全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (6): 687-694, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-05-26; 接受日期: 2008-10-11
基金项目: 黑龙江省科技重点攻关项目(No.GB06B303)和黑龙江省国际合作项目(No. WB07N02)
*通讯作者。E-mail: liuguanjun2003@126.com
.实验简报.
西伯利亚蓼谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶基因
在酿酒酵母中的共表达
刘明坤, 刘关君 *, 阎秀峰
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
摘要 谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶在清除活性氧(reactive oxygen species , ROS)中起重要作用。采用0.36 mol.L-1
NaHCO3对西伯利亚蓼(Polygonum sib i ricum)进行胁迫处理, 荧光定量PCR分析表明这2个基因的表达受盐胁迫强烈诱导。
为了分析2个基因是否具有抗盐能力以及其相互协同能力, 从cDNA文库中获得谷胱甘肽转移酶(GST)和半胱氨酸合成酶(CS)
2个基因, 分别将GST、CS和GST+CS转入酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)中, 并分别命名转基因酵母为ty-gst、ty-
cs和ty-gc。在1 mol.L-1 Na2CO3和5 mol.L-1 NaCl胁迫处理下, 转基因酵母(ty-gst、ty-cs和ty-gc)的耐盐能力均明显高于野
生型酵母(wy), 而三者之间并无显著差别。在0.4 mol.L-1 NaCl胁迫处理下, 转基因酵母( ty-gst、ty-cs和ty-gc)的抗氧化酶类
相关基因SOD1、SOD2、GPX1和GPX3的表达量均低于野生型酵母(对照)(wy), 而CTA1表达量均高于野生型酵母(对照)
(wy)。转基因酵母ty-cs在0.4 mol.L-1 NaCl胁迫处理前后其超氧化物歧化酶(s uperoxide dism utas e, SOD)、过氧化氢酶
(cata las e, CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶 (glu tathione peroxidas e, GPX)的活性均表现为最高。
关键词 半胱氨酸合成酶, 谷胱甘肽硫转移酶, 活性氧, 酿酒酵母, 盐胁迫
刘明坤 , 刘关君 , 阎秀峰 (2008) . 西伯利亚蓼谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶基因在酿酒酵母中的共表达. 植物学通报 25, 687-694.
酵母和植物一样, 在新陈代谢和氧化胁迫时能够产
生活性氧(reactive oxygen species, ROS), 如超氧阴离
子自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH-)等。
这些活性氧可以损伤细胞内大分子物质(如脂类、蛋白
质和DNA), 从而引起细胞结构和功能的破坏, 甚至造成
细胞死亡。酵母体内清除活性氧的机制可分为两类: 酶
促抗氧化系统与非酶促抗氧化系统。酶促系统包括超
氧化物歧化酶(superox ide dismutase, SOD)、谷胱甘
肽转移酶(glutathione transferases, GST)和过氧化氢酶
(c ata las e, CAT)等。非酶促抗氧化系统由谷胱甘肽
(GSH)和维生素等组成(Jaleel et al., 2007)。
在酿酒酵母中ROS和与之相关的防御系统已经得
到了广泛的研究(Cozat et al. , 2005)。酶促系统中的
GST是编码多功能蛋白的一个超基因家族, 其在保护组
织抗氧化胁迫中起重要作用, GST通过催化还原型谷胱
甘肽(GSH)淬灭活性氧分子(如氢过氧化物), 使细胞免受
氧化损伤。在酵母中表达番茄的GST可以抑制Bax(哺
乳动物促凋亡蛋白)引起的细胞死亡, 增强酵母对H2O2
诱导胁迫的抗性(Kanpranis et al., 2000)。
GSH是非酶促抗氧化系统中重要的抗氧化物质, 其
合成受半胱氨酸强烈调节(Strohm et al.,1995)。Noji
等(2001)研究表明, 半胱氨酸合成酶(CS)作为半胱氨酸
(Cys)合成的限速酶, 其过量表达能够增加半胱氨酸的含
量, 进而增加 GSH在体内的含量, 使其在清除细胞内
ROS中起重要作用。Barroso等(1999)研究表明, 拟南
芥(Arabidops is thaliana)半胱氨酸合成酶在盐胁迫下受
到显著诱导, 而在酵母中过量表达此基因, 可使酵母在高
浓度 NaCl 下正常生长(Romero et al. , 2001)。
GST发挥作用依赖于其底物 GSH, GSH的合成受
到Cys的调节, CS是Cys合成的限速酶, 而GST和CS
在逆境中是否具有协同作用尚未见报道。本实验室从
西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum)的cDNA文库中获得
688 植物学通报 25(6) 2008
GS T 和 CS 基因, 并将G ST 单基因、CS 单基因和
GST+CS 双基因转入酿酒酵母中, 通过对抗氧化酶类
(CAT、SOD和GPX)活性的测定及相应基因表达的定
量分析, 并观察盐胁迫下酵母的表型变化, 比较单、双
价基因转化子在盐胁迫下的抗逆能力, 为研究GST 和
CS 基因的相互作用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)采自黑龙江省
肇东盐碱地。取西伯利亚蓼地下茎段为繁殖材料, 用腐
殖质和细砂混合物(v:v=3:1)作为培养基质, 温室内培养1
个月。待苗高 10-15 cm时, 用0.36 mol.L-1 NaHCO3
对西伯利亚蓼进行胁迫处理, 浇灌 3 天。处理结束后分
别选取处理 0、1、2 和 3 天的叶、茎和地下茎立即放
入液氮中, 于-70°C 下保存备用。
1.2 RNA提取及GST和CS基因的实时定量PCR
分析
按照 SDS/苯酚法(王玉成等, 2003)提取西伯利亚蓼叶、
茎和地下茎中的总 R N A 。为了分析西伯利亚蓼在
NaHCO3胁迫下GST 和 CS 的表达情况, 根据GST 和
CS的 cDNA序列合成引物, 以西伯利亚蓼 18S rRNA-1
基因作为内参(引物序列见表 1 ), 对西伯利亚蓼的叶、
茎和地下茎的G S T 和 CS 表达量在 DNA E ng i ne
OpticonTM2实时定量PCR仪上进行RT-PCR分析。20
mL的 PCR反应体系中含有 3 mL的第一链 cDNA、10
mL的 SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、1 mL GST-S (或
CYC-S )(10 pmol)引物、1 mL GST-A (或 CYC-A )(10
pmol)引物和 5 mL去离子水。PCR反应条件为94°C 30
秒, 94°C 12秒, 58°C 30秒, 72°C 40秒, 45个循环。
读板温度 81°C。采用常用的 2-△△ Ct 法(L ivak and
Schmit tgen, 2001)对数据进行分析。
1.3 菌株与试剂
大肠杆菌 Top10为本实验室保存。酿酒酵母尿嘧啶营
养缺陷型 INVSc1及质粒 pYES2购自 Invitrogen公司。
PCR引物合成及测序由大连宝生物工程公司完成。限
制性内切酶和 T4 DNA 连接酶购自大连宝生物工程公
司。Y NB 购自 B ebco 公司。酵母提取物与胰蛋白胨
购自O XO ID 公司。其它试剂均为国产分析纯。Y P D
和 SC-U培养基的组分和酿酒酵母感受态细胞的制备及
转化方法见 Invit rogen公司操作手册。
1.4 酵母单、双价表达载体的构建
G ST (G enB ank : E U597480 )和 CS (G enB ank :
E U597481)均来自西伯利亚蓼 c DNA 文库。分别以
GST-S、GST-A、CYC-S 和 CYC-A 为引物(表 2)进
行 PCR扩增。用限制性内切酶KpnI和 HindIII 双酶切
回收产物GST及质粒 pYES2。双酶切后回收目的片段
并连接, 转化大肠杆菌 Top10感受态, 提取转化子质粒
表 1 RT-PCR所用引物
Table 1 Primers used for RT-PCR
Gene Pr imer sequences (5-3)
Forw ard primer Reverse primer
18S rRNA-1 GTATGGTCGCAA GGTGAA AC TTAGCAGGCTGA GGTCTCGT
GST AGTAATGTTGTATGGAATGTGGGC TTCGGCTATGGGTTTGTCGT
CS GTCGGGTCCTCTTCGCTCAC GCA GCAGGGCTCCATAA TCT
18S rRNA-2 AGGAA TTGACGGAAGGGCAC GCA CATCTAAGGGCATCACA
SOD1 ATCCGAGCCAA CCA CTGTC CGACGCTTCTGCCTACA AC
SOD2 CGAGCAGTTTGGCA GTCTG GTGTTCCCAGGCGTCAA TG
CTA1 ATCTGCGGGTCTGCTA TG GTTGGTTTGTGGGTTTCTC
GPX1 ATCCA TTCCCCTTCA ACTCC TCCAGACTTCCCGCTTAC
GPX3 TA AAGGGA AA AGTGGTGC TTCATAA TGGGGAAAGTCA
689刘明坤等: 西伯利亚蓼谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶基因在酿酒酵母中的共表达
进行酶切和 PCR鉴定, 得到酵母单价表达载体 pYES2-
GST(图 1A)。用限制性内切酶 SphI和 EcoRI双酶切回
收产物CS 及质粒 pYES2。双酶切后回收目的片段并
连接, 转化大肠杆菌 Top10感受态, 提取转化子质粒进
行酶切和PCR鉴定, 得到酵母单价表达载体pYES2-CS
(图 1B)。以 pYES2质粒为模板, 分别以 PGAL1-S1、
PGAL1-A1、CYC1-S1和 CYC1-A1为引物(表 2)进行
PCR扩增, 得到的 PGAL1和 CYC1两个片段分别通过
T4DNA连接酶连接到pMD18-T载体上, 得到pMD18-T-
PC。用 BamHI和 EcoRI双酶切 pMD18-T-PC和质粒
pYES2, 双酶切后回收目的片段并连接, 获得中间表达
载体pYES2-PC(图1C)。SphI和EcoRI双酶切pYES2-
P C 和 C S , 双酶切后回收目的片段并连接, 得到
pYES2-PC-CS。用 KpnI酶切 pYES2-PC-CS 和GST,
连接获得酵母双价表达载体 pYES2-GST-CS (图 1D)。
1.5 转基因酵母的耐盐性分析
将质粒 pYES2-GST、pYES2-CS 和 pYES2-GST-CS
转入酿酒酵母中, 分别命名为 ty-gs t、ty-cs 和 ty-gc。
在无菌条件下, 分别挑取 ty-gs t、ty-cs、ty-gc 和 wy
(野生型)酵母接种于 SC-U液体选择培养基中, 在30°C,
每分钟 200转振荡培养 24 小时, 测定其OD600值。 计
算出所需的菌液量, 使 20 mL的诱导培养基中, 菌液的
OD600值为 0.4, 30°C诱导表达 30小时。取 100 mL诱
导的酵母菌液, 离心 10秒, 弃上清, 菌体分别重悬于 1
mL的1 mol.L-1 Na2CO3和5 mol.L-1 NaCl中, 放置于
30°C下进行胁迫处理。胁迫后, 用无菌水重悬菌体, 涂
布于 SC-U固体培养基上(以 2% 葡萄糖为碳源)。以未
受胁迫的 ty -gs t、ty -c s、ty -gc 和 wy 酵母作为对照,
30°C下培养直至长出单菌落, 照相并记录结果。
1.6 转基因酵母抗氧化酶类相关基因的定量RT-
PCR分析及相应酶活性检测
将 3 个酿酒酵母转化子接种到 S C- U 筛选培养液中,
30°C过夜振荡培养, 离心收集菌体。将菌体接种到半
乳糖诱导培养液中, 使其初始OD600值为 0.4。30°C培
养 48小时后, 将其分成2份, 1份为对照, 另1份放入含
0.4 mol.L-1 NaCl的诱导培养基中, 胁迫处理 30分钟。
5 000 ×g 4°C下离心收集菌体, 菌体经液氮冷冻研磨后
取一半提取RNA , 用于抗氧化酶类相关基因(SO D1、
SOD2、CTA1、GPX1和GPX3)的定量RT-P CR分
析(引物序列见表1), 以酵母18S rRNA-2基因为内参, 具
体过程见 1.2节; 另一半转入 50 mmol.L-1磷酸缓冲液
(pH7.4)中悬浮, 经 15 000 ×g 4°C下离心 20分钟, 上
清液即为酶粗提液。粗提液蛋白含量的测定采用
Brad ford(1976)的方法。SO D酶活性测定采用氮蓝
四唑(n it ro blue tet raz ol ium , NBT)光化学抑制法
(Stewar t and Bewley, 1980)。CA T活性测定采用
Ahmad等(2000 )的方法。G PX活性测定参考 Rong
等(1994)的方法。
2 结果与讨论
2.1 GST和CS表达的荧光定量RT-PCR分析
为了分析GST和CS在西伯利亚蓼中对盐胁迫的转录应
答, 在 0.36 mol.L-1 NaHCO3胁迫处理 3天后进行定量
表 2 酵母表达载体构建所用引物
Table 2 Primers used f or construction of yeast expression vector
Gene Names Pr imer sequences (5-3) Restriction enzyme cutting site
GST GST-S CCAAGCTTACCATGGCAACCACCATAGA CAGAG Hi ndIII
GST-A GGGGTACCTCACTTCTTCCCGA AGGCCTTGA AG KpnI
CS CYC-S CA TGCATGCACAATGGCGTCTCTGGTCA ACTTC SphI
CYC-A CCGGA ATTCTCAAA CCTCGGGTTGCA TTTTTTCG EcoRI
PGAL1 PGAL1-S1 ACGGA TTA GAA GCCGCCGA GCGGGTGACAG
PGAL1-A1 CCGGA ATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA EcoRI
CYC1 CYC1-S1 CGCGGATCCATCATGTA ATTA GTTATGTCA CG BamHI
CYC1-A1 TGCTCTAGAAGCTTGCA AATTAA AGCCTTCG Xb aI
690 植物学通报 25(6) 2008
RT-PCR分析, 结果显示GST和CS 在叶、茎和地下茎
中受到强烈诱导表达(图 2)。GST 和 CS 在叶和地下茎
中最大表达量出现在第 2天。在茎中 CS 最大表达量也
是在第2天出现, 而GST最大表达量则出现在处理后第
3天。本实验结果与 Barroso 等(1999)对拟南芥半胱氨
酸合成酶在盐诱导下的研究结果相一致。
在盐胁迫下植物会受到氧化胁迫损伤, 活性氧迅速
合成, 植物需要加速抗氧化胁迫物质的生成。半胱氨酸
是合成谷胱甘肽的重要前体物之一, 在高浓度盐胁迫时
植物需要合成大量的半胱氨酸和其它硫代谢物(如GSH)
图 2 NaHCO3 (0.36 mol.L-1 )胁迫下GST和CS在西伯利亚蓼
叶、茎和地下茎中的表达
Figur e 2 A nalysis of the expression of GST and CS gene in
leaf, stem and underground stem of Polygonum sib iri cum un-
der 0.36 mol.L-1 NaHCO3 s tress
图 1 重组质粒pY ES2-GST、pY ES2-CS和 pYES2-GST -CS
的构建
(A) 单价表达载体pYES2-GST ; (B) 单价表达载体 pY ES2-CS;
(C) 中间表达载体pYES2-PC; (D) 双价表达载体 pY ES2-GST -
CS
Figur e 1 Cons truc tion of three recombinant plasmids pYES2-
GST, pYES2-CS and pYES2-GST-CS
(A) Plasmid pY ES2-GST; (B) Plasmid pY ES2-CS; (C) Interme-
diate plasmid pYES2-PC; (D) Plasmid pYES2-GST-CS
691刘明坤等: 西伯利亚蓼谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶基因在酿酒酵母中的共表达
图 4 转基因酵母在Na2CO3和NaCl胁迫下的生长
(A) 未经胁迫处理的酵母; (B) 1 mol.L-1 Na2CO3胁迫处理4小时;
(C) 1 mol.L-1 Na2CO3胁迫处理12小时; (D) 1 mol.L-1 Na2CO3胁
迫处理 24小时; (E) 5 mol.L-1 NaCl 胁迫处理 24小时; (F) 5 mol.
L-1NaCl 胁迫处理 48小时
Figure 4 Phenomenon of yeas t cells transformed w ith GST
and CS under Na2CO3 and NaCl stresses
(A) Yeast cells w ithout s tress treatment; (B) Y east cells incu-
bated in 1 mol.L-1 Na2CO3 f or 4 h; (C) Y eas t cells incubated in
1 mol.L-1 Na2CO3 for 12 h; (D) Yeast cells incubated in 1 mol.L-1
Na2CO3 f or 24 h; (E) Y east cells incubated in 5 mol.L-1 NaCl f or
24 h; (F) Y eas t cells incubated in 5 mol.L-1 NaCl for 48 h
图 3 双价表达载体 pY ES2-GST-CS的酶切及PCR鉴定
M: DL2000标记; 1: SphI 和EcoRI双酶切; 2: KpnI单酶切; 3: 用引
物CYC-S 和CYC-A 对质粒 pY ES2-GST-CS进行PCR扩增的产
物; 4: 用引物GST-S 和GST-A对质粒pY ES2-GST-CS进行PCR
扩增的产物
Figure 3 Enzyme digestion and PCR products of plasmid
pY ES2-GST-CS
M: DL2000 marker; 1: SphI and EcoRI double digestion; 2: KpnI
single digestion; 3: PCR by primers CYC-S and CYC-A; 4: PCR
by pr imers GST-S and GST-A
来保护植物以适应和抵抗Na +浓度的升高。GST作用
的发挥依赖于底物 GSH, 大量GSH能够刺激GST活性
增高, 从而催化还原型GSH淬灭活性氧分子, 使细胞免
受氧化损伤。因此, 在盐胁迫下植物GST 和 CS 的表
达量均提高。
2.2 双价酵母表达质粒pYES2-GST-CS的构建
分别使用引物CYC-S、CYC-A、GST-S 和GST-A 对
质粒 pYES2-GST-CS 进行 PCR扩增, 可以得到GST
和 CS 的目的片段, 实验结果(图 3)与预期一致。分别用
SphI和 EcoRI双酶切质粒 pYES2-GST-CS , 能够得到
目的片段 CS; KpnI 酶切质粒pYES2-GST-CS , 能够得
到目的片段 GS T(图 3)。因此说明双价酵母表达质粒
pYES2-GST-CS 构建成功。
本实验构建的酵母中间表达载体 pYES2-PC具有2
个独立的启动子和终止子完整表达框(图 1C), 在此基础
上只需分别连入 2个基因, 就能构建酵母双价表达载
体。因此这是一种快速、高效构建酵母双价表达载体
的方法, 并且此中间载体为研究 2个基因的相互作用奠
定了基础。
2.3 转基因酵母耐盐性分析
如图 4所示, 在正常条件下, 转基因酵母(ty-gst、ty-cs
和 ty-gc)和对照酵母(wy)的存活率都很高, 而在1 mol.L-1
Na2CO3胁迫处理 4小时后, 对照酵母 (wy)的存活率稍
低于转基因酵母(ty-gs t、ty-cs和 ty-gc)。在 1 mol.L-1
Na2CO3胁迫处理 12小时后, 对照酵母(wy)的存活率为
0, 而转基因酵母依然有一部分存活。在同样胁迫处理
24小时后, 转基因酵母仍有个别菌株存活。另外, 采用
5 mol.L-1 NaCl胁迫24小时后, 对照酵母(wy)的存活率
显著低于转基因酵母(ty-gst、ty-cs 和 ty-gc )。在 NaCl
胁迫 48小时后对照酵母(wy)的存活率为 0, 而转基因酵
母依然有一部分存活。但是在盐胁迫后, 转基因酵母间
的耐盐胁迫能力并无明显差异。说明在半乳糖的诱导
692 植物学通报 25(6) 2008
下, GST 和 CS 均赋予了转基因酵母(ty-gst、ty-cs 和
ty-gc )菌株抗 Na2CO3和 NaCl 胁迫的能力。
2.4 转基因酵母抗氧化酶类相关基因的定量RT-
PCR分析
盐胁迫能够产生大量的活性氧(ROS), 为了防御氧自由基
造成的损伤和破坏, 植物在组织和细胞中建立和形成了
一整套抗氧化防御体系, 如酶系统的超氧化物歧化酶
(S O D)、过氧化氢酶(C A T )和谷胱甘肽过氧化物酶
(GPX)等。SOD和 CAT的共同作用能有效消除植物体
内过量的氧自由基。首先 SOD催化超氧化物自由基歧
化为氧和过氧化氢, 然后过氧化氢酶催化过氧化氢还原
为氧和水。酿酒酵母中主要包括 2类 SOD: 细胞质Cu/
Zn-SOD(SOD1)和线粒体Mn-SOD(SOD2)。GPX在酵
图 5 NaCl (0.4 mol.L-1)胁迫处理后酵母抗氧化酶类相关基因SOD1 (A)、GPX1 (B)、SOD2 (C)、GPX3 (D)和CTA1 (E)表达的荧
光定量RT-PCR分析及抗氧化酶类SOD (F)、GPX (G)和CAT (H)的活性检测
Figur e 5 RT-PCR quantitative analys is of relative expression of yeast antiox idative enzyme genes SOD1 (A), GPX1 (B), SOD2
(C), GPX3 (D) and CTA1 (E) and detec tion activity of SOD (F), GPX (G) and CA T (H) in transgenic yeas t under 0.4 mol.L-1 NaCl
stress
693刘明坤等: 西伯利亚蓼谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶基因在酿酒酵母中的共表达
母中有 3个编码基因, 即GPX1、GPX2和 GPX3, 其
中G P X3 主要调节抗氧化胁迫反应相关基因的表达
(Delaunay et al. , 2002)。而GPX1和GPX2则有助于
提高酵母对金属毒性的抗性(Avery et al. , 2004; Basu
et al. , 2004)。如图 5所示, 用 0.4 mol.L-1 NaCl 胁迫
处理酵母前后, SOD1、SOD2、GPX1和GPX3的表
达模式相同。在未受胁迫时, SOD1、SOD2、GP X1
和GPX3的表达量表现为 ty-cs>wy>ty-gc>ty-gs t, 而用
0.4 mol.L-1 NaCl胁迫处理30分钟后, 它们的表达量则
表现为 wy>ty-gst>ty-cs>ty-gc。相应的 SOD和GPX
酶活性在胁迫前也表现为 ty-cs>wy>ty-gc>ty-gs t, 但胁
迫后则表现为 ty-cs>ty-gst>wy>ty-gc。在酵母中含有
2种过氧化氢酶(CAT), 分别为定位于过氧化物酶体上的
CTA1和细胞溶质中的 CTT1。CTA1主要与氢过氧化物
去毒作用有关(Hiltunen et al. , 2003)。用 0.4 mol.L-1
NaCl胁迫后转基因酵母(ty-gst、ty-cs 和 ty-gc )和对照
酵母(wy)的 CTA1表达量均有所增加(图5), 并表现为 ty-
cs>ty-gc>ty-gs t>wy, 并且相对应的CAT活性也表现为
同样的趋势, 说明高表达 CTA1对于酵母耐盐能力的提
高有一定的作用。
关于酿酒酵母 S O D 已经得到了广泛研究。酵母
SOD1的表达主要受氧和 ROS的产物(如 H2O2等)所诱
导。而 SOD2在热、氧化和渗透胁迫处理后表达量上
调(Jami eson, 1998)。本实验中转基因酵母(ty-gs t、
ty-cs和 ty-gc )的 SOD1和 SOD2在盐胁迫处理后的表
达量不仅没有上调反而均低于对照水平, 可能是由于半
胱氨酸合成酶和谷胱甘肽转移酶基因表达产物参与了谷
胱甘肽的代谢调节。在酵母中过量表达GST 和 CS 会
抑制内源SOD基因的表达, 而转基因酵母(ty-gst、ty-
cs和ty-gc)在盐胁迫后的存活率明显高于对照很可能是
由于酵母表达这 2个基因的产物赋予了其抗盐性。在酿
酒酵母中过氧化氢(H2O2)的清除机制主要分为2种途径:
一种是过氧化氢在过氧化氢酶(CAT)的作用下分解为水
和氧气; 另一种是在谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的作用
下, 2个谷胱甘肽(GSH)与过氧化氢反应生成氧化型谷胱
甘肽(GSSG), 后者在谷胱甘肽还原酶的作用下得以还
原, 正常细胞一般具有较高的GSH/GSSG比值。酿酒
酵母主要是通过第一种途径分解过氧化氢 (赵保路,
1999)。本实验中GPX1和GPX3的定量 PCR分析结
果表明, 在 NaCl 胁迫处理后, 转基因酵母(ty-gs t、ty-
cs和 ty-gc)的GPX1和GPX3表达量显著低于对照, 而
它们的CTA1表达量却均高于对照; CAT的活性也显著
高于对照。这进一步证明, 在盐胁迫处理后酵母中的过
氧化氢(H2O2)是在过氧化氢酶(CAT)的催化下分解的。
参考文献
王玉成 , 薄海侠 , 杨传平 (2003) . 胡杨、柽柳总RNA提取方法的
建立. 东北林业大学学报 31, 99-100.
赵保路 (1999). 氧自由基和天然抗氧化剂. 北京: 科学出版社. pp.
1-20.
Ahm ad I, Hamid T, Fatima M, Chand HS, Jain SK, Athar M,
Raisuddin S (2000). Induction of hepatic antioxidants in fresh-
w ater catf ish (Channa punctatus Bloch) is a biomarker of
paper mill eff luent exposure. Biochim Biophys Acta 1523, 37-
48.
Avery AM, Willetts SA, Avery SV (2004). Genetic dissection of
the phospholipid hydroperoxidase activity of yeast GPX3 re-
veals its functional impor tance. J Bi ol Chem 279, 46652-
46658.
Barroso C, Romero LC, Cejudo FJ, Vega JM, Gotor C (1999).
Salt-specif ic regulation of the cytosolic O-acetylserine (thiol)
lyase gene from Arabidopsis thal iana is dependent on absci-
sic acid. Plant Mol Biol 40, 729-736.
Bas u U, Southron JL, Stephe ns JL, Taylor GJ (2004) . Re-
verse genetic analysis of the glutathione metabolic pathw ay
suggests a novel role of PHGPX and URE2 genes in alu-
minium resistance in Saccharomyces cerevisi ae. Mol Genet
Genomics 271, 627-637.
Br adford MM (1976) . A rapid and sensitive method f or the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the prin-
ciple of protein-dye binding. Anal Bi ochem 72, 248-254.
Cozat l DM, Tavera HL, Navarro AH, Sanche z RM (2005) . Sul-
fur assimilation and glutathione metabolism under cadmium
stress in yeast, protists and plants. FEMS Microbiol Rev 29,
653-671.
Delaunay A, Pf lieger D, Barrault MB, Vinh J, Toledano MB
(2002). A thiol perox idase is an H2O2 receptor and redox-
transducer in gene activation. Cell 111, 471-481.
Hiltune n JK, Mur sula AM, Rottenste iner H, Wiere nga RK,
694 植物学通报 25(6) 2008
Kastaniotis AJ, Gurvitz A (2003) . The biochemistry of per-
ox isomal beta-ox idation in the yeast Saccharomyces
cerevi siae. FEMS Microbiol Rev 27, 35-64.
Jalee l CA, Gopi R, Manivannan P, Panneerselvam R (2007).
A ntioxidative potentials as a protective mechanism in
Catharanthus roseus (L.) G. Don. plants under salinity stress.
Turk J Bot 31, 245-251.
Jamieson DJ (1998). Oxidative stress responses of the yeast
Saccharomyces cerevis iae. Yeast 14, 1511-1527.
Kanpranis SC, Damianova R, Atallah M (2000). A novel plant
glutathione S-transferase/peroxidase suppresses Bax lethal-
ity in yeas t. J Biol Chem 275, 29207-29216.
Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analys is of relative gene ex-
press ion data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct
method. Methods 25, 402-408.
Noji M, Saito M, Nakamura M , Aono M, Saji H, Saito K (2001).
Cysteine synthase overexpression in tobacco confers toler-
ance to sulfur-containing environment pollutants. Plant Physiol
126, 973-980.
Romero LC, Dominguez-Solis JR, Gutierr ez-Alcala G, Gotor
C (2001) . Salt regulation of O-acety lser ine( thiol) lyase in
Arabidopsis thal iana and increased tolerance in yeast. Pl ant
Phys iol Biochem 39, 643-647.
Rong ZX, Liu HZ, Bao JQ, Cheng HZ, Sun YY, Sun T (1994).
Measurement of glutathione peroxidase activity in the w hole
blood of mice. Prog Biochem Biophys 21, 362-366.
Stew art RC, Bewley JD (1980). Lipid peroxidation associated
w ith accelerated aging of soybean axes . Plant Phys iol 65,
245-248.
Strohm M, Jouanin L, Kunert KJ, Pruvost C, Polle A, Foyer
CH, Rennenber g H (1995). Regulation of glutathione synthe-
sis in leaves of transgenic poplar (Populus tremula x P. alba)
overexpressing glutathione synthetase. Plant J 7, 141-
145.
Co-expression of Polygonum sibiricum Glutathione Transferase and
Cysteine Synthase Genes in Saccharomyces cerevisiae
Mingkun Liu, Guanjun Liu*, Xiufeng Yan
Th e L aborato ry of Fore st Gen eti cs a nd Bre edi ng a nd Bio technol ogy of Mi nistry of Edu cat ion, No rth east Fo restry Un iversit y,
Ha rbi n 1 5004 0, Chi na
Abstr act Glutathione transf erase (GST) and cysteine synthase (CS) play an important role in plant elimination of active oxygen
(reac tive oxygen spec ies , ROS). RT-PCR analysis of GST and CS in Polygonum s ibir icum Laxm. show ed remarkable change in
expression induced by 3% NaHCO3 stress. We trans f ormed GST , CS and t he GST+ CS comb ination in to yeas t cells
(Saccharomyces cerevi siae), des ignated transgenic yeast (ty) ty-gs t, ty-cs and ty-gc. The surv ival rate of ty-gs t, ty-cs and ty-gc
w as higher than that of w ild-type yeast (wy) under 1 mol.L-1 Na2CO3 and 5 mol.L-1 NaCl stress, w ith essentially no difference in
rate betw een the three tys. With 0.4 mol.L-1 NaCl, the activ ity of superoxide dismutase 1 (SOD1), SOD2, glutathione peroxidase 1
(GPX1) and GPX3 w ere low er and that of catalase 1 (CTA1) higher in ty than in wy. How ever, the activity of the ty-cs SOD, CAT
and GPX show ed the highes t w ith 0.4 mol.L-1 NaCl stress.
Ke y w ords cyste ine syntha se, gl uta thio ne tra nsferase, rea ctive o xyg en species, Saccharomyces cerevi sia e, sal t stre ss
Liu M K, Liu GJ, Ya n XF (2008 ). Co-expre ssio n of Po lygo num sibi ricu m g luta thio ne t ran sferase and cystein e synth ase gene s in Saccha-
ro myces cerevi sia e. Ch in Bull Bo t 25 , 68 7-69 4.
(责任编辑: 白羽红)
* Author for correspondence. E-mail: liuguanjun2003@126.com