全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 516-520, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-12-01; 接受日期: 2007-03-05
基金项目: 中国博士后基金(No. 200503190)和中国热带农业科学院科技基金(No. Rky0523)
* 通讯作者。E-mail: zzl_catas@hotmail.com
.技术与方法.
一种快速、高效的橡胶树胶乳总 RNA提取方法
张治礼*, 杨云, 刘宽灿, 苏火生
中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 热带作物生物技术国家重点实验室, 海口 571101
摘要 胶乳是橡胶树(Hevea brasiliensis)乳管中特殊的细胞质, 主要由橡胶粒子、黄色体、F-W粒子和普通细胞质成分构
成, 其中橡胶粒子占20%-40%, 蛋白含量高达1%-2%。由于高比例橡胶粒子和蛋白质的干扰, 目前使用的胶乳RNA提取方
法都具有步骤繁琐、胶乳需求量大、操作技巧性强不易掌握等缺点。为快速、高效地获取高质量的胶乳RNA, 我们在现有方
法的基础上摸索出一套步骤简单、容易操作、快速、高效提取橡胶树胶乳总RNA的简易方法, 获得了较好的实验效果。紫外
分光光度计、RT-PCR和RACE分析结果表明, 使用该方法提取的胶乳RNA质量完全能够满足相应的分子操作, 但所需时间仅
为目前常用方法的50%, RNA获得率提高了2-3倍, 操作难度大大降低。
关键词 橡胶树, 胶乳, 方法 , RNA提取
张治礼, 杨云, 刘宽灿, 苏火生 (2007). 一种快速、高效的橡胶树胶乳总 RNA提取方法. 植物学通报 24, 516-520.
橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳是橡胶树特有的细
胞质, 除含有普通的细胞器成分外, 还含有橡胶粒子、
黄色体等特有细胞器, 其中蛋白质含量约为1%-2%(诸
杰和朱南康, 2006), 橡胶粒子含量高达20%-40%。高
含量蛋白和橡胶粒子的干扰, 为有效提取高质量胶乳
RNA增加了难度。Kush等(1990)首次报道成功提取了
高质量的胶乳RNA, 同时提出了橡胶树胶乳收集的具体
方法, 目前使用的胶乳RNA提取方法大都是在该方法的
基础上稍加改进而成。用Kush等(1990)的方法提取胶
乳RNA, 从加入提取液到获得RNA整个过程涉及13个
主要步骤, 至少需要14小时; 使用黄贵修等(2002)的方
法, 也涉及10个主要步骤, 至少需要3-4小时。这2种
方法是目前最常用的胶乳RNA提取方法, 都具有步骤烦
琐、用时长、操作技巧性强不易掌握等缺点。
一种高效、成熟的 RNA提取方法应具有操作简
便、用时少、获得率高和提取的 R N A 质量好等特
点。经过多次实验, 我们实验室发展了一种新的、高
效快速的橡胶树胶乳总RNA提取方法, 克服了现有方
法的部分缺点, 为有效开展胶乳分子生物学研究提供
了技术便利。
1 材料与方法
1.1 材料
胶乳采自中国热带农业科学院试验场教学一队, 橡胶树
(Hevea brasiliensis)无性系为热研7-33-97。胶乳收集
参照黄贵修等(2002)提供的方法进行。
1.2 主要试剂
Tris、LiCl、EDTA-Na2、SDS、水饱和酚、氯仿、
异戊醇均购自上海生物工程公司, MMLV反转录试剂盒
为MBI产品, 其余常规试剂均为国产分析纯。
1.3 RNA提取缓冲液配制
将10 mL 1 mol.L-1 Tris-HCl(pH 8.0)、3.75 mL 8 mol.
L-1 LiCl、2 mL 0.5 mol.L-1 EDTA-Na2和50 mL 20%
SDS混和后, 调节pH值至9.5后定容至100 mL即可。
所有溶液都用 DEPC处理水配制。
517张治礼等: 一种快速、高效的橡胶树胶乳总 RNA提取方法
1.4 器皿使用及消毒
所有玻璃器皿均经过180°C高温烘烤8小时以上, 塑料
制品均经 0.1%DEPC溶液浸泡过夜后高压灭菌处理。
1.5 胶乳总RNA提取方法及步骤
① 取3粒(每粒约0.15 mL)颗粒状胶乳(收集胶乳时
因液氮速冻呈颗粒状)加入到一RNase-free 的1.5 mL离
心管中, 然后加入0.5 mL提取液和10 mL b-巯基乙醇,
轻轻摇匀, 室温放置 5分钟。
② 4°C条件下, 16 090×g高速离心 2分钟。
③ 将下层液体转移至另一RNase-free 1.5 mL离心
管中, 加入 5 mol.L-1 NaCl l00 mL后轻轻混匀。
④ 加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1), 轻轻来回
颠倒数次离心管。
⑤ 4°C条件下, 16 090×g高速离心 10分钟。
⑥ 取上清, 重复步骤④-⑤至分界面清亮。
⑦ 取上清, 转移至另一RNase-freer的 1.5 mL离
心管中, 加入 2倍体积无水乙醇, 轻轻混匀后室温放置
1 0 分钟。
⑧ 4°C条件下, 16 090×g高速离心 10分钟。
⑨弃上清, 用 1 mL 75%乙醇洗涤、空气中干燥,
加适量 DEPC处理水溶解即可。
1.6 RNA质量检测
1.6.1 普通琼脂糖凝胶电泳
取2 mL DEPC水溶解的RNA进行1%普通琼脂糖凝胶
电泳检测。
1.6.2 紫外分光光度计分析
取1 mL RNA溶解液稀释至50 mL后进行紫外分光光度
计扫描分析。
1.6.3 应用于 RT-PCR检测
参照MBI公司提供的MMLV反转录试剂盒说明书, 将
mRNA反转录为 cDNA后作为模板。检测基因为橡胶
树 Actin基因和Ubiqution基因。引物由广州英骏公司
合成, 分别为:
Actin:
P1: 5-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3
P2: 5-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3
Ubiquitin:
P1: 5-CAAGATCCAAGACAAGGA-GGGCAT-3
P2: 5-CGGCCTTCTGGTAAACAT-AGGTGAG-3
P C R 反应参照《分子克隆实验指南》(第三版)
(Sambrook and Russell, 2002)进行, 50 mL PCR反应
体系如下: 2 mL cDNA模板, 1 mL dNTP(10 mmol.L-1),
正向和反向引物各1 mL (10 mmol.L-1), 3U Taq DNA聚
合酶, 5 mL PCR buffer(含有15 mmol.L-1 MgCl2)。反
应程序为: 94°C 预变性 3分钟, 94°C变性30秒, 55°C
退火 30秒, 72°C延伸 1分钟, 30个循环后, 72℃再延
伸 10分钟。反应结束后取 5 mL反应液进行 1%琼脂糖
凝胶电泳检测。
1.6.4 应用于RACE技术克隆基因
通过文库筛选 , 我们获得了一个与西洋梨( P y r u s
communis ) ubiqu i t in ex tens ion pro te in 基因
(AF386524)高度同源的橡胶树胶乳EST序列。以此序
列为基础 , 我们设计了 5 G S P 引物 ( 5 -
CGGCCTTCTGGTAAACATAGGTGAG- 3)。参照
Clontech公司 SMARTTM RACE cDNA Amplification
Kit提供的说明书, 以用此方法提取的RNA为模板反转
录cDNA, 利用5-RACE (rapid amplification of cDNA
Ends)技术克隆该基因的5端全长。以此进一步检测用
此新方法提取的 RNA质量。
2 结果与分析
2.1 RNA完整性
利用1%琼脂糖凝胶电泳对本方法提取的胶乳总RNA进
行了分析, 结果表明: 胶乳总 RNA 28S、18S和 5S
rRNA条带完整、清晰, 隐约可见 16S等条带, 没有明
显的降解痕迹, 具有较好的完整性(图 1)。
518 植物学通报 24(4) 2007
2.2 RNA质量及获得率
利用紫外分光光度计分析了总RNA OD值(表1)。结果
显示, 利用本方法提取的胶乳总RNA OD260/OD230值
在2.02-2.42之间、OD260/OD280值在1.94-2.01之
间, 说明所提RNA质量较好, 平均每mL胶乳可以获得
60.0-87.5 mg总RNA, 其中28S、18S和mRNA等RNA
约为20-30 mg, 占所得总RNA的1/3左右, 5S RNA约
占 2 / 3。
2.3 RT-PCR检测
为了进一步检测总RNA质量, 我们应用RT-PCR技术做
了进一步检测。以反转录 cDNA为模板, 利用橡胶树
Actin基因和Ubiqution基因片段的特异性引物P1/P2进
行的扩增结果见图 2。此结果表明, 利用本方法获得的
胶乳总RNA可以满足基因克隆、表达分析等分子生物
学实验的要求。
2.4 应用本方法提取的RNA可以满足RACE技术
操作的要求
根据 1.6.4的操作步骤, 我们获得了图 3的克隆结果。
琼脂糖凝胶电泳及测序分析结果表明, 我们成功获得了
预测基因的 5端序列, 条带单一, 具有较好的特异性。
此结果也表明, 应用本方法提取的RNA具有较好的完整
性, 完全可以满足 RACE技术操作的要求。
3 讨论
本文提供的橡胶树胶乳总 R NA 提取方法和 H an 等
(2000)、黄贵修等(2002)、曾日中等(2003)及邓柳红
图 1 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA质量
1, 2: 示不同上样量的胶乳 RNA
Figure 1 Analysis of 1% Agarose electrophoresis for total
RNA
Different quantity of total RNA showed in lane 1 and 2 from
latex
表 1 利用紫外分光光度计检测胶乳 RNA的OD值及获得率
Table 1 Analysis of quality and quantity of total RNA from
latex
Assay Latex RNA Latex RNA Latex RNA
index sample 1 sample 2 sample 3
OD230 0.077 0.076 0.076
OD260 0.186 0.153 0.155
OD280 0.096 0.079 0.077
OD260/OD230 2.420 2.020 2.040
OD260/OD280 1.940 1.990 2.010
Harvested RNA 87.500 75.190 60.070
from 1 mL latex (mg)
图 2 橡胶树 Actin和 Ubiqution cDNA片段的特异性扩增
1: 650 bp的Actin cDNA片段; 2: 377 bp的Ubiquitin cDNA片段;
M: Marker
Figure 2 RF-PCR amplification of partial fragments of Actin
and Ubiqution cDNAs in Hevea brasiliensis
1: 650 bp fragment of Actin cDNA; 2: 377 bp fragment of
Ubiquitin cDNA; M: Marker
519张治礼等: 一种快速、高效的橡胶树胶乳总 RNA提取方法
等(2005)使用的方法都采用了Kush等(1990)提出的含有
较高浓度SDS的提取液, 但我们在橡胶粒子和蛋白的去
除、RNA沉淀等方面做了较大的改进, 大大降低了操
作难度、简化了提取步骤并缩短了操作时间。
橡胶树胶乳含有较高的蛋白和橡胶粒子, 如何有效
去除蛋白和橡胶粒子是成功提取高质量胶乳RNA的关
键。Kush 等(1990)、黄贵修等(2002)和曾日中等
(2003)提出的方法中, 都是将胶乳加入提取液混匀, 随后
加入酚 : 氯仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1), 将橡胶粒子和蛋白
一同去除。由于胶乳中橡胶粒子和蛋白比例较大, 加入
以上2种物质后, 离心管中的液体变成凝聚在一起的团
状结构, 混匀非常困难, 只有依靠高速离心才能将含有
RNA的液体(约占总体积的1/3)部分分离出来。无法充
分混匀无疑将大大降低RNA的提取效率。本文提出将
去除橡胶粒子和蛋白分开进行的方案, 即先去除橡胶粒
子获得含有 RNA的下层液体, 然后加入酚 : 氯仿 : 异
戊醇去除总蛋白, 可以部分解决这个问题, 这可能是使用
本方法提高了 RNA提取效率的一个主要原因。
在Kush等(1990)和曾日中等(2003)提出的方法中,
分别2次使用8 mol.L-1 LiCl 和1次无水乙醇对RNA进
行沉淀, 黄贵修等(2002)使用了 1次无水乙醇和 1次 4
mol.L-1 LiCl沉淀, 步骤较为繁琐。本文提供的方法仅
使用了 1次 2倍体积无水乙醇沉淀 RNA。过多的沉淀
步骤将大大降低RNA的提取效率, 本方法避免了这种可
能。紫外分光光度计分析结果表明, 利用本文提供的方
法每mL胶乳可以获得 60-88 mg的总RNA, 其中 28S
rRNA、18SrRNA和mRNA约为 20-30 mg, 提取效率
约为黄贵修等(2002)方法的2-3倍, 只用3滴胶乳提取
的总 RNA就可以满足大多数实验的需要(表 1, 2)。减
少沉淀次数可能会降低RNA的纯度。利用本方法提取
的胶乳 RNA OD260/OD230值在 2.0-2.42之间、
OD260/OD280值在1.94-2.01之间, 这表明本方法采
用 1次沉淀步骤获得的胶乳RNA质量完全可以满足大
多数分子生物学实验的要求(表 1, 图 2, 3)。
应用本方法提取胶乳总RNA, 从加入提取液到完成
所有操作仅需 9个步骤、1.5小时, 远远少于 Kush等
(1990)和曾日中等(2003)的方法(超过14小时), 也仅为
黄贵修等(2002)方法的50%; RNA获得率(28S、16S和
mRNA等, 不包括5S RNA)约为黄贵修等(2002)方法的
2-3倍(表 2)。RT-PCR和RACE等分子生物学实验证
实, 使用该方法提取的胶乳RNA质量较好, 完全能够满
足相应的分子生物学实验操作。本方法具有操作简
便、用时少、获得率高和提取的 RNA质量好等特点,
具有较强的实用性和可靠性。
表 2 本方法与其它方法的比较
Table 2 Comparison between Huang’s, Zeng’s and our protocol
Method Consumed time (h) Steps Harvested RNA Main bans
Huang’s(2002) 3-4 10 8.3-9.0 mg from 1 mL latex 2 (28S,18S)
Zeng’s(2003) >14 13 No data 2 (28S,18S)
Method in this paper 1.5 9 20-37.5 mg from 1 mL latex 3 (28S,18S and 5S)
(not including 5S RNA)
图 3 5 RACE产物的琼脂糖凝胶电泳分析
1: 5 RACE产物; M: Marker
Figure 3 Analysis of agarose electrophoresis for 5RACE
product of the cDNA for ubiquitin extension protein
1: 5RACE product; M: Marker
520 植物学通报 24(4) 2007
参考文献
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乳 cDNA 消减文库的构建及其序列分析 . 热带作物学报 24
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(责任编辑: 韩亚琴)
A Rapid and Efficient Protocol for Total RNA Isolation
from Latex of Hevea brasiliensis
Zhili Zhang*, Yun Yang, Kuancan Liu, Huosheng Su
State Key Laboratary for Tropical Crop Biotechnology, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,
CATAS, Haikou 571101, China
Abstract Latex is a special cytoplasm of laticifer in Hevea brasiliensis and is mainly composed of rubber particles, lutoids, F-
W particles and all components of normal cytoplasm; rubber particles take up 20%-40% and total protein 1%-2%. Because of the
high protein and rubber-particle content of latex, methods for total RNA isolation of latex, modified from Kush‘s protocol, contain
problems such as complicated processes, difficult operation and large demand for latex. Here, we describe a rapid and efficient
protocol for total RNA isolation from latex, which cut the process time by 50% and increased the harvest of total RNA by 2-3 times.
Analysis by ultraviolet spectrophotometry and RT-PCR showed the isolated total RNA with good quality for further molecular
experiments.
Key words Hevea brasiliensis, latex, protocol , RNA isolation
Zhang ZL, Yang Y, Liu KC, Su HS (2007). A rapid and efficient protocol for total RNA isolation from latex of Hevea brasiliensis. Chin
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* Author for correspondence. E-mail: zzl_catas@hotmail.com