全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (5): 624-628, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-11-02; 接受日期: 2006-11-27
基金项目: 国家 973计划(No. 2006CB101700)
* 通讯作者。E-mail: gywang@cau.edu.cn
.技术与方法.
一种从富含多糖的玉米幼穗中提取 RNA的方法
朱昀, 王猛, 贾志伟, 练云, 金颖, 王国英*
中国农业大学农业生物技术国家重点实验室, 北京 100094
摘要 介绍了一种大量提取玉米(Zea mays L.)幼穗总RNA的有效方法。由于玉米幼穗富含多糖, 用普通的RNA提取方法和
Trizol很难获得高质量的RNA。在热酚法提取RNA的基础上, 通过在提取缓冲液中加入低pH值的醋酸钾来去除多糖。所得到
的RNA获得率高, 质量好, 条带完整, 实验证明可直接用于RT-PCR、微阵列等各项后续分子生物学实验。
关键词 玉米幼穗, 多糖, RNA提取
朱昀, 王猛, 贾志伟, 练云, 金颖, 王国英 (2007). 一种从富含多糖的玉米幼穗中提取 RNA的方法. 植物学通报 24, 624-628.
从植物组织中提取高纯度、高质量的RNA是进行
分子生物学研究的必要前提和关键。分离RNA的主要
困难在于RNA分子自身存在2-OH, 稳定性差, 很容易
被广泛存在于植物组织的细胞及外部环境中非常稳定的
RNA酶降解。此外, 某些植物组织中的多酚、多糖和
蛋白质以及其它次生代谢物质也会严重影响RNA的提
取(李宏和王新力, 1999)。有关富含多糖的猕猴桃(陈昆
松等, 1998)、蜈蚣草(何振艳等, 2005)、香蕉(冯斗等,
2004)、芒果(杜中军等, 2005)和非洲菊(张玉进等,
2001)等植物组织的总RNA 提取已有报道, 但尚未见到
从富含多糖的玉米幼穗中提取总RNA 的报道。玉米幼
穗组织中多糖含量远远高于其它组织, 我们在采用已有
方法提取总RNA时发现, 多糖由于与RNA溶解性的高
度一致而在抽提时无法去除, 它在水相中与RNA形成难
溶的胶状物复合体, 造成RNA获得率的大幅度下降和降
解。为此, 我们尝试在热酚法提取 RNA的基础上进行
改进。
1 材料和方法
1.1 实验材料
以在中国农业大学种植的玉米(Zea mays L.)自交系178
为材料, 取开花前不同发育时期的幼穗。
1.2 实验方法
1.2.1 RNase的灭除
所用的研钵、研杵和药匙均用180°C烘烤8小时; 离心
管和枪头用0.1%焦碳酸二乙酯(diethylpyroca-rbonate,
DEPC)浸泡12小时后高温灭菌; 所有的提取试剂都用
0.1% DEPC水配制, 搅拌过夜后高温灭菌(Tris-HCl
和SDS除外, 用灭好菌的0.1% DEPC水配制即可)。
实验过程中勤换手套 , 以避免皮肤、汗水带来的
RNase污染。
1.2.2 RNA提取
RNA提取分为以下 14个步骤。(1)配制 RNA抽提缓冲
液, 10 mL中含有 2.212 5 mL DEPC-H2O, 1 mol.L-1
Tris-HCl (pH9.0) 0.325 mL, 4 mol.L-1 NaCl 0.162 5
mL, 10%SDS 1.3 mL, 水饱和酚 3.5 mL, 3.5 mol.L-1
KAC(pH5.2) 2.5 mL。将以上抽提缓冲液 65°C水浴预
热。(2)在液氮中研磨1-2 g玉米幼穗, 待液氮刚刚挥发,
将磨碎的材料迅速加入到上述预热的RNA提取缓冲液
中, 剧烈振荡 10分钟。(3)加入氯仿 4 mL, 剧烈振荡 10
分钟; 2 000× g, 4°C离心 20分钟, 取上清。(4)加等体
625朱昀等: 一种从富含多糖的玉米幼穗中提取RNA的方法
积氯仿, 混匀, 振荡 10分钟, 2 000× g, 离心 15分钟。
(5)取上清, 加 1/3体积的8 mol.L-1 LiCl, 4°C沉淀 8小
时。(6)12 000× g, 4°C, 离心 20分钟, 弃上清。(7)沉
淀用 70%乙醇漂洗 1次, 11 400× g, 4°C,离心 10分
钟, 无水乙醇洗 1次, 11 400× g, 4°C, 离心 10分钟,
吹干。(8)加适量水溶解, 即可电泳检测。如果有 DNA
污染, 可用以下方法去除。(9)用DNase处理, 在100 mL
RNA溶液中加入以下混合物: RNase Inhibitor 3 mL,
DNase 5 mL, 10×RNase-free DNase buffer 12 mL。
在 37°C消化 30分钟。(10)加入等体积苯酚抽提蛋白,
剧烈振荡10分钟后, 11 400×g, 4°C, 离心10分钟; 取
上清。用等体积氯仿去除多余苯酚和蛋白, 剧烈振荡10
分钟后, 11 400× g, 4°C, 离心 10分钟。(11)取上清,
加入1/10体积 3 mol.L-1 醋酸钠(pH5.2), 混匀, 再加3
倍体积的无水乙醇, -70°C放置2小时(为了得到最大获
得率, 可于-70°C过夜放置)。(12)11 400×g, 4°C, 离
心 20分钟。(13)沉淀用 70%乙醇漂洗 1次, 11 400×
g, 4°C, 离心 10分钟, 无水乙醇洗 1次, 11 400× g,
4°C, 离心 10分钟, 吹干。(14)溶于 100 mL DEPC-H2O
中, 电泳检测完整性, 保存于-70°C, 备用。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳
采用DEPC水配制的1xTAE作为电泳缓冲液, 电泳槽用
0.4 mol.L-1 NaOH 浸泡 4小时以上, 琼脂糖凝胶浓度
为 1%, 电压为 5 V.cm-1。
1.2.4 RT-PCR
以提取的总RNA为模板, 用Promega公司的M-MLV反
转录酶合成 cDNA 第1链后, 稀释10倍作为PCR的模
板。PCR反应体系(25 mL)中包括 1 mL cDNA, 0.4
mmol dNTP ,上下游引物各 10 pmol ,1 U Taq 酶。玉
米 Z m S I N A 1 引物序列分别为 : 5 引物 P 1 ,
5AGTGGTGGGCTGCTGATGGT3; 3引物 P2 ,
5GGATGATGGGATGGAATGGAA3。cDNA 模板在
94°C变性5分钟后, 扩增(94°C 40秒, 60°C 40秒, 72°C
90秒) 35 个循环; 最后 72°C延伸 10分钟。用 1%琼
脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.2.5 微阵列杂交
以2个不同的RNA为模板, 用 Invitrogen公司的荧光标
记试剂盒进行反转录和 CY3、CY5的荧光标记, 将标
记后的两 cDNA等量混合, 避光杂交12小时(所用芯片
来自美国 Arizona大学)。洗片后扫描。
2 实验结果
2.1 RNA完整性分析
经琼脂糖非变性凝胶电泳和分光光度计检测, 本方法提
取的RNA完整性好, 28S rRNA 的亮度高于18S rRNA,
无降解现象(图1A); RNA纯度很高, 无杂质污染, OD260/
OD280在1.90-2.10之间, OD260/OD230在2.05-2.30之
间。无论是完整性还是纯度均符合实验要求。而用普
通RNA提取方法得到的RNA黏稠不易溶解, 条带模糊
不清并伴随降解现象(图 1B)。
图 1 两种方法提取玉米幼穗总 RNA的电泳图
(A)改进热酚法提取富含多糖的玉米幼穗电泳图;
(B)普通方法提取富含多糖的玉米幼穗电泳图。
1:生长锥突起期; 2:小穗分化期; 3:小花分化期; 4:性器官分化期;
5:小花分化期; 6: 性器官分化期
Figure 1 Agarose eletrophoresis of the total maize youngear
RNA isolated by different methods
(A) agarose electrophoresis of the total RNA extracted by the
modified method;
(B) agarose electrophoresis of the total RNA extracted by the
normal method
1: growth cone stage; 2: differentiation of spikletes stage; 3:
differentiation of florets stage; 4: differentiation of sexual stage;
5: differentiation of florets stage; 6: differentiation of sexual
stage
626 植物学通报 24(5) 2007
2.2 RT-PCR
以改进的热酚法提取的总RNA为模板, 玉米ZmSINA1
基因特异引物P1、P2进行RT-PCR, 预期能扩增出长
度为 1 075 bp的片段。实验结果表明, 能成功扩增
出目的片段, 而无模板对照则没有扩增出条带(图2),
说明该法提取的RNA 样品质量好, 可以进一步用于后
续实验。
2.3 微阵列杂交
以改进的热酚法提取的RNA为模板进行反转录, 将得到
的cDNA用不同的荧光进行标记, 标记产物避光杂交后
扫描得到不同RNA样本的表达图谱(图3)。实验结果显
示, 大部分基因表达均衡, 在不同的RNA样本间没有差
异, 个别基因有上调和下调的现象。此结果进一步说明
用该方法提取的RNA质量高, 完整性好, 可以用于高精
度的后续实验。
3 讨论
3.1 pH值的影响
在 pH5.3的酸性环境中, DNA和RNA分别进入有机相
和水相, 蛋白则被有机溶剂变性除去。水相经再次变性
和分相处理后只剩下RNA, 经醇沉淀即可获得(袁明珠
等, 2005)。因此在RNA提取过程中pH值是很重要的。
在本实验中, 醋酸钾作为去除多糖的主要成分, pH值要
调低, pH5.2或4.8 的提取效果都不错, 在第10步的检
测中已经看不到 DNA的污染。
3.2 多糖的去除
多糖的污染是提取玉米幼穗RNA时遇到的一个棘手的
问题。多糖的许多理化性质与 RNA相似, 在提取中与
RNA以复合体形式存在, 很难将它们分开。在去除多
糖的同时RNA也会被除去, 造成RNA获得率的大幅度
降低并降解。在溶解 RNA时, 这种与多糖形成复合体
的 RNA难溶于水, 或溶解后产生黏稠水母状的胶质溶
液。由于多糖可以抑制许多酶的活性, 因此污染了多糖
的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究(李宏和
王新力, 1999)。
目前去除植物组织中多糖的方法主要有 3种。
一是用高浓度的 Na＋、K＋改变多糖的溶解特性,
使其脱离水相进入有机相, 然后用酚仿抽提去除(Su and
Gibor, 1988), 如用醋酸钾溶液沉淀多糖(Hughes and
Galau, 1988; Bahloul and Burkard, 1993; Ainsworth,
图 2 RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图
1:无模板对照; 2:以改进的热酚法提取 RNA为模板的 RT-PCR 产
物; M: DNA marker
Figure 2 Agarose electrophoresis of RT-PCR products
1: control without templet; 2: RT-PCR product (with RNA tem-
plet obtained by modified method); M: DNA marker
图 3 微阵列杂交扫描图
Figure 3 Scan for microarray hybridization
627朱昀等: 一种从富含多糖的玉米幼穗中提取RNA的方法
1994)。在本实验中, KAc的终浓度并不需要十分精确,
占总抽提液的1/5-1/3的醋酸钾都可以有效去除多糖并
最终获得质量完好的 RNA。
二是在沉淀 RNA之前, 采用乙二醇丁醚(周波等,
2004)、乙醚(袁明珠等, 2005)或丁氧乙醇(何振艳等,
2005)分相把多糖去掉。
三是选择性沉淀多糖或RNA。LiCl 可以选择性地
沉淀RNA, 去除大部分多糖, 但实验周期较长, 沉淀RNA
一般都需要至少2小时以上的冰浴。在本实验中, 经过
LiCl过夜沉降的沉淀仍然是难溶于水的RNA多糖复合
物, 推测可能和玉米幼穗组织中含糖量过高有关。所以
玉米幼穗的RNA 提取不适合用这种方法。文献报道低
浓度乙醇(10%-30%)可以沉淀多糖(Tesniere and
Vayda, 1991; Lewinsohn et al., 1994), 而 RNA则要
在75%乙醇中才能沉淀下来, 所以可以利用RNA与多
糖在不同浓度乙醇中沉淀性不同来分离这2种物质。另
有文献报道低浓度乙醇和醋酸钾溶液可以共同沉淀多糖
(Lopez-Gomez and Gomez-Lim, 1992)。我们在前期
图 4 放置 1年的 RNA电泳图
1: 新鲜提取的 RNA; 2: 放置 1年的 RNA
Figure 4 Agarose electrophoresis of the total RNA stored for
1 year
1: agarose electrophoresis of freshly-extracted RNA; 2: agar-
ose electrophoresis of sample C stored for 1 year
的实验中采取25%的乙醇和醋酸钾共同沉淀多糖, 但
是RNA却与多糖一起进入有机相, 并在接下来的抽提
中损失掉。
3.3 提取环境与保存
很多实验室RNA的提取都是在超净工作台完成的, 这样
浪费资源而且没有必要。由于RNase主要来源于人的
皮肤汗液, 而空气中的含量很少, 本方法介绍的RNA提
取在正常实验环境中即可进行。所得 RNA质量完好,
无降解。为防止 RNA在长期保存过程中降解, 我们建
议所分离的RNA 最好保存在70%乙醇或DEPC处理水
中。用本方法提取的 RNA保存在乙醇中, 放置 1年仍
没有降解(图 4)。
综上所述, 用本方法对富含多糖的玉米幼穗组织总
RNA的提取获得了成功。所提取的RNA排除了多糖和
蛋白质的干扰, 可以满足后续分子实验操作。而利用常
规的方法提取玉米幼穗RNA, 不预先去除多糖是无法得
到高质量RNA的。本实验也尝试用低浓度乙醇和 LiCl
沉淀多糖, 但对于玉米幼穗其效果均不如醋酸钾。
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An Effective Method for Extracting Total RNA from
Young Ears of Maize
Yun Zhu, Meng Wang, Zhiwei Jia, Yun Lian, Ying Jin, Guoying Wang*
State Key Laboratory for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, China
Abstract Here we report a modified hot phenol method for extracting the total RNA from young ears of maize. This method
involves wiping off polysaccharides by adding KAC in the extraction buffer. RNA isolated by this method is of high quality and can
be used for the later molecular manipulations.
Key words immature ear, polysaccharides, RNA isolation
Zhu Y, Wang M, Jia ZW, Lian Y, Jin Y, Wang GY (2007). An effective method for extracting total RNA from young ears of maize. Chin
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* Author for correspondence. E-mail: gywang@cau.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)
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