全 文 ：植物学通报 2005, 22 (2): 238~245
Chinese Bulletin of Botany
①教育部优秀青年教师计划和全国优秀博士学位论文作者博士专项基金(200253)项目资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: htang@sicau.edu.cn
收稿日期：2003-11-17 接受日期：2004-03-05 责任编辑：孙冬花, 于昕
专 题 介 绍
包埋玻璃化法超低温保存植物种质
的研究进展①
1吴雪梅 2汤浩茹②
1(中国科学院成都分院山地灾害与环境研究所 成都 610041)
2(四川农业大学林学园艺学院 雅安 625014)
摘要 包埋玻璃化法是在玻璃化法和包埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质的新技术。它
具有能同时处理大量材料，处理后恢复生长快，对材料的毒害作用较小及成芽率高等优点，已成功地用
于辣根、山嵛菜等20余种植物，在植物种质资源的保存上显示出了巨大的应用潜力。本文介绍了包埋玻
璃化法产生的背景及其优点， 阐述了包埋玻璃化法的基本方法和预培养、包埋、脱水、化冻及恢复培养
等过程，比较了该法冻存后的效果和冻存后所形成植株的遗传稳定性，同时指出了进一步研究的重点。
关键词 包埋玻璃化，超低温保存，植物种质保存
Research Advances in Cryopreservation of Plant Germplasm
by Encapsulation-vitrification Method
1WU Xue-Mei 2TANG Hao-Ru②
1 (Institute of Mountain Hazards and Environment, the Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041)
2(Forestry and Horicultural College of Sichuan Agricultural University, Yaan 625014)
Abstract Encapsulation-vitrification, a new method for cryopreservation of plant germplasm in
recent years, was developed on the basis of vitrification and encapsulation-dehydration. It has
many advantages over vitrification and encapsulation-dehydration, because more materials can
be treated at the same time, growth is recovered more rapidly after treatment, it is less harmful to
the material, and allows for a higher shoot regeneration rate. It has been successfully used to
preserve more than 20 species, such as pear, horseradish and wasabi, and shows great applica-
tion potential in the preservation of plant germplasm resources. This paper introduces the devel-
opment and advantages of encapsulation-vitrification and the main methods and procedures
such as preculture, encapsulation, dehydration, thawing and recovery of culture. The effects of
freezing protection and the genetic stability of plant materials preserved with encapsulation-
vitrification are discussed as well. Further research on encapsulation-vitrification of plant tissue
is also suggested.
Key words Encapsulation-vitrification，Cryopreservation，Plant germplasm preservation
2392005 吴雪梅等: 包埋玻璃化法超低温保存植物种质的研究进展
植物种质资源是植物遗传育种的原始材
料，也是物种进化和遗传学研究的物质基
础。但是，由于人口增加、工业高速发展以
及农业上的良种种植化趋势等原因，使得植
物遗传基础越来越趋向于单一化，一些地方
品种及珍贵稀有的植物资源也正从地球上逐
渐消失。据资料统计，现在全世界已有10 %
的高等植物物种的生存受到威胁(国家环保局,
1991)， 估计到2050年将有25%的物种陷入灭
绝的境地(王献溥, 1994)。因此世界各国对种
质资源的收集和保存都非常重视。目前常用
的保护植物种质资源的方法主要是建立自然
保护区、建立植物种子库以及组培技术离体
保存植物3种，但这几种方法都有着各自的局
限性。在自然保护区或田间圃地保存容易遭
受各种自然灾害，导致植物种质资源的丢
失，且费时费力，成本高。建立种子库只适
用于产生“常规”种子的植物，无法用于
“顽拗型” 种子或营养繁殖的植物。组培离
体保存省时省力，适用于大多数植物，但因
为长期离体培养需要定期继代，并且可能会
引起遗传性状的改变(梁永恒等, 1999; 赵艳华
等, 1999; 徐刚标, 2000)。为了克服以上保存方
法的缺点，更有效地保存种质资源，一些学
者开始尝试使用超低温法保存。众多试验结
果证明，超低温(一般指液氮-196 ℃)保存是植
物种质保存技术中较为理想的方法(Takagi et
al., 1997; 吴诗光等, 1999)。随着方法的不断
改进，超低温保存成功的样品越来越多。继
20世纪80年代末90年代初出现的玻璃化法
(vitrification)和包埋脱水法(encapsulation-
dehydration)之后，近年来出现的包埋玻璃
化法(encapsulat ion-vi tr i f icat ion)兼容了
前两者保存种质的优点，显示了巨大的应
用潜力。
1 包埋玻璃化法产生的背景
玻璃化法是 Luyet于 1937年提出的。之
后，经历了长期的理论与实践探索，20 世
纪80年代中后期才在动植物的种质保存中取
得了突破性进展。Sakai等于 1990年建立了
玻璃化冻存的简单高效的技术体系：在材料
冰冻之前用高浓度冰冻保护剂(plant vitrifica-
tion solution，PVS)处理，再投入-196 ℃
液氮，使脱水样品玻璃化而没有冰的产生。
此法具有设备简单，材料处理简单，效果和
重演性好等优点(Langis et al., 1990; Niino et
al., 1992; Lu and Steponkus, 1994; Takagi et
al., 1997)。但由于 PVS保护剂浓度很高，对
材料毒害性极大(Matsumoto et al., 1994,
1995a)，因而需严格控制脱水过程及冰冻保
护剂的渗透性。此外，该法较难在同一时间
内处理大量材料。
包埋脱水法最早出现在法国学者 Fabre
和 Dereuddre(1990)保存马铃薯茎尖的研究
中。它参照了人工种子的技术，结合低温保
存的需要，将包埋与脱水相结合，应用于超
低温保存中。用藻酸盐包埋样品，在含一定
浓度蔗糖(一般为0.3~0.75 mol.L-1)的培养基中
预培养，然后在通风橱中处理 2~6 小时，或
用硅胶处理，通过空气蒸发脱水。其优点在
于容易掌握，缓和了脱水过程，简化了脱水
程序，减少了环境因子波动对样品造成的影
响，而且一次能处理较多的材料，避免了使
用二甲亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)和乙二醇
(ethylene glycol, EG)等对细胞有毒性的冰冻保
护剂。但是，包埋脱水法与玻璃化法相比组
织恢复生长慢，脱水所需时间长，而且在一
些植物中存活率、成苗率低。为克服玻璃化
法和包埋脱水法的缺点，M a t s u m o t o 等
(1995b)开始使用包埋玻璃化法保存植物样
品，发现同包埋脱水法相比，以包埋玻璃化
法冻存 ‘Wasabi’3天后，存活率可达 96%，
较后者提高了 30%；且材料恢复生长快，方
法易于掌握，还大大节省了脱水时间。
2 包埋玻璃化法基本操作程序
预培养和包埋→玻璃化溶液脱水→液氮
240 22(2)
保存→化冻→恢复培养
2.1 预培养
预培养的目的在于提高植物抗冻能力
及渗透忍耐力，减少或避免冷冻伤害。包
埋玻璃化法冻存研究中常用的预培养方式
有以下几种。
2.1.1 在添加高渗物质的培养基中预培养
将材料在含蔗糖(或山梨醇、脯氨酸、甘露
醇、海藻糖)等渗透剂的培养基(通常是用于
培养该材料的培养基)上，常温条件下预培养
数日，以减少细胞内自由水含量，增强组织
细胞抗寒能力，增加其保护性物质含量。
2.1.2 零上低温冷驯化 将小的试管苗置于
正常培养基上，在零上低温、黑暗条件下冷
驯化一段时间(3~5天)，以形成保护性物质和
结构，增加其耐冷冻能力，然后在无菌条件
下切取茎段或茎尖为保存材料。
2.1.3 包埋后预培养 材料包埋后在含高浓
度蔗糖的培养基中预培养一段时间(1~6天)。
Phunchindawan等(1997)采用此法，将辣根
芽原基包埋后，放入含0.5 mol.L-1蔗糖的MS
培养基上预培养 1天，取得了较好的效果，
冻存后成活率达 69%。
2.2 包埋
将茎尖悬浮于不含 Ca 2+但含藻酸钠的
MS液体培养基上，再将该混合液滴于 Ca2+
溶液中，因藻酸钠钙的生成而固化成球状颗
粒。褐藻酸钠常用浓度为 2%~3%，CaCl2浓
度为0.1 mol.L-1或0.5 mol.L-1，保证固化完
成所维持时间为30 分钟。褐藻酸钠中一般加
入2 mol.L-1甘油和0.4 mol.L-1蔗糖作为渗透
保护剂(Matsumoto et al., 1995b; Hirai et al.,
1998; Hirai and Sakai, 1999a)。如果样品在包
埋前经过高浓度的蔗糖预培养，包埋液中必
须含更高浓度的蔗糖，否则会使材料重新回
到低渗状态。该渗透保护剂相当于玻璃化法
保存样品的装载液，其作用在于进一步降低
组织含水量，同时增加其保护性物质含量，
提高抗冻能力。
2.3 玻璃化溶液脱水
包埋后的材料投入高浓度冰冻保护剂
中，之后在冰浴条件下处理一定时间。
高浓度的冰冻保护剂(PVS)，又称玻璃
化溶液，可以降低冰点，提高玻璃化消失
点，增强溶液粘滞性，阻止冰晶生长，防
止细胞因脱水而瓦解。水与大分子的亲水位
点形成氢键，维持大分子物质的结构，能减
轻因冰晶形成而产生的电解质浓度增加造成
的伤害(Fukai et al., 1991)。
最常用的植物茎尖PVS是日本北海道国
家农业试验育种部的 Sabai所推出的 PVS2，
其组成是：在MS培养基中附加 0.4 mol.L-1
蔗糖(sucrose, Suc)，30%甘油(glycerine,
Gly)，15%二甲亚砜(DMSO)，15%乙二醇
(EG)。一般在 0 ℃脱水 1.5到 4小时。脱水
时间与温度有关，温度高时，脱水时间要减
少(Matsumoto e t a l . , 1998)。聚乙二醇
(polyethylene glycol, PEG)对细胞无毒性也无
保护作用，但使用PEG+Glucose+DMSO(10:
8:10, V/V)成功地保存了多种植物材料(Reinert
and Bajaj, 1977)。Maruyame(1998)在冻存热
带树 Guazuma crinita Mart.时，将其不定芽
外植体用冰冻保护剂(含 15%Suc，25%Gly，
15%EG，13%DMSO，2%PEG-4000)在25 ℃
时脱水 15~60分钟获得约 80%的存活率。研
究发现，保护剂混合使用比单独使用效果更
好，其优越性在于各种成分之间具有协同效
应和累加效应(毒性不累加)。Bnernard 等
(1979)在冻存甘蔗细胞时以葡萄糖和二甲亚砜
混合(1:3, V/V)作为保护剂，脱水后细胞的存
活率较单独使用葡萄糖(glucose, Glu)或二甲
亚砜的提高了一倍。Chen等(1984)的试验证
明DMSO与山梨醇(sorbitol)混合作为保护剂
更有利于提高长春花悬浮细胞的存活率。马
锋旺等(1999)也发现，以 10%DMSO作为杏
细胞悬浮培养物超低温保存的冰冻保护剂
2412005 吴雪梅等: 包埋玻璃化法超低温保存植物种质的研究进展
时，其相对存活率最低；而采用 10% DMSO
+ 0.5 mol.L-1山梨醇时，相对存活率最高
(20.6%)。臧新等(2002)单独使用DMSO作为
冰冻保护剂时，红豆杉细胞存活率仅为
28.7%，将 10%的 DMSO与 8%的葡萄糖相
混合使用，存活率提高到了 88%。
2.4 保存
玻璃化液处理后，快速将材料直接投入
液氮中保存。
2.5 解冻与恢复培养
冻存的材料在保存终止后，要求快速化
冻，以防止由于次生结冰对组织、细胞造成
的伤害。一般将装有材料的冻存管从液氮中
迅速取出，插入 25~40 ℃水浴中化冻。Hirai
等(1998)将草莓茎尖冻存后迅速放入38 ℃水
浴中(解冻速度约为 200 ℃ min-1)，化冻后
将冻存管中的 PVS2液吸干，装入 1 mL 1.2
mol.L-1蔗糖液放置 10分钟。化冻后包埋的
茎尖比裸露茎尖较耐机械操作，且不需除去
包裹的褐藻酸钙，直接放在基本培养基上进
行恢复培养。
3 冻存效果
3.1 冻存材料的存活率
包埋玻璃化法能同时处理大量材料，而
且恢复生长比包埋脱水法快得多，它减少了
脱水时间，简化了冻存程序。这种方法已成
功地用于辣根(Armoracia rusticana)、山嵛
菜( W a s a b i a j a p o n i c a )、橄榄树( O l e a
europea L.)和梨(Prus communis cv. ‘Beurre
Hardy’)等 20余种植物(表 1)。
包埋玻璃化法比包埋脱水法有更高的成
芽率。Touchell和 Dixson(1995)以木本植物
Grevillea茎尖为冻存材料表明包埋脱水法成
活率仅 32%，而且产生大量愈伤组织后才能
诱导成芽；玻璃化法冻存茎尖不经愈伤组织
直接成芽，且成活率为 70%~80%。Hirai等
(1998)超低温保存草莓时也有相似结果：包
埋玻璃化法冻存的材料一直保持绿色，化冻
后一星期即直接成苗(90%)，高于包埋脱水
法冻存材料的成苗率，而且较之恢复生长更
早。Carlo等(2000)、Shibli和 Al Juboory
(2000)分别以李和橄榄为材比较了包埋玻璃化
法与包埋脱水法两种方法，采用前者冻存的
材料成苗率均高于后者，两种方法成苗率分
别为47.5%/不足10%(李)，64%/48%(橄榄)。
三俞菜茎尖包埋玻璃化法冻存后3 天直接成
芽率为 96%，比包埋脱水法高出 30%，在百
合中也是如此。
但对于某些植物而言，包埋玻璃化法不
一定是最适合的，这可能与基因型有关。
Matsumoto等(1998)试验发现，杂种补血草
茎尖分别用玻璃化法、包埋脱水法、包埋玻
璃化法冻存后成活力基本一致；辣根菜包埋
玻璃化冻存 3 天后，存活率为 60%；用包埋
脱水法保存存活率大于 90%。酸橙的茎尖分
别用包埋玻璃化法和包埋脱水法冻存后，存
活率分为 57%和 93%(Al Ababneh et al. ,
2002)。
3.2 冻存材料的遗传稳定性
超低温保存植物材料从理论上讲，几乎
所有的细胞代谢活动和生长过程都停止进
行，而细胞活力和形态发生的潜能可保存。
从而降低了基因变异的可能性，有利于保持
植物的遗传稳定性。包埋玻璃化法冻存植物
茎尖不经愈伤组织直接成芽，发育成的植株
无形态变异，与不经包埋的玻璃化法所得结
论一致。石思信等(1996)在进行玉米花粉的
超低温保存研究中发现，玉米自交系‘郑
1142’和‘黄早四’的花粉在超低温保存
1~2年后，其后代的田间农艺性状、染色体
数目和结构，过氧化物酶同工酶和酶溶蛋白
质图谱，都没有发现异常。Hirai 和 Sakai
(1999a, 1999b, 2001)及Hirai (2001)以马铃薯腋
芽的分生组织以及草莓、薄荷、百合和中国
薯蓣等的茎尖为材料进行包埋玻璃化法冻存
242 22(2)
表 1 包埋玻璃化法超低温保存植物报道一览表
Table 1 A list of published studies on cryopreservation of plant by encapsulation-vitrification method
种名 外植体 参考文献
香石竹Dianthus caryophyllus L. 顶端分生组织 Tannoury et al., 1991
梧桐Guazuma crinita Mart 不定芽 Maruyama et al., 1998
补血草 Limonium cv ‘Blue Syophonrt’ 顶端分生组织 Matsumoto et al., 1998
桃 Prunus persica 茎尖 Dereuddre et al., 1994
咖啡Coffea Arabica and C. canephora 体细胞胚 Dereuddre et al., 1994
梨 Pyrus communis cv ‘Beurre Hardy’ 茎尖 Dereuddre et al., 1994
李 Prunus domestica L. 茎尖 Carlo et al., 2000
苹果Malus domestica Borkh 茎尖 Paul et al., 2000
苹果Malus pumila cv ‘Golden Delicious’ 茎尖 Dereuddre et al., 1994
百合 Lilium japonicum Thumb 顶端分生组织 Sakai and Matsumoto , 1996
橄榄树Olea europea L. 体细胞胚 Shibli and Al Juboory, 2000
薯蓣Dioscorea nipponica Makino 茎尖 Hirai and Sakai, 2001
草莓 Fragaria×ananassa Duch 茎尖 Hirai et al., 1998
马铃薯 Solanum tuberosum L. 茎尖和腋芽 Hirai and Sakai, 1999a
薄荷Mencha spicata L.. 茎尖 Hirai and Sakai, 1999b
酸橙 Citrus aurantium L. 茎尖 Al Ababneh et al., 2002
枳×橙 Poncirus trifoliate (L.) Raf.× 茎尖 Wang et al., 2002
Citrus sinensis (L.) Osbeck
山嵛菜Wasabia japonica 顶端分生组织 Matsumoto et al., 1995b
葡萄砧木Kober 5BB (Vitis Berlandieri×V. riparia) 茎尖 Benelli et al., 2002
蕉麻Musa textiles Nee 顶端分生组织 Phothipan, 1998
辣根 Armoracia rusticana 芽原基 Phunchindawan et al., 1997
木薯Manihot esculenta 茎尖 Hirai and Sakai, 2001
后，分用 17个和 200个引物对这些材料进行
RAPD分析，其结果与未冻存处理的样品相
同，表明冻存后材料并未发生遗传变异说明
以包埋玻璃法冻存材料的遗传稳定性好。但
是，冻存后材料如果经愈伤组织诱导成苗则
增加了遗传变异的机会(Haskins and Kartha,
1980; Towill, 1984)。
4 总结
综上所述，包埋玻璃化法超低温保存植
物是一种极有前途的种质保存新技术，它为
植物种质资源的保存开辟了广阔的前景。随
着研究工作的深入进行，包埋玻璃化法将在
植物工程中起着越来越重要的作用。但包埋
玻璃化法研究刚刚起步(目前这方面的工作国
内还未展开)，研究工作尚处于探索阶段，对
材料的冻存时间及长期冻存后材料再生的研
究报道较少。有关冻存后遗传稳定性的研究
还不多，需要加强包埋玻璃化法超低温保存
过程中对于遗传变异防止措施的研究以及保
存后对遗传性状的分析。此外，目前保存的
材料多限于茎尖或芽，其应用范围有待于进
一步扩大。今后还需对整个操作过程(驯化，
预培养，脱水时间、程度及再培养等各环节)
2432005 吴雪梅等: 包埋玻璃化法超低温保存植物种质的研究进展
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效果更好的包埋玻璃化途径，为安全保存营
养繁殖性遗传资源提供切实可靠的技术指
导，也为早日建立稀有或濒危植物的种质资
源库奠定基础。
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