全 文 ：第 !" 卷第 # 期
!$$" 年 # 月
生 态 学 报
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基金项目：国家自然科学基金资助项目（5$!"$6#7）；北京市生态学重点学科资助项目（896$$6#::$）
收稿日期：!$$;<$=<$5；修订日期：!$$"<$5作者简介：高玉红（6#"6 >），女，河北唐山人，博士，主要从事生态毒理和畜牧生态研究2 (’通讯作者 &0II3E40JKAJB @LMD0I2 (/)0.1-",). ,"’2：’D3 4I0N3HM O@E PAJ@JHA@11C EL440IM3K QC .@MA0J@1 .@MLI@1 -HA3JH3 R0LJK@MA0J 0P &DAJ@ （.02 5$!"$6#7）；(?4D@E3E -LQN3HM 0P S3ANAJB
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阿苯哒唑对蚯蚓（!"#$%"& ’$(")&）酸性磷酸酶、
谷胱甘肽硫转移酶及腺三磷酶活性的影响
高玉红6，!，孙振钧6，’，孙新胜5，包永占!，李玉荣!
（62中国农业大学资源环境学院，北京Y 6$$$#:；!2 河北农业大学动物科技学院，保定Y $"6$$6；
52 河北农业大学信息与技术学院，保定Y $"6$$6）
摘要：研究了蚯蚓在染毒 !，"K和 6:K时，兽药阿苯哒唑（6$$ > ;$$ ?B Z [B）对蚯蚓体及其不同部位的酸性磷酸酶（%V）、谷胱甘
肽硫转移酶（+-’）、腺三磷酶（&@! \ <%’V@E3）活性的影响。结果表明，阿苯哒唑对蚯蚓 5 种酶的活性均有显著影响，其中对 %V
和 +-’活性的影响比对 &@! \ <%’V@E3的大。该药对 %V和 +-’活性的抑制作用均随染毒时间的延长而加强，染毒浓度和时间
表现出显著的互作效应。另外，%V 活性也显著受到染毒浓度与蚯蚓部位的互作影响，影响最大的部位是蚯蚓前部；该药对
&@! \ <%’V@E3活性的影响相对较小，浓度、时间和部位没有表现出明显的互作效应。
关键词：蚯蚓；阿苯哒唑；酸性磷酸酶；谷胱甘肽硫转移酶；腺三磷酶
文章编号：6$$$<$#55（!$$"）$#<5#6;<$"Y 中图分类号：]#7=；86"62 7Y 文献标识码：%
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GA-来，为了保障动物的健康，抗菌类及抗寄生虫兽药的使用量和使用种类越来越多。兽药大量或不合
理的使用不仅引发了动物性食品药物残留问题，而且当药物进入机体后，其原形或代谢物将随动物的排泄物
进入周围环境，对环境微生物和动物等非靶生物也产生直接或间接的影响。目前，国外对兽药的生态风险评
价非常重视，对兽药在环境中的吸收、分布、转归及其对生态系统影响的研究也越来越多［@，G］。国内对兽药的
生态风险评价刚起步，相关研究较少［F］。
阿苯哒唑是一类近年来发展非常迅速、应用广泛的有效抗线虫、绦虫、吸虫和囊尾蚴等寄生虫的药物。它
主要抑制虫体内氧化代谢途径，减少 9H:生成，干扰虫体的生长和繁殖［C］。研究表明，阿苯哒唑进入体内后，
一部分原药或其代谢物随着粪尿排出体外，猪囊尾蚴病患者口服阿苯哒唑后，大约有 @@?以原药的形式随粪
便排出，并且在尿液和粪便中均已检测到其代谢物（阿苯哒唑亚砜和阿苯哒唑砜）［N］，这两种代谢物是抗寄生
虫的有效成分，排到体外的这些药物对土壤动物可能会产生潜在的毒害作用，但目前还未发现这方面的报道。
蚯蚓是评价土壤环境安全性的指示生物，因此，研究兽药对蚯蚓的毒性，对评价兽药的生态风险评价有重
要意义。目前，兽药对蚯蚓毒理的研究主要集中在普通的急慢性毒性实验［E，=］，这些实验在某种程度上有一
定的应用价值，但它指示的只是环境污染的终点，而且急慢性毒性实验比较耗时。而药物代谢酶能够对早期
的化学污染做出及时快速的反应，目前药物代谢酶的活性已经被用作检测水生生态环境污染的分子标
志物［>，L］。
本实验以蚯蚓作为对象，研究阿苯哒唑对酸性磷酸酶（9:），谷胱甘肽硫转移酶（OMH）和腺三磷酶（J-G K D
9H:-1’）活性的影响。由于化学污染物对蚯蚓的影响与蚯蚓的不同部位有关，因此，本实验选择整个蚯蚓体
以及其前部、中部和后部作为检测对象，探索该药对蚯蚓的毒性效应。
)* 材料和方法
)& )* 实验材料
选用 FAA P CAA 7+健康成年蚯蚓（!"#$%"& ’$(")&），蚯蚓来自中国农大蚯蚓养殖基地。实验药品选用阿苯
哒唑原粉，纯度 LN?以上，购自 M,+7-公司。
)& +* 染毒方法
实验设 @ 个对照，C 个处理（@AA，GAA，CAA，EAA 7+ $ B+），每个处理为 @G 个重复，每个重复 @G 条蚯蚓。无药
物污染的牛粪作为蚯蚓饵料和生活基质。蚯蚓染毒前在实验室预养 @ 周，空肠 >!后称重，放入含不同浓度阿
苯哒唑的基质中，于人工气候箱中培养 @C4，箱中为标准实验条件：温度为（GF Q @）R，湿度为 =N? Q G?，光
暗比 @G! $ @G!，定期喷射少量的水以保持基质的湿度。分别在染毒 G，=4 和 @C4 时，每个处理中 C 个重复的蚯
蚓被拣出，洗净，空肠 C>! 后，冰上取蚯蚓的前部（口器—GN 节）、中部（GN—FF 节）和后部（FC 节—肛门），
S >AR保存备用。
=@LFT L 期 T T T 高玉红T 等：阿苯哒唑对蚯蚓（!"#$%"& ’$(")&）酸性磷酸酶、谷胱甘肽硫转移酶及腺三磷酶活性的影响 T
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!& "# 酶活检测
酶活检测前 /0解冻。
12活性根据 34.5,的方法［67］并进一步改进测得。样品与醋酸钠缓冲液混合（体积比 89:），8:0孵育 67
;,.，加入 6 $ < 混液（样品与醋酸钠缓冲液）体积的反应液!（7& < ;)* $ = 错酸钠，6< ;;)* $ = 对>硝基苯酚钠，
7? @ ;+ $ ;*牛血清白蛋白，7& 6A吐温>677），8:0孵育 CD,5，7& 8 ;)* $ =磷酸钾，#3 E& B），检测在 /7B.;的光密度值。根据释放的对>硝基苯酚量计算 12活性。
FGC活性检测采用 6>氯><，/>二硝基苯法，参照 =HII-D,［66］的方法。还原型谷胱甘肽（FG3）与 6>氯><，/>二
硝基苯（JKL1）反应生成 <，/>二硝基>谷胱甘肽复合物（FG>KLM）。通过检测该复合物生成量的高低反映
FGC活性的大小，以每分钟催化生成 6 .;)*产物为 6 个酶活性单位。
1C2-5’活性采用南京建成试剂盒测定。1C2酶可分解 1C2生成 1K2及无机磷，测定无机磷的量可得出
1C2酶的活性。
样品蛋白质的检测采用考马斯亮兰 F>
用 G2GG（G"-.N-DN O’D5,). 68& 7，G2GG P.(&）统计软件进行方差和相关分析。
%# 结果
%& !# 12活性的变化
阿苯哒唑对蚯蚓 12活性的影响如表 6 和表 < 所示。染毒浓度、时间、部位以及浓度 Q时间、浓度 Q部位
的互作对 12活性均有显著影响（! R 7& 76）（表 6）。从表 < 可以看出，对于蚯蚓前部，染毒
与对照组比较，<77 T @77 ;+ $ I+的药物显著抑制了 12 活性（! R 7& 76），是对照的 @:A T B/A；染毒 6/N 时，
677 T @77 ;+ $ I+的药物均显著抑制了 12活性，是对照组的 :EA T /8A。对于蚯蚓中部，染毒
随着染毒时间延长（:N），各处理组的 12活性与对照组无差异（! S 7& 7B）；染毒 6/N时，<77 T @77 ;+ $ I+的染
毒浓度均显著降低了 12活性，降到对照组的 E/A T @8A。对于蚯蚓体和蚯蚓后部，蚯蚓体只有在染毒 6/N
时，< 个较高浓度组的 12活性受到了显著抑制。而蚯蚓后部在整个实验期间，各处理组的 12 活性均无显著
差异（! S 7& 7B）。可见，阿苯哒唑对前部和中部 12活性的影响较大。
%& %# FGC活性的变化
阿苯哒唑对蚯蚓 FGC活性的影响如表 6 和表 8 所示。染毒浓度和蚯蚓部位对 12 活性均有显著影响
（! R 7& 76），且染毒浓度与时间之间存在显著的互作效应（! R 7& 76）（表 6）。随着染毒时间的延长，该药对
FGC活性的抑制作用加强。染毒
蚯蚓前部 FGC活性只有在最高浓度组（@77 ;+ $ I+）才受到显著抑制（! R 7& 7B）。染毒 6/N 时，<77 T @77 ;+ $
I+的阿苯哒唑显著抑制了蚯蚓中部 FGC 活性，其活性降到对照组的 EBA T :8A，而蚯蚓体、前部和后部的
FGC活性在 /77 和 @77 ;+ $ I+处理组才受到显著抑制。可见，与蚯蚓体、前部和后部比较，中部是阿苯哒唑对
FGC活性影响比较大的部位。
%& "U J-< V >1C2-5’活性的变化
阿苯哒唑对蚯蚓 J-< V >1C2-5’活性的影响如表 6 和表 / 所示。染毒浓度和蚯蚓部位对 J-< V >1C2-5’活性
均有显著影响（! R 7& 76），但浓度、部位和时间之间没有显著的互作效应（表 6）。从表 / 可以看出，蚯蚓体和
后部在 6/N染毒期间各组 J-< V >1C2-5’活性差异不显著（! S 7& 7B）。对于蚯蚓前部和中部，染毒
的 J-< V >1C2-5’活性在 < 个较高浓度组明显受到了抑制，分别是对照组的 ::A和 @8A，而蚯蚓中部的酶活性
E6W8 U 生U 态U 学U 报U U U <: 卷U
!""#：$ $ %%%& ’()*)+,(-& (.
在 /00 1 200 3+ $ 4+的浓度范围内受到了显著抑制（! 5 0& 06），是对照的 278 19:8，染毒 69;时，各染毒组的
酶活性没有显著差异（! < 0& 0=）。
表 !" 阿苯哒唑对蚯蚓 # 种酶活性影响的方差分析
$%&’( !" )*+,) -. )/，01$ %23 4%5 6 7)$/%8( %9:;<;:;(8 -. (%=:>?-=@8 (AB-8(3 :- )’&(23%C-’(
酶 >.?@3’
"值 " A-*B’
C D E C F D C F E C F D F E
GH 2& =I’’ :7& 6’’ =:& :I’’ =& =I’’ I& 0J’’ 6& /=
KLM 60& =9’’ 9I0& 0/’’ 0& 22 6& 6= 66& 60’’ 0& II
C-/ N OGMH-P’ :& =6’’ 2& 9I’’ 6& 96 0& 2: 0& 2I 0& :J
Q Q C：浓度 C).(’."R-",).；D：部位 L’(",).；E：时间 EBR-",).；’! 5 0& 0= ，’’! 5 0& 06
表 5" 蚯蚓在染毒 53，D3和 !E3时阿苯哒唑对蚯蚓体及其不同部位 )/活性的影响（.3)* 3,. S6 3+ S6 #R)"’,.）
$%&’( 5" F..(9: -. )’&(23%C-’( -2 )/ %9:;<;:G ;2 ?>-’( (%=:>?-=@ %23 ;:8 3;..(=(2: 8(9:;-28 %.:(= 5，D，%23 !E 3%G8 (AB-8H=(
部位
L’(",).
暴露时间
EBR-",). )T
’U#)PBR’ （;）
阿苯哒唑浓度 G*V’.;-?)*’ ().(’."R-",). （3+ $ 4+）
0 600 /00 900 200
蚯蚓体 / JJ& 77 W 7& J2 :=& :J W 67& 0J 606& :: W 60& 0I 606& =J W J& /2 60=& 9J W J& I2
X!)*’ I :7& 6/ W 2& 22 JI& /9 W :& JJ J0& I2 W /& 77 IJ& 66 W I& 2=’ J/& 7I W 67& 29’
%)R3 69 :6& =J W :& JJ :7& 99 W 6=& =6 :6& 06 W J& J2 I=& /6 W 60& I6 I/& 97 W 2& J6
前部 / :=& // W =& JJ :2& 2I W J& =6 :6& :/ W 2& 00 JI& == W I& =0 J0& 9I W 60& =0
G."’R,)R I J:& I9 W I& J/ I2& 6I W 6/& 7: 20& 62 W I& 97’’ =9& =I W 6/& IJ’’ 9J& I2 W =& J7’’
P’(",). 69 J:& 07 W 6=& :7 2:& 7= W I& :=’ 26& 67 W =& 0J’’ =7& 6= W /& 96’’ 7I& :2 W =& I7’’
中部 / 60:& 7/ W 2& =6 60I& 62 W 2& 2= 60J& 00 W 6=& 69 6/=& 0: W 9& /0’ 6/J& 77 W 9& I7’
Y,;O#-R" I 60:& =9 W 66& =9 660& J= W 60& /2 660& =9 W 6=& :0’ 609& 9= W I& I:’’ 60/& := W :& =7’’
69 60=& /I W 6/& =2 60:& /I W 69& =0 JJ& 6= W 60& 7= I:& /2 W 60& /J 2:& 7/ W 2& J7
后部 / II& I= W /& =9 J9& /= W 9& =/ JJ& 77 W 67& =0 :0& /0 W 60& =6 JJ& 26 W 7& =0
H)P"’R,)R I IJ& 00 W :& I6 IJ& :0 W :& /J J6& I= W 69& 9I J2& 02 W J& /9 :=& =9 W 7& /2
P’(",). 69 I/& =7 W 69& J0 I7& :I W /& :6 I7& 77 W 60& 00 I=& 7/ W /9& // I9& 9I W 2& 96
Q Q 表中数据为平均值 W标准差（# Z 9），E-"-P -R’ 3’-. A-*B’P W LE（# Z 9）；与对照组比较 L"-",P",(-* P,+.,T,(-.(’ AP& ()."R)* +R)B#：’ ! 5 0& 0=；
’’ ! 5 0& 06；表 7 和表 9 同Q M!’ P-3’ -P ,. M-V*’ 7 -.; M-V*’ 9
表 #" 蚯蚓在染毒 53，D3和 !E3时阿苯哒唑对蚯蚓体及其不同部位 01$活性的影响（.3)* $（3,. S6 3+ S6 #R)"’,.））
$%&’( #" F..(9: -. )’&(23%C-’( -2 01$ %9:;<;:G ;2 ?>-’( (%=:>?-=@ %23 ;:8 3;..(=(2: 8(9:;-28 %.:(= 5，D，%23 !E 3%G8 (AB-8H=(
部位
L’(",).
暴露时间
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’U#)PBR’ （;）
阿苯哒唑浓度 G*V’.;-?)*’ ().(’."R-",). （3+ $ 4+）
0 600 /00 900 200
蚯蚓体 / 666& 79 W 6:& I6 66=& /9 W 69& /0 66:& =2 W 6:& 6= 662& 22 W 6J& 27 6/2& 9J W /0& IJ
X!)*’ %)R3 I 6/I& IJ W 6I& 6/ 6/2& 6= W 6/& /= 6/7& 02 W /6& J/ 60/& /9 W 62& 7I’ :2& 67 W 60& 9/’
69 67/& I0 W /=& 0I 67=& J7 W 6=& J= 66:& /9 W 6J& 07 ::& =2 W 6/& 2J’ J7& 66 W /7& 72’’
前部 / =2& 6: W 9& =I =:& /= W J& JI 20& 90 W =& 2= I0& =7 W 66& 67 II& I2 W 62& 9=
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69 I2& /= W I& =I J/& :/ W :& /0 J=& I= W 6/& /: 2/& 97 W =& I:’ ==& 2J W 2& 92’’
中部 / 629& 96 W 6/& I2 62I& =7 W 6/& 77 6I6& I2 W 6:& /0 6J9& /9 W 6:& 6I 6:6& 7= W 6J& 9I
Y,;O#-R" I 6I2& 67 W 6/& I2 6J6& 96 W 6/& 77 62:& 0J W 6:& /0 6=0& =7 W 6:& 6I’ 692& J= W 6J& 9I’
69 6:6& 02 W 6:& 20 6J7& 9= W 6:& /7 62/& J: W 6J& 6=’ 6=/& 7I W 6J& I9’’ 690& 0I W 6/& /9’’
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69 670& J/ W 66& 7= 676& /: W 6J& /2 6/7& /= W //& // 600& :: W :& 96’ 602& 20 W 66& IJ’
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C" 讨论
C& &" 阿苯哒唑对蚯蚓 8J活性的影响
溶酶体内含约 @< 种酸性水解酶，这些水解酶对外源性物质、衰老的细胞和包涵物等有消化、分解作用，保
护细胞免受各种不同有机化合物和重金属的损伤，目前溶酶体在哺乳动物和水生动物已经被作为外界环境污
染的一种指示标志物。8J普遍存在于溶酶体中，而且在进化过程中相对保守，所以 8J 被认为是溶酶体稳定
性的标志酶，是检测外界污染可靠的生物标志物［=B，=C］。
本实验结果表明，阿苯哒唑对蚯蚓 8J活性的影响与染毒浓度、染毒时间和蚯蚓部位密切相关，该药对蚯
蚓前部和中部的 8J活性影响较大，尤其是前部，即使在最低的染毒浓度（=<< /+ $ ;+），8J活性仍受到了明显
的抑制，这可能是由于蚯蚓前部结构和功能的复杂性（主要包括繁殖器官、食道、砂囊、胃等）引起的，其机理
需要进一步研究。而对于蚯蚓中部，在染毒 >7 时，两个较高浓度组的 8J 活性明显增加，可能是由于细胞防
疫体系对异源物质的早期适应性反应，以减少异源物质对机体的损伤，这种早期短暂的适应性反应一般是可
逆的，当染毒 D7时，各个组的 8J活性没有明显的差异，这与 K-L-*-;6!/,报道［=>］的被重金属铜诱导的蚌类的
反应基本一致。随着染毒时间的延长（=?7），阿苯哒唑对蚯蚓的毒性反应已经超过了自身的防御体系所能适
应的范围，推测溶酶体的结构和防御功能受到了严重损坏，本实验中阿苯哒唑在 ><< M @<< /+ $ ;+ 浓度范围
内，蚯蚓中部的 8J活性均受到了显著抑制，一般而言，这时的毒性反应是不可逆的。
C& #" 阿苯哒唑对蚯蚓 N1O活性的影响
N1O具有解毒作用，在脊椎动物、无脊椎动物和植物对异源物质（重金属、杀虫剂以及除草剂等）的解毒
代谢中有重要的作用，而且容易被杀虫剂和重金属诱导。在以蚯蚓作为指示动物的毒理研究中，N1O 活性的
诱导作用也常常被作为指示重金属［==］和杀虫剂污染［=B］潜在分子标志物，但也有相反的报道［=?，=C］。在本实
验中，蚯蚓在染毒 D7后，该药对蚯蚓体及其前、中和后部的 N1O活性均有不同程度的抑制作用。并且随着染
毒时间延长，药物浓度越高，N1O活性的抑制作用越强，尤其是蚯蚓中部，在染毒 =?7，><< M @<< /+ $ ;+ 的 N1O
活性降到对照组的 FCP MDBP。另外，从表 = 和表 ? 可以看出，N1O活性在蚯蚓不同部位的分布不同，中部活
性最高，这与该药对中部 N1O活性的影响较大是一致的。有研究表明，N1O 在体内表达水平的高低是决定细
胞对一些有毒化学物质的敏感性的关键因素［=@］。对于哺乳类动物，肝脏中 N1O 含量最高，是解毒的重要场
所，而昆虫中的脂肪体和中肠 N1O含量最高，通常也被认为脂肪体和中肠是昆虫的消化或解毒器官。本实验
中蚯蚓中部可能是阿苯哒唑对蚯蚓 N1O活性影响较大的部位，但该机理还需进一步研究。
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!& !/ 阿苯哒唑对蚯蚓 0-1 2 3456-7’活性的影响
456-7’存在于组织细胞及细胞器的膜上，在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要作用。由于
多种类型污染物对其有显著的诱导或抑制作用，因而目前 456-7’ 活性已被看作水生动物对重金属和杀虫剂
较敏感的分子生态毒理标志物。0-1 2 3456-7’对于维持细胞 0-1 2平衡是非常重要的，因为钙离子通常与信号
转导有关，钙离子浓度的变化会引起细胞内信号途径的反应，导致一系列的生理变化。国内外关于无脊椎动
物 456-7’的研究却很少。本实验阿苯哒唑对蚯蚓 0-1 2 3456-7’活性的研究表明，在染毒 18和 9:8，蚯蚓体及
其各部分的酶活性都没有明显变化，只有在染毒 ;8时，蚯蚓前部和中部的 456-7’ 活性表现出不同程度的下
降，该结果与阿苯哒唑对体内寄生虫影响的研究结果一致［9;，9<］。=(0>-(?’. 研究指出苯并咪唑类抗蠕虫药
物的本质作用机制是抑制蠕虫线粒体的电子传递体系和与电子传递体系偶联的磷酸化反应。阿苯哒唑对
0-1 2 3456-7’活性的抑制作用可能是由于破坏氧化磷酸化偶联，影响 456 的形成与释放，进而影响了与 456
相关的代谢功能。
从 @ 种酶活性的变化趋势来看，虽然阿苯哒唑对蚯蚓 @ 种酶活性均有显著性影响，但对它们的影响程度
不同。该药对 46和 AB5活性的抑制作用均随染毒时间的延长而加强（染毒 18 时中部的 46 活性除外），染
毒浓度和染毒时间有显著的互作效应，在染毒 9:8 时，两种酶活的变化最明显。而 0-1 2 3456-7’ 活性的变化
趋势与 46和 AB5活性不同，浓度、时间和部位对该酶活性没有明显的互作效应，在染毒 9:8 时，各组酶活之
间没有显著的变化。可见，该药对 46和 AB5活性的影响比 0-1 2 3456-7’ 的大。另外，@ 种酶中只有 46 活性
明显受到染毒浓度 C蚯蚓部位的互作影响，影响最大的部位是蚯蚓前部。可见，在检测该药对土壤环境造成
的影响时，不仅要重视检测指标的选择，蚯蚓部位的选择也很关键，该实验结果将为阿苯哒唑在土壤环境中的
早期检测提供一定的理论基础。
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