mail)hanrong@dns．sxnu．edu．CFI。
2期 郭爱华等 ：增强 UV—B辐射和 He—Ne激光对小麦原生质体微管骨架的影响 251
生化代谢 ，遗传学水平都产生重要影 响(韩榕 ，2002；
Kalbin等 2001；Jeremy等，1996；Mulpuri等，1996)。
因此，揭示 UV—B对作物的损伤及其作用机理，寻找
有效的防护措施显得尤为重要(韩榕 ，2002)。
He—Ne激光作为一种新技术 ，在农业 、园艺、遗
传育种、生物工程 等方 面获得 了广泛的应用 。其低
剂量可促进植 物 的生 长发 育、生理 代 谢等 (韩榕 ，
2002；0u，2007)。微 管 (Microtubule，MT)是植 物
细胞骨架的重要组成成分之一 ，它在维持细胞形状 、
适应生长发育和环境变化，调控细胞分裂等方面起
着重要作用 。它既参与细胞 内物质运输 ，又能感受、
传导外界信号刺激 ，并能产生灵敏 的反应 (党磊等 ，
2002)。因此 ，微管骨架的研究已成为生命科学领域
中必不可少的一部分 ，且鉴于其研究技术不 断趋于
完善 ，尤其是近年来激光共 聚焦扫描显微镜 (confo—
cal laser scanning microscope，CLSM)的应用 ，为研
究细胞的精细结构开辟 了一条新的途径 。本文以小
麦为研究材料 ，采用 He—Ne激光及增强的 UV—B辐
射对其处理，旨在探明 uV—B辐射对小麦叶肉细胞
中微管骨架的损伤机制，以及 He—Ne激光对其的修
复效应，为今后农业 、林业生产实践提供可靠的理论
依据 ，同时为微管在分子水平上 的研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1供 试材 料
冬小麦晋麦 8号(Triticum aestivurn cv．Jinmai
8)，由山西省农科 院小麦研究所提供。选取籽粒饱
满、大小均一的种子，经 0．1 氯化汞表面消毒 ，浸泡
于玻璃器皿中，待种子露白后培养于铺有两层湿纱布
的培养皿 内，每盘 3O粒，25℃培养 ，待处理。
1．2处 理设 置
试验设置对照组 (CK)、UV—B处理组 (B)、He—
Ne激光处理组(L)、以及 UV—B与 He—Ne激光复合
处理组(B+L)。各组 处理方法如表 l，材料处理 6
日后用于后期研究 。
1．2．1 UV B处理 将小麦置于紫外 培养箱(紫外
灯 ：秦牌 ，宝鸡制造，3O W ，297 nm)，通过调整 UV—
B灯与植物培养皿之间的距离来控制 UV—B辐射的
强度 ，剂量选择 l0．08KJ·m ·d～。
1．2．2 He—Ne激光辐 照 He—Ne激光器 (M SHN —
A—B450 MM，西 北大学 光 电研究所 制造)波长 为
632．8 nm，光斑直径 2 mm。激光辐 照处理安排在
夜间进行 ，以排除杂光影响。
表 1 各处理组设置及程序
Table 1 Establishment and treatment
procedure of different groups
*表 不 与 UV—B辐 射 同时 进 行 。
It’at the same tim e with UV—B radiation．
1．3方法
1．3．1原生质体 的制备 参考刘炜 等(2001)，略有
改动。取 6日龄小麦幼苗第一片真叶，蒸馏水冲洗
干净，用双面刀片将 其切成 1～2 mm 的小碎块 ，置
于酶解液 中在 (26±1)℃ 中暗解 3 h左右，中间每
隔 0．5 h震荡一次。材料与酶解液之比为 l：5(w／
V)。酶解液组成为 1．5 纤维素酶 R一10(celulase
R一10，Japan)，0．1 果 胶酶 (pectinase，Fluka)溶 于
标准液 中配置而成 。标 准溶 液成分 为：5 mmol／L
CaC12·2H2O，0．5 mol／L甘 露 醇 ，0．5 mmol／L
KH2PO4，2 mmol／L MgSO ，3 mmol／L 2-氮吗啉乙
烷磺酸 (MES，Sigma)，pH 调至 5．6。待酶解完成
后用 280目尼龙网过滤除去未酶解完全的叶肉组织
碎片 ，滤液转移到离 心管 中，300 r／min离心 2 rain
后收集纯化原生质体 ，并用 PBS悬 浮，常温静置以
备用。
1．3．2原生质体活力检测 用荧光素二乙酸(FDA)
测定原 生质体的活力 。取 50 mg FDA溶于 1 mL
丙酮中配成母液，用 2O／xI FDA母液溶于 5 mL标准
液中，再以 1：1(V／V)与原生质体悬浮液混合，室温放
置 10 min后检测原生质体的活力(刘炜等，2001)。
1．3．3免疫荧光标记微 管 将获得的原生质体附在
涂有 1 mg／mL多聚赖氨酸(Mr 300 000；Sigma)的
载玻 片上 ，静 置 约 5 min，吸 去 多 余 的液 体。以
3．7 多聚甲醛(PBS配制 )固定 30 min，0．5 Fri—
tonX一100抽提 20 min，PBS(pH7．4)洗涤 3次，每次
5 min，以 3 BSA(PBS配制)封闭 15 rain。用单克
隆抗微管蛋白(小 鼠)的一抗 (Sigma产品)，以稀释
度 l：1 6O在 37℃孵育 1 h，以 PBS缓冲液洗涤，再
用 Texas Red-羊抗 鼠IgG(Invitrogen)以稀释度 l：
200在 37℃孵育 l h，PBS缓冲液洗 5次，每次 5
min。最后用 50 甘油 (PBS缓冲液配制)封片 ，透
252 广 西 植 物 30卷
明指 甲油封 边 (David等，1990；Wick & Dunice，
1981；斯 佩 克 特 等 ，2003；Akashi& Shibaoka，
1991)。对照 1是以 3 BSA／PBS代替一抗来 孵
育，其他步骤同前所述 ；对照 2是在原生质体进行免
疫荧光标记微管之前 ，以 50／~mol／L的微管解聚剂一
Oryzalin(黄草消)处理 1 h，其他步骤同前所述(党
磊等，2002)。
1．3．4图像的观察与采集 原生质体观察使用普通
数码显微镜，物镜镜头使用 lO倍和4O倍；荧光制片
使用激光共聚焦扫 描显微镜 Nikon TE一2000进行
观察与图像采集，激发光 为 543 rim，原生质体活力
测定时激发光为 488 nm，物镜镜头使用 4O倍镜和
60倍油镜，图像采集使用 512×512像素。
2 结果与分析
2．1原生质体的制备与活力测定
在小麦叶肉原生质体制备过程中不断镜检直到
有大量球形细胞产生为止。如图版 工：1所示，在普
通显微镜下观察这些原生质体，其外观呈光滑球形 ，
淡绿色，细胞质稠密并有颗粒 内含物，叶绿体清晰可
见，中央的大液泡不清澈，被原生质包围，说明其生
理活性较高(图版 I：2)。在激光共聚焦扫描显微镜
488nm波长激光激发下，原生质体中叶绿体的自发
荧光呈现红色 ，细胞核没有荧光而呈现 黑色 (图版
I：3)。对所制备原生质体活力的测定采用荧光指
示剂 FDA。FDA本身没有荧光，是一种亲脂性物
质 ，可透过完整的原生质膜进入细胞 内部，在细胞中
被胞内脂酶分解成一种非亲脂类的荧光极性物质，它
不能出入原生质膜，因而被保 留在细胞膜内，因此，有
活力的细胞在 488nm激发下显示黄绿色荧光，而无
活力的细胞则不能产生此荧光。本研究以FDA检测
获得的原生质体即使放置时问较长，原生质体活力仍
然较高，满足了后续试验的需要(图版工：4)。
2．2增强 UV—B辐射对原生质体制备的影晌
小麦叶肉细胞原生质体的制备过程 中，对照组
叶片在(26±1)℃酶解 3 h后，显微镜视野 中原生
质体较多，透明的细胞膜包裹着原生质内含物，形态
饱满光滑(图版 I：l，2)。与对照组相 比，在相同制
备原生质体的条件下 ，增强 UV—B辐射处理组所获
得的球形原生质体较少，浓度较低 ，视野中多有未酶
解完全的细胞 ，呈现短棒状或几个细胞连接状(图版
I：5)，说明增强 UV—B辐射后对小麦叶片细胞的胞
壁有影响从而影响小麦叶肉细胞原生质体的制备。
2．3不同处理组微管骨架的比较
对 四个处理组的小麦叶肉细胞原生质体进行间
接免疫荧光标记其微管 ，在激光共聚焦扫描显微镜
下观察微管骨架分布的变化。对照组 中微管骨架的
荧光亮度较强，结构清晰。细胞中周质微管呈现复
杂的立体网络状结构，存在于整个细胞质中，且它们
围绕着细胞中的叶绿体排列(图版I：6)。胞质微管
从细胞核核膜向胞质辐射出微管骨架结构而呈现辐
射状排列(图版 I：7)。用激光共聚焦扫描显微镜对
整个原生质体细胞做 断层扫描时，细胞中的液泡部
分不存在微管网络结构，且微管多存在于细胞内叶
绿体层的区域(图版 I：8)。
与对照组相比，增强 UV—B辐射处理的细胞，特
异性免疫荧光标记微管后，发现图像中荧光多呈现
片段状或点状分布，除点状荧光亮度较强外其他荧
光弥散不明亮(图版 I：9)，这说明增强 UV—B使细
胞 中微管骨架发生解聚。而增强 UV—B辐射后再施
以 He—Ne激光的复合处理细胞中，其微管结构虽不
如对照组的网络清晰明亮 ，还有解聚的点状荧光(图
版 Ⅱ：10)，但与单独 UV—B处理组相 比，复合处理组
点状明显少于 B组，且细胞中微管网络骨架也较其
明显。单独激光处理组的微管网络结构清晰，与对
照组的微管布局无明显差异，其荧光强度较对照组
强(图版 Ⅱ：l1)。本研究 中各处理组微管分布的差
异表明，低剂量的 He—Ne激光可以促进增强 UV—B
辐射所造成的微管解聚后的聚合 ，对增强 UV—B辐
射所造成的微管损伤有一定的修复作用 。
在进行微管间接免疫荧光标记对照试验中，不
加一抗的对照原生质体中荧光强度非常弱，几乎看
不见荧光，在激光共 聚焦扫描显微镜下观察不到微
管的网络结构(图版 Ⅱ：12)；在提前经过微管解聚剂
处理的原生质体 中有荧 光，但荧光呈点状和弥散状
分布 ，说明微管已解聚(图版 Ⅱ：14)，这证明了微管
间接免疫荧光标记的可靠性 。
3 讨论
3．1小麦原生质体的制备
原生质体 (protoplas1)由于失去了细胞壁的保
护，对外界条件非常敏感，因此在制备的过程中对理
化条件要求较严格(余晓丽，1998)。影响原生质体
产量和活性的因素中作用较大的是酶的种类 、浓度
2期 郭爱华等 ：增强 UV—B辐射和 He Ne激光对小麦原生质体微管骨架的影响 253
吱I 1．普通显微镜下小麦叶片的原生质体；2．普通显微镜下原生质体内叶绿体和细胞核；3．激光共聚焦扫描显微镜下488 nm激发的原
生质体，细胞内红色部分为叶绿体，黑色部分为细胞核；4．放置 10 h原生质体的活力；5．增强 uv_B辐射后制得的原生质体；6．CK组原生质
体内网络状的微管束；7．原牛质体内辐射状微管束；8．示细胞的液泡中无微管网络结构；9．B组解聚后的微管骨架。
Plate 1 1．Purified protoplasts of wheat seedlings under optical microscope；2．Chloroplast and nucleus of protoplast under optical microscope；3．
Protoplast at CI SM stimulated by 488 nnl，red is chloroplast and black is cell nucleus；4．Vigour of protoplasts after 10 hours：5
． W heat mesophyII
protoplasts after enhanced UV B radiation under optical microscope；6．Network MTs in wheat mesophyll protoplasts of control；7．Radiating M in
wheat mcsophyll proloplasls；8．showing no MTs in vacuole；9．dispersivity MTs after enhanced UV B radiation．
和酶解的时间(邢朝斌等 ，2006)。本研究采用六 日龄
小麦幼苗叶片为材料 ，酶液浓度是 1．5 纤维素酶和
0．1 果胶酶 ，酶解液 的 pH值为 5．6，酶解 3 h后发
现原生质体产量较高，且活性较强。原生质体由于消
除了细胞壁的障碍 ，被认为是遗传育种、基因转化 、生
理生化研究的理想 材料 (余晓丽，1998；党 磊，2002)。
在细胞骨架的免疫荧光标记中，它模拟了单细胞结构
和功能的完整性，排除 了周 围细胞 的影响；细胞壁的
去除为荧 光 探 针 的 导 人 提供 了便 利 条 件 (党磊 ，
2002)。
本文以小麦原生质体为材料，运用间接免疫荧
光定位法标记微管 ，研究增 强 UV B辐射及 He Ne
激光对其的影响 ，为植 物在逆境 中细胞骨架及信号
转导的研究奠定 了一定 的理论基础 。
254 广 西 植 物 30卷
3．2增强 UV-B辐射对小麦原生质体的影响
叶片是对环境胁迫最为敏感的器官 ，能直接反
映外界环境对植 物产生的影 响(訾先能等 ，2006)。
在关于增强 UV—B辐射对叶片 的影响研究 中，韩榕
(2002)用扫描电镜观察发现，增强 UV—B辐射造成
小麦叶表面气孔周 围产生大量的蜡质，且与 UV—B
辐射的剂量呈正相关 ；Kakani等 (2003)研 究也表明
增强的 UV—B辐射会增加叶片表面的蜡质含量 ，且
蜡质含量增加有利于增强作物对 uV—B辐射 的抗
性。此外 ，植物 的表皮 角质层 增厚对 提高植 物对
uV—B辐射增强 的抗性有一定益处 (訾先 能等，
2006)。
本研究在制备原生质体时发现，在相同条件下，
与对照组相比，经过增强 UV—B辐射 的叶片所制得
的原生质体多有棒状 ，为未完全酶解的细胞 ，这说明
经增强 UV B辐射 的小麦 叶片蜡质含量高 ，表皮层
加厚，致使叶片更密、更结实，而使其细胞壁不易酶
解 。这是植物对外界环境条件的一种反应，这种 变
化使植物在经受逆境时增强抵抗不良条件的能力而
保护 自身不受 到严重侵害。
图版 I 10．BL组的微管分布；11．I 组原生质体中网络状微管；12．未加一抗的对照；13．图12的明场透射图；14．经过微管解聚剂处理的对
照；15．图 14的明场透射图i图 4标尺一100 m，图 3、6 15标尺 一IOpm。
Plate 1I 10．MTs of He-Ne laser irradiation after enhanced UV B radiation：11．Network M after He-Ne laser irradiation：12．Control that have
no first antibody；13．Transmission image of Fig．12；14．Control after Microtubule depolymerization reagent Oryzalin；15．Transmission image of Fig．
14；Fig．4 bar is 100 um，Fig．3，6-15 bar is 10fire．
3．3增强 UV-B辐射和 He-Ne激光对小麦微管骨架的
影响
微管能对微重力、冷害刺激(刘刚等，2006)、病原
微生物的侵入(党磊，2002)、激素、光电信号(于荣等，
1998)等条件作出灵敏的反应，使细胞骨架的排布发
生变化。完整微管骨架布满整个细胞空间的 自身特
点决定其相互作用参与细胞的信号转导作用(刘刚
等，2006)，如微管骨架参与第二信使转导中信号的扩
大过程，钙离子能直接调控细胞骨架 的稳定性，也可
以通过和钙调素结合发挥作用，还可以由 Ca抖／CaM
通过微管骨架相关蛋白影响骨架成分 的稳定性并调
节它们之间的相互作用(刘刚等，2006)。所以，完整
的细胞微管骨架是信号转导所必需的，如果微管受到
干扰 ，依赖细胞骨架进行的信号转导反应也会受到干
扰或终止发生。
本研究发现增强 Uv_B辐射后细胞中微管骨架
2期 郭爱华等 ：增强 UV—B辐射和 He-Ne激光对小麦原生质体微管骨架的影响 255
的排布结构发生变化 ，损伤形成片段状和点状。其机
理可能是，细胞感受到外界刺激，首先作用于信 号感
知和传导的主要平台——质膜(李永才 等，2006)，质
膜上的信号受体、物质运输载体、活化底物的酶等重
要结构在感受到刺激后使其各种信号通路打开，细胞
骨架是各种信号传导途径的下游靶子 ，信号的改变使
微管骨架结构发生解聚或聚合变化 ，而这种结构的变
化又参与了信号级联反应过程 (李永才等 ，2006)，它
们的相互作用使细胞 中相关蛋 白和基因活化最终表
现在植物形态结构和生理代谢 的改变上 ，构成植物形
成 自我防卫的机制。增强 UV_B辐射后 ，微管结构发
生变化势必影响到细胞中各种信号转导的发生，而微
管受到了哪些信号分子的影响及它又是通过哪些信
号转导途径发生作用的?这些仍有待于进一步研究。
激光对生物体的作用主要表现为光效应、电磁效
应、热效应和压力效应。但低功率的激光产生的热和
压力很少 ，因此对生物的影响主要是光效应和电磁效
应 。He-Ne激光对增强 UVfB辐射后小麦的形态和
生理代谢表现为具有一定 的修复作用 (韩榕 ，2002)。
本研究发现，增强 uV_B辐射使小麦叶细胞表皮增
厚，且原生质体 中微管 骨架发生解 聚，而低 剂量 的
He—Ne激光对增强 U B辐射造成 的微管解聚具有
促进其聚合的作用。激光通过其光效应和磁场效应
作用于细胞中蛋白质和酶类，从多种水平对细胞遭受
UV-B后的损伤进行修复(韩榕 ，2002)。
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