全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 37~48 3 7
收稿 2010-10-21 修定 　2010-12-01
资助 甘肃省教育厅科研项目(1 00 8B-0 7)。
* 通讯作者(E-mail: jiaochj2009@163.com; Tel: 0938-8367717)。
植物半胱氨酸合成及调控研究进展
王小芳 1, 杨玲娟 1, 董晓宁 1, 李志孝 2, 焦成瑾 1,*
1天水师范学院生命科学与化学学院, 甘肃天水 741001; 2兰州大学化学化工学院功能有机分子化学国家重点实验室, 甘肃
兰州730000
摘要: 硫是植物重要的营养元素。植物将氧化态硫吸收并还原后, 首先合成半胱氨酸使其进入各种代谢途径。合成半胱氨
酸的两种酶——丝氨酸乙酰转移酶和O-乙酰丝氨酸硫醇裂合酶均由多基因家族编码, 并能可逆的结合形成二酶复合物进
行有效的合成调节。本文对近年来半胱氨酸合成相关酶表达、定位、活性调控及转基因效果研究进展作了简要介绍, 并对
将来需要重点研究的方面作了展望。
关键词: 半胱氨酸合成; 丝氨酸乙酰转移酶; O-乙酰丝氨酸硫醇裂合酶; 半胱氨酸合成酶复合物
Advancement in Research on Synthesis and Regulation of Cysteine in Plants
WANG Xiao-Fang1, YANG Ling-Juan1, DONG Xiao-Ning1, LI Zhi-Xiao2, JIAO Cheng-Jin1,*
1School of Life Science and Chemistry, Tianshui Normal University, Tianshui, Gansu 741001, China; 2State Key Laboratory of
Applied Organic Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
Abstract: Sulfur is an essential element that is taken up by plants in the oxidation state form, reduced to H2S,
and first incorporated into cysteine before involving metabolic processes. Cysteine synthesis occurs through
two sequential reactions catalyzed by serine acetyltransferase (SAT) and O-acetylserine(thiol)lyase (OAS-TL),
both of which are encoded by multigene families, and reversibly form a dienzyme complex to play a regulatory
role. In this review, we summarize the recent progress made in the understanding of Cys synthesis, including
the isoform expression, localization, activity regulation as well as efficiency of genetic transformation. Finally,
aspects of the particularly important research in the future are suggested.
Key words: Cys synthesis; SAT; OAS-TL; CSC
硫是植物生长发育的大量营养元素之一, 参与
合成许多在新陈代谢上重要的有机化合物, 如半胱
氨酸(cysteine, Cys)和甲硫氨酸(methionine, Met)是
构成蛋白质的重要氨基酸; 参与合成含硫维生素(如
维生素 B1、生物素和硫辛酸等)、含硫辅酶(如辅
酶A); 形成谷胱甘肽以及许多含硫防御性有机物(如
金属硫蛋白、植物鳌合肽、蒜素和芥子油苷等)
和含硫信号分子(如结瘤因子和膨胀素)等(Droux
2004; Wirtz和Droux 2005; Kopriva等 2009)。其
中半胱氨酸是植物将无机硫转变为有机硫的第一个
含硫有机物, 其他绝大多数含硫代谢物都直接或间
接来源于半胱氨酸。因此它的合成在植物硫代谢
中处于中心位置(Kopriva 2006; Kopriva等2009) (图
1 )。
植物通常将环境中的无机硫(主要以 SO42-形
式, 硫处于氧化态)通过根细胞膜上的专一转运蛋白
吸收进入细胞, 在根细胞质体或叶肉细胞叶绿体中
经过一系列酶促还原后成为硫化物(主要以H2S形
式, 硫成为还原态) (Hawkesford和Wray 2000;
L e u s t e k 等 2 0 0 0 )。在半胱氨酸合成酶[ c y s
synthase, CSase; 常称O-乙酰丝氨酸硫醇裂合酶,
O-acetylserine(thiol)lyase, OAS-TL]的催化下, H2S与
O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine, OAS)反应形成 Cys
(Bick和Leustek 1998; Ravina等2002; Kopriva 2006),
并产生乙酸。OAS事先由丝氨酸(serine, Ser)和乙
酰辅酶A (acetyl-CoA)在丝氨酸乙酰转移酶(serine
acetyltransferase, SAT)催化下形成(图 1)。尽管
SAT和OAS-TL依次催化这两步不同的反应, 但它
们常常形成多亚基酶复合物, 即半胱氨酸合成酶复
合物(cysteine synthase complex, CSC) , 从而更有效
地调节 Cys合成(Droux等 1998; Wirtz和 Hell
2006)。
植物生理学报3 8
Kredich等早在上世纪 60年代首先对鼠伤寒
沙门氏菌的OAS-TL和CSC进行了比较详尽的研
究, 随后人们从菠菜、菜豆、小麦、大麦以及
甘蓝等植物中相继纯化到了 2~3种OAS-TL同工
酶(Ngo和 Shargool 1974)。Nakamura和 Tamura
(1989)从葡萄叶子中纯化得到 5个OAS-TL同工
酶。进入上世纪 9 0 年代后人们开始陆续克隆
OAS-TL主要同工酶 cDNA (Hell等 2002), 与此同
时也开始了基因转化方面的研究(Saito等 1992,
1994)。
1994年Hell等从模式植物拟南芥中克隆出胞
质和质体OAS-TL同工酶 cDNA。至 2000年, 拟
南芥基因组中OAS-TL家族9个成员基因序列全部
得以鉴定(表 1) (Watanabe等 2008a)。
表 1 拟南芥OAS-TL同工酶及其基因家族成员
Table 1 OAS-TL isoforms and its gene family in Arabidopsis
基因 基因编号 同工酶别称 定位 主要活性 文献
Bsas1;1 At4g14880 OAS-TL A1 胞质 合成 Cys Hell等(1994)
Bsas1;2* At3g22460 OAS-TL A2 胞质 无活性 Jost等(2000)
Bsas2;1 At2g43750 OAS-TL B 质体 合成 Cys Barroso等(1995)
Bsas2;2 At3g59760 OAS-TL C 线粒体 合成 Cys Hesse等(1999)
Bsas3;1 At3g61440 AtcysC1 线粒体 CASase (氰解毒酶) Hatzfeld等(2000)
Bsas4;1 At5g28020 AtcysD2 胞质 CSase (弱活性) Yamaguchi等(2000)
Bsas4;2 At3g04940 AtcysD1 胞质 CSase (弱活性) Yamaguchi等(2000)
Bsas4;3 At5g28030 CS-like proteina 胞质 半胱氨酸脱硫酶 Álvarez等(2010)
Bsas5;1 At3g03630 CS26b 质体 磺酸半胱氨酸合成酶 Bermúdez等(2010)
　　*表示为假基因, 翻译的蛋白没有酶活性; a 表示最近发现其主要功能为分解半胱氨酸产生 NH3、H2S和丙酮酸, 因而被命名为
L-半胱氨酸脱硫酶(L-Cys desulfhydrase, DES1); b表示最近发现其主要功能以硫代硫酸盐(thiosulfate)和乙酰丝氨酸(OAS)为底物形成
S-磺酸半胱氨酸(S-sulfocysteine), 故被命名为 S-sulfocysteine synthase (SSCS)。
图 1 植物中硫元素的同化
Fig.1 The sulfur assimilation in plants
另外, 人们在细菌、植物以及昆虫中很早就发
现一种解腈(HCN)毒的酶——β-腈基 -丙氨酸合成
酶(β-cyanoalanine synthase, CAS), 其蛋白序列及功
能与OAS-TL家族酶非常相似, 也就是说这两类酶
都具有不同程度合成β-Cyanoalanine和Cys的功能,
而且都需要磷酸吡哆醛(pyridoxal 5-phosphate, PLP)
作为辅基。因而将两类酶合并为一个家族——β位
取代的丙氨酸合成酶(β-substituted alanine synthase,
Bsas)家族(Ikegami和Murakoshi 1994), 该家族因而属
于磷酸吡哆醛依赖性酶超家族(Watanabe等 2008a)。
由于CAS合成Cys的活性也比较高(Hatzfeld等2000),
实际上已将CAS看作是OAS-TL家族成员(Watanabe
等 2008a)。
SAT酶也是先在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌
(Kredich和Tomkins 1966)中被研究的, 后来在菠菜
(Giovanelli和Mudd 1968)、菜豆(Smith和Thompson
1971)等植物中相继被发现。2000年, 人们从拟南
芥基因组中鉴定出 5个 SAT同工酶基因(Hell等
2002)。早期研究表明, 不同的 SAT对 Cys的反馈
抑制敏感性不同(Kawashima等 2005)。
王小芳等: 植物半胱氨酸合成及调控研究进展 3 9
1 植物OAS-TL家族成员、亚细胞定位、功能
及表达
植物OAS-TL有多种同工酶, 其基因家族成员
数量在不同植物中也不一样, 如拟南芥中有9个, 水
稻中有 9个, 甜高粱和大豆中各有 6个, 而毛果杨
中有 10个(Kopriva等 2009; Zhang等 2010)。细胞
的三个主要区室细胞质、叶绿体和线粒体均存在
各自不同的同工酶形式, 它们的催化活性和表达在
不同植物中差别显著。
在拟南芥中, 人们已经对这些同工酶及编码基
因进行了比较详细地研究(Jost 等 2000; Wirtz等
2004; Heeg等 2008; Watanabe等 2008a; Álvarez等
2010; Bermúdez 等 2010)。 在文献中, 这些同工酶
基因一般以 Bsas1;2…或 BSAS1;2…表示。除了
Bsas1;2是假基因外, 其他 8个基因分别是 Bsas1;
1、Bsas2;1、Bsas2;2、Bsas3;1、Bsas4;1、Bsas4;
2、Bsas4;3和 Bsas5;1 (Watanabe等 2008a) (表 1)。
通过基因表达分析及T-DNA插入突变体生化
分析已经确认, 细胞质OAS-TL A1 (目前称OAS-
TL A)、叶绿体OAS-TL B和线粒体OAS-TL C是
拟南芥 Cys合成的主要同工酶。它们的酶活性占
细胞总OAS-TL活力的95%以上, 其中叶肉细胞胞
质是 Cys合成的主要场所(Heeg等 2008; Watanabe
等2008a, b; Shirzadian-Khorramabad等2010), 因而
OAS-TL A在Cys合成中尤其重要(Lopez-Martin等
2008), 其基因突变株尤其表现出严重的CSase活性
丧失以及细胞中硫醇化合物如Cys, GSH含量的减
少。在根细胞中, OAS-TL C活性明显高于叶子的,
说明根和叶细胞线粒体对Cys合成需求是不同的。
AtcysC1虽然也能合成 Cys, 但事实上是真正的
CASase (Hatzfeld等 2000), 它定位于线粒体, 对于
解氰毒而保护呼吸链意义重大。最近西班牙Gotor
的实验室连续发现了 CS-like protein 和 CS26的新
功能。前者作为 L-半胱氨酸脱硫酶通过分解半胱
氨酸有助于细胞中半胱氨酸维持正常的低水平
(Álvarez等2010), 后者作为S-磺酸半胱氨酸合成酶
第一次发现存在于植物中(Bermúdez等 2010)。两
者的功能都与叶片活性氧(reactive oxygen species,
ROS)稳态维持有关。另外, 定位于细胞质中的
AtcysD1和AtcysD2除了表现出弱的CSase活性外,
人们对它们的真实功能一无所知(图 2)。
有些植物的Cys合成研究虽然早于拟南芥, 但
目前人们对它们的了解远不如拟南芥的清楚。马
铃薯和菠菜的线粒体中没有发现OAS-TL, 而只检
测到CASase的存在, 但后者也具有合成Cys的酶活
性(Hatzfeld等 2000)。
在早期研究中, 人们发现了植物OAS-TL家族
成员还有其他方面的功能, 如以日本学者 Ikegami
图 2 拟南芥OAS-TL和 SAT亚细胞定位及Cys合成
Fig.2 Cys synthesis, subcellular localization of OAS-TL and SAT in Arabidopsis
植物生理学报4 0
为主的研究者通过对山黧豆、豌豆、香葱、含
羞草、使君子及西瓜等植物的研究, 发现OAS-TL
同工酶还具有合成一系列 β位杂环取代丙氨酸的
功能(表 2)。后来日本学者又在大肠杆菌中异源表
达了其中的一些OAS-TL同工酶, 菌粗酶液和纯化
酶均表现出合成相应产物的活性。这一系列 β位
杂环取代丙氨酸大多数有毒或对其他生物有生长抑
制作用(Saito等 1997; Mino等 2001)。由此也可以
看出植物OAS-TL家族成员在进化中共同保存下来
的生物学意义。
表 2 在OAS和适宜底物存在下, 部分植物OAS-TL同工酶所合成的游离 β位杂环取代丙氨酸
Table 2 The synthesis β-substituted alanine derivatives by OAS-TL isoforms in presence of OAS and suitable substrates
底物 合成的游离氨基酸 功能 植物 文献
Isoxazolin-5-one BIA 抗真菌 山黧豆等 Ikegami等(1993)
Pyrazole β-(Pyrazol-1-yl)-L-alanine 神经毒 西瓜等 Brown等(1982)
3,4-dihydroxypyridine 含羞草氨酸 蛋白毒 含羞草等 Murakoshi等(1984)
3,5-dioxo-1,2,4-oxadiazolidine 使君子氨酸 神经毒、驱虫 使君子等 Murakoshi等(1986)
1,2,4-triazole* β-(1,2,4-triazol-1-yl)-L-alanine 真菌剂解毒 许多植物 Ikegami等(1990)
　　*表示为三唑类真菌抑制剂在土壤中的降解产物, 大多数植物吸收后可通过 OAS-TL同工酶而解毒。
由于OAS-TL家族成员都以催化功能多样的
PLP为辅基, 这样成员之间底物结合位点的变异很可
能导致它们催化反应类型上的分化。序列对比发
现, 大肠杆菌以及拟南芥主要OAS-TL同工酶(OAS-
TL A、OAS-TL B 和OAS-TLC) 和底物结合序列很
保守(Heeg等 2008), 均为 “TSGNT”。而拟南芥中功
能发生明显变化的AtcysC1、CS-like protein和
CS26, 底物结合序列已分别变为 “TSGNM”、
“TGGNT”和“TTGNT”, 功能未知的AtcysD2, 结合
位点也已变为 “TAGNT”。通过对 CS-like protein
新功能的研究, Alvarez等(2010)认为, 正是底物结
合位点中 “S” (丝氨酸)被替换为 “G” (甘氨酸), 才
使其催化功能发生了显著的变化。由此可见 ,
OAS-TL家族成员功能多样是有结构基础的。
2 植物 SAT家族成员、亚细胞定位及表达
和OAS-TL相似, 植物SAT同工酶也是由多基
因编码的一个小家族, 在拟南芥中由 5个基因分别
编码 5个不同的SAT同工酶, 并分别定位于 5条染
色体上(Hell等 2002; Kawashima等 2005) (表 3, 图
2 )。
早期研究中, SAT分别只在菜豆的线粒体、
菠菜的叶绿体和西瓜的胞质中被检测到(Kopriva 等
2009)。通过对拟南芥的详细研究, 人们发现细胞
的三个主要区室均有SAT同工酶分布, 其中丰度较
高的 SAT1、SAT3和 SAT5是合成OAS的主要酶
(Noji等 1998), 而后来分离到的低丰度 SAT2和
SAT4由于合成OAS的活性很低, 以至于人们推测
它们可能有其他方面的功能(Kawashima等 2005;
表 3 拟南芥 SAT同工酶及其基因家族成员
Table 3 SAT isoforms and its gene family in Arabidopsis
基因 基因编号 同工酶 定位 对 Cys反馈抑制 主要功能 文献
Serat2;1 At1g55920 SAT1* 质体 不敏感 合成OAS Noji等 1998
Serat3;1 At2g17640 SAT2 胞质 不敏感 合成OAS Noji等 1998
Serat2;2 At3g13110 SAT3 线粒体 不敏感 合成OAS Noji等 1998
Serat3;2 At4g35640 SAT4 胞质 敏感 未知 Kawashima等 2005
Serat1;1 At5g56760 SAT5 胞质 敏感 未知 Kawashima等 2005
　　*表示其定位与植株叶片的发育状态有关, 4周龄拟南芥叶中定位于叶绿体, 而 6周龄叶子中只有 10%定位于叶绿体, 其余 90%则
定位于胞质中。
王小芳等: 植物半胱氨酸合成及调控研究进展 4 1
Watanabe等 2008b)。SAT同工酶的定位也不是绝
对的, 比如 SAT1的定位与叶龄有关(表 3), 冷胁迫
下, 甚至在细胞核也发现它的存在(Bae等 2003)。
序列对比发现, SAT1和 SAT3以及 SAT2和 SAT4
相似性很高, 说明它们起源于基因片段的相互复制
(Watanabe等 2008b)。
SAT家族成员的表达虽然几乎都是组成型的,
而且都倾向于在维管束的韧皮部表达, 但表达强度
存在明显差异。SAT1、SAT3和 SAT5三个同工
酶主要在拟南芥发育的早期表达, 而SAT2和SAT4
主要在植株繁殖时期、缺硫或镉胁迫情况下表达
(Kawashima等 2005)。通过实时定量 PCR分析发
现, SAT1是表达量最高的同工酶, SAT5和 SAT3
的表达量大概是它的 1/10左右, 而 SAT2和 SAT4
的表达量比它小至少 2个数量级(Kawashima等
2005)。
拟南芥除了所有 SAT基因突变(五重突变)为
胚胎致死外, SAT家族单基因突变个体表型与野生
型并没有明显差别, 说明SAT基因家族成员在功能
上是沉余的(Watanabe等 2008b)。然而四重突变
(敲除5个SAT中的4个基因, 只保留一个发挥功能
的突变体) 研究表明, 5个 SAT同工酶对植株生长
的重要性是不一样的。SAT1、SAT2或 SAT4基
因正常的四重突变体在苗期均出现生长抑制, 外观
与缺硫时的表现相似, 衰老症状明显(Watanabe等
2010); 而 SAT3或 SAT5基因正常的四重突变体生
长正常, 并进一步证实线粒体SAT3对细胞OAS的
合成起主要作用(Watanabe等 2008b)。
3 Cys合成调控
植物硫代谢调控与氮代谢调控完全不同, 氮缺
乏时, 一系列NO3-同化酶表达下调, 硫缺乏时, 一
系列 SO42-同化酶, 尤其硫转运体和还原酶表达上
调。因而, 从总体来看, 硫代谢调节与细菌的相似,
即主要由需求驱使(Lappartient和 Touraine 1996;
Davidian和Kopriva 2010)。另外, 虽然植物中 Cys
的合成涉及由SAT和OAS-TL催化的两步反应, 但
SAT的底物之一——Ser与氮代谢的状况密切相关,
而OAS-TL的底物之一——H2S涉及 SO42-的吸收
和还原等硫代谢的上游途径, 加之硫转运体、SAT
及OAS-TL家族成员众多, 活性和分布各异, 因而
不难推测 Cys合成调控是极其复杂的。根据它的
调控特点及目前人们了解的程度, Cys合成调控可
粗略的分为上游和下游调控: 上游调控主要涉及
SO42-的吸收与还原, 这方面转录等分子水平的研究
比较多(Davidian和Kopriva 2010); 而下游调控主要
涉及OAS、Cys及GSH等对相关酶活性的影响, 这
方面生化水平如酶学性质的研究相对多(Sirko等
2004; Wirtz和 Hell 2006; Lewandowska和 Sirko
2008; Yi等 2010)。
3.1 SO42-吸收和还原的正调控和负调控
与SO42-还原相比, 其吸收显得更为复杂。拟南
芥中 14个定位于根细胞膜上的成员构成SO42-转运
体家族(Hawkesford 2003), 它们以及 SO42-和 SO32-还
原酶转录水平均不同程度的受细胞中OAS的正调控,
而受Cys和GSH的负调控(Davidian和Kopriva 2010)
(图 3)。当硫缺乏时, 转运体表达上调(Takahashi等
1997), 而当重新供应硫时它们的表达又被抑制
(Lappartient等 1999)。由于硫缺乏时, OAS积累,
所以可用OAS来模拟硫缺乏时的反应, 即OAS处
理可使转运体 mRNA 水平升高, 硫的吸收增强
(Smith等1997)。相反, 给植株根部供应Cys或GSH
(Vauclare等 2002), 或用 H2S或 SO2来熏植株
(Herschbach等 1995), 则硫转运体的转录被抑制。
3.2 SAT和OAS-TL的活性调节
转录水平的研究表明, 除个别例外情况, SAT和
OAS-TL的mRNA水平在硫缺乏和逆境胁迫(Cys需
求量增大)条件下变化不大(Dominguez-Solis等2001;
Kawashima等2005), 由此许多学者认为翻译后水平
的调节如酶变构抑制等活性调节可能对Cys合成起
重要调控作用(Wirtz和Hell 2006; Lewandowska和
Sirko 2008; Yi等 2010)。
3.2.1 反馈抑制对SAT活性调节 和细菌的SAT相
似, 许多植物胞质SAT同工酶活性受Cys反馈抑制
调节(Saito 2000) (图 3)。这种调节的意义可能在
于: 一方面当Cys超过需求量而过剩时, 可防止SAT
产生OAS而浪费Ser和Acetyl-CoA; 另一方面在硫
供应充足, Cys需求量大的情况下, 防止OAS合成
速度失控而导致OAS的浓度达到或超过解离CSC
(参照下文)的临界值, 从而使 CSC解离, SAT失活,
OAS供应中断影响Cys的进一步合成(Hawkesford
和De Kok 2006)。显然这种反馈抑制可能对于保
持适宜的OAS和 Cys合成速率起到微调的作用。
植物生理学报4 2
不过在大豆中, 当植株遭遇胁迫而需要大量
Cys来合成GSH等抗氧化物时, Cys对SAT的抑制
作用由于 SAT本身被钙依赖性的蛋白激酶磷酸化
而变得对Cys不敏感, 从而使SAT合成更多的OAS
用于 Cys 合成以增强植物的抗氧化胁迫(Liu等
2006)。
但是, 定位于叶绿体和线粒体中的SAT同工酶
不受Cys反馈抑制或对Cys不敏感(Saito 2000) , 其
原因尚不清楚。然而这些细胞器中的 SAT与胞质
中的SAT一样可与OAS-TL形成酶复合物从而更有
效的进行 Cys合成调控。
3.2.2 SAT和OAS-TL复合物中酶活性调节 如果
说 Cys对 SAT的反馈抑制体现的是一种酶活性调
控普遍形式的话, 则SAT和OAS-TL相互作用形成
酶复合物(CSC)来影响双方酶活性的模式是硫代谢
中 Cys合成调控的一个显著特点(图 3)。目前CSC
被多数学者认为既是植物中硫营养状况的感受器,
又是通过蛋白质相互作用影响酶活性更细腻、更
巧妙的形式(Wirtz和 Hell2006; Lewandowska和
Sirko 2008; Yi等 2010)。
CSC是由2个SAT同源三聚体和2个OAS-TL
同源二聚体组成的十聚体, CSC中的SAT具有催化
活性, 而游离存在时没有酶活性; 相反, CSC中的
OAS-TL是没有活性的, 自由存在时才表现出酶活性
(Droux等 1998; Hindson和 Shaw2003)。早期认为
CSC形成可能为从Ser到Cys的中间产物OAS提供
了一个通道(channel)使 SAT的产物OAS不用释放
直接传递给OAS-TL而提高Cys合成效率, 后来发
现不是这样(Droux等 1998; Wirtz和Hell 2006), 因
为在CSC中, OAS-TL与SAT互相作用阻止了它与
底物OAS的结合。实际情况是: SAT将产物——
OAS首先释放到复合物周围, 由自由存在的OAS-
TL再结合而合成 Cys。这种机制可以解释为什么
植物中OAS-TL总是过量存在时, Cys的合成才能
有效进行。比如豌豆中, OAS-TL和SAT的酶活比
在胞质中是 200:1, 质体中是 300:1, 但是线粒体中
却只有4:1, 然而线粒体被证明并不是合成Cys的主
要场所(Watanabe等 2008a; Krueger 2009)。
由于SAT只有与OAS-TL结合形成CSC后才
能催化产生 OAS, 因此, 合成 Cys的限制因素是
SAT, 而不是OAS-TL (Wirtz和Droux 2005)。在
无OAS-TL存在的情况下, 不管是细菌还是植物粗
酶液均检测不到SAT酶活性, 尽管重组表达的SAT
单独表现出一定的酶活性(Droux等1998; Berkowitz
图 3 植物硫吸收、还原和 Cys合成调控
Fig.3 The general regulation of sulfate uptake, reduction and Cys synthesis in plants
王小芳等: 植物半胱氨酸合成及调控研究进展 4 3
等 2002; Kawashima等 2005)。
CSC的形成和解聚是可逆的。高浓度的S2-可
以稳定并促进CSC的形成, 而高浓度的OAS则促使
CSC解聚(Hell和Hillebrand 2001; Hell 2003) (图3)。
当环境中 SO42-供应充足, 根细胞膜组成型
SO42-低亲合转运体蛋白将其转运进入细胞并最终
于质体或叶绿体中还原为H2S, 后者与OAS一起合
成半胱氨酸。此时由于H2S浓度高, CSC复合体结
合稳定, SAT酶呈现活性状态, 不断合成OAS用于
自由状态的OAS-TL来合成Cys, 从而使OAS处于
低水平, 低水平OAS会部分抑制SO42转运体和还原
酶基因的表达, 不至于使H2S的浓度过高, 因为高
浓度的H2S对细胞是有毒的; 当硫供应不足或吸收
受限制时, 细胞中H2S浓度下降, 这时OAS开始积
累, 致使 CSC复合酶解离, SAT酶失活, 这样不会
进一步浪费 Ser和Acetyl-CoA。但高浓度的OAS
和低浓度的H2S共同解除对SO42-转运体和还原酶
基因的表达抑制, 使SO42-吸收和还原开始加强, H2S
浓度又开始上升, 此时OAS由于Cys合成增加而消
耗, 浓度开始下降, CSC复合酶又开始形成, SAT酶
活性恢复(Wirtz和Hell 2006) (图 3)。可见, CSC
能感受细胞中H2S和OAS的代谢状况, 通过自身的
形成或解聚来直接影响两酶的活性, 使细胞在特定
环境下 Cys的合成调控更为有效。
3.2.3 OAS-TL对 SO42-转运的调节 除了OAS-TL
能与SAT形成酶复合物外, 最近发现定位在拟南芥
根皮层细胞质中的OAS-TL还可以与其质膜上的
SO42-高亲合转运体之一SULTR1;2结合而抑制后者
的活性使 SO42-的吸收减弱(Shibagaki和Grossman
2010)。这种抑制硫吸收的机制主要在高 SO42-环
境而胞内还原力和能量比较低的情况下起调节作
用, 对于协调硫的吸收与低水平的细胞代谢同步进
行具有重要意义。
4 SAT和OAS-TL的转基因研究
Cys及其产物在植物正常代谢和抗逆方面具有
非常重要的作用。大量研究表明, Cys及其衍生物
如谷胱甘肽等的合成与植物生长发育及胁迫反应尤
其维持胞内 ROS水平平衡密切相关(Mittler 2002;
Dominguez-Solis等 2004; Buchanan和 Balmer 2005;
Meyer和Hell 2005; Vieira和 Rey 2006)。通过转基
因提高Cys及其衍生物的合成明显增加了烟草对重
金属及氧化胁迫的抗性(Harada等2001; Youssefian
等 2001; Sirko等 2004; Kawashima 等 2004;
Matityahu等 2006); 相反, ROS水平的升高则上调
OAS-TL表达(Queval等 2009)。而OAS-TL同工酶
突变或敲除则导致拟南芥ROS代谢平衡出现紊乱
(López-Martón等 2008; Alvarez等 2010; Bermúdez
2010)。OAS-TL尤其 SAT在维管束韧皮部中的优
势表达也说明Cys合成对提高植株抗氧化和镉胁迫
的重要性(Kawashima等2005)。另外, SAT和OAS-
TL同工酶蛋白序列从细菌到植物在进化中很保
守。因而, 不同来源 SAT和OAS-TL转基因研究
不但可以进一步阐明和揭示它们各自的表达调控机
制, 而且能够评估过表达对Cys及相关产物含量以
及植物抗逆性等方面的影响, 从而对提高作物硫营
养和增强抗逆性的育种工作具有重要意义。然而
目前已经得到的相关结果表明, 情况远比人们想象
的要复杂(Sirko 2004; Riemenschneider 2005; Tabe
等 2010)。
4.1 SAT基因转化
Inoue等人(1999)较早进行了用西瓜胞质SAT
的 cDNA转化拟南芥植株的研究。他们所用的
cDNA既有野生型的, 也有通过点突变对Cys反馈
抑制不敏感的, 其中有些 cDNA还与豌豆 1,5-二
磷酸核酮糖羧化酶(r ibulose-1,5-bisphospha te
carboxylase, rubisco)小亚基导肽序列基因融合。
这样得到的拟南芥植株一部分过表达定位于胞质的
SAT, 一部分过表达定位于叶绿体的 SAT。通过检
测发现这些由组成型表达启动子控制的 SAT基因
在所有转化的拟南芥植株中均过量表达, SAT活性
显著增强。但是只有转 SAT点突变基因的植株积
累了大量的OAS和Cys, 而野生型基因转化植株这
些化合物的含量没有多大的变化。但令人不解的
是所有转化植株GSH含量均升高了,在两类转化植
株间没有显示出差别(Noji和 Saito 2002)。
由于拟南芥线粒体SAT同工酶对Cys不敏感,
用它的cDNA不带或携带Rubisco导肽序列转化烟
草植株, 第一代转基因烟草细胞质和叶绿体SAT活
性显著升高, Cys含量分别增加了 3倍和 6倍, 但
GSH含量在所有转基因植株中均增加了3倍, 即所
有转化植株间也没有显示出差别(Wirtz 和 Hel l
2003)。
植物生理学报4 4
如果用烟草 Cys不敏感的 SAT cDNA来转化
大肠杆菌, 与用敏感的 cDNA转化相比, 培养基中
积累了更多的Cys (Wirtz和Hell 2003); 反过来, 用
大肠杆菌编码 SAT的野生型 CysE或突变型 CysE
(点突变后对 Cys的抑制敏感性下降)来转化烟草,
依据表达酶的定位不同得到 4类转化植株: 第 1类
在叶绿体中表达突变型SAT; 第2类在叶绿体中表
达野生型SAT; 第3类在胞质中表达突变型SAT; 第
4类在胞质中表达野生型 SAT。检测表明, 4类转
化植株Cys和GSH含量比对照植株均升高 2~3倍,
而且它们对H2O2造成的氧化胁迫抗性显著增强, 并
与叶片中的GSH含量呈正相关。进一步研究发现
Cys和GSH含量与SAT活性呈正相关, 而与其定位
无关, 但Cys和GSH含量在这些转化植株的后代中
有下降趋势(Sirko等 2004)。
用大肠杆菌野生型 CysE来转化马铃薯发现,
SAT活性在叶子和块茎中都显著增强了, 叶子中的
活性甚至增加了 20倍, 但其 Cys和GSH含量只增
加了2倍, 而块茎中的Cys和GSH含量并没有明显
的变化, 同时两种组织中的OAS-TL活性和表达模
式均没有变化(Harms等 2000)。
4.2 OAS-TL基因转化
不同课题组用不同来源的OAS-TL cDNA转化
烟草, 在正常生长条件下转基因植株与对照相比并
无多大差别, 但在氧化胁迫或重金属镉胁迫时, 植
株硫醇化合物含量不但升高, 对这些胁迫的抗性也
明显增强。
用小麦胞质OAS-TL的 cDNA来转化烟草, 正
义转化植株OAS-TL活性增强, 反义转化植株的与
对照相当。然而, 当用 SO2熏蒸时, 植株中 Cys和
GSH含量升高, 对 SO2的抗性增强(Youssefian等
1993); 给转基因植株供应 Cys合成底物 OAS或
SO32-, Cu/Zn型 SOD酶的转录和活性均大增, 植株
也能更加抵抗活性氧释放剂甲基紫精的处理
(Youssefian等 2001)。Ning等(2010)将大豆胞质
OAS-TL的 cDNA转入烟草, 发现Cys也显著升高,
但Met的含量并没有变化, 不过转化植株对镉的抗
性则明显增强。
用菠菜胞质OAS-TL的 cDNA (Saito等 1992)
或该克隆与豌豆Rubisco小亚基导肽序列融合后的
序列转化烟草(Saito等 1994)。两类转基因植株过
表达OAS-TL, 胞质和叶绿体部分的OAS-TL活性
均显著升高, 但 Cys和GSH含量变化不大。然而
叶子小圆片浸入 SO32-处理时, 其中 Cys合成增强,
对 SO32-处理抗性增强。两类转化植株杂交产生
OAS-TL定位不同(胞质和叶绿体)的双转化植株, 这
类新植株虽然在合成Cys和GSH方面与单转化植
株差不多, 但更抗 SO2和甲基紫精的处理(Noji等
2001)。
当通过转化使拟南芥过量表达(是原来的9倍)
自身胞质OAS-TL A的 cDNA克隆时, 植株正常条
件下无明显变化, 但更能抗重金属镉处理, 当镉浓
度达250 μmol·L-1 时, 对照的还原型GSH下降30%,
而转基因植株的却增加了54% (Dominguez-Solis等
2001)。在烟草中过表达水稻胞质OAS-TL的 cDNA,
转化植株也显示出较强的抗镉特性(Harada等2001)。
烟草的胞质或叶绿体中过表达大肠杆菌 cysK
(编码OAS-TL A)时, 两类植株的OAS-TL活性和
硫醇含量均升高, 前者还表现得耐镉处理, 甚至在
300 μmol·L-1的CdCl2中也能正常萌发生长, 但后者
即使在无任何处理的情况下, 植株下层叶片也出现
黄化表型, 有些植株在整个发育期内有此现象, 个
别的发育途中甚至枯死(Sirko等 2004)。
4.3 SAT和OAS-TL基因共转化
Sirko等人(Liszewska等 2001; Liszewska和
Sirko 2003)用大肠杆菌 cysE (编码 SAT) 野生型和
点突变型(酶蛋白第 256位的甲硫氨酸突变为异亮
氨酸, 活性不变但对Cys反馈抑制敏感性下降)以及
cysK (编码OAS-TL) 基因(包括事先融合叶绿体导
肽序列基因) 共转化烟草植株, 得到 4类共表达的
转基因植株, 其转化效果如下: 第1类含野生型SAT
和OAS-TL, 并均定位于叶绿体中, 这类植株据报导
是无效的, 作者推测可能与叶绿体低浓度的 acetyl-
CoA有关; 第 2类含突变型 SAT和OAS-TL, 并均
定位于胞质中, 第3类含野生型SAT 和OAS-TL, 但
前者定位于胞质, 而后者定位于叶绿体。第 2和第
3类植株中GSH含量比两基因单独转化植株的平
均高 15%~20%; 第 4类含野生型 SAT和OAS-TL,
并均定位于胞质中, 检测发现 SAT的活性比较低,
而且与单基因转化植株相比, 这类共转化植株的
GSH含量无差别, 作者对这类共转化中cysE的沉默
现象解释为使用的启动子不稳定以及胞质中高含量
王小芳等: 植物半胱氨酸合成及调控研究进展 4 5
的OAS或硫醇类可能对细胞的代谢产生了不利的
影响而导致 cysE基因表达抑制(Sirko等 2004)。
4.4 作物硫营养的转基因改良研究
众所周知, 豆类植物虽然富含蛋白质, 但含硫
氨基酸, 即半胱氨酸和甲硫氨酸在种子中的含量很
低(Tabe和 Higgins 1998; Shewry 2007)。因此豆
类作物育种的一个主要方面是提高种子中含硫氨基
酸含量(Krishnan等 2005)。通过遗传工程加强半
胱氨酸的合成和提高种子中富含半胱氨酸和甲硫氨
酸的储存蛋白质含量是目前所采用的两种主要手段
(Amir和 Tabe 2006; Shewry 2007)。但这方面的
研究开展的还不多。Tabe等(2010)最近将上述两
种手段结合起来考察了转基因羽扇豆种子成熟过程
中有机硫的积累情况。过表达拟南芥叶绿体 SAT
(对Cys不敏感)的植株发育胚的OAS和Cys含量分
别高出对照达5倍和26倍, 但Met的含量没有变化,
而且种子成熟后总Cys和Met含量也没有变化。将
转基因植株进一步与过表达向日葵种子球蛋白
(sunflower seed albumin, SSA, 富含 Cys和Met)的
转化植株杂交, 子代发育中的种子OAS和Cys含量
也发生了显著升高, 但Met以及成熟种子总含硫氨
基酸含量还是没有变化, 只有GSH浓度在发育的种
子中有小幅的升高。他们由此认为 SAT是合成
Cys的限制因子, 但 Cys则不是限制Met合成的制
约因素, 也不是合成富含半胱氨酸储藏蛋白的限制
因素。
5 展望
尽管有Kredich等人(1969)的开拓性工作, 但植
物硫代谢, 尤其是Cys合成研究上世纪90年代前后
才全面展开。SAT受 Cys的反馈抑制以及与OAS-
TL形成酶复合物调节模式的发现为以后Cys合成
的深入研究奠定了坚实基础, 但两种合成酶、SO42-
的转运体蛋白和还原酶类在转录水平的调控了解得
还相当不充分。对于许多作物, 尤其是大宗作物如
水稻、小麦、玉米及大豆等的硫代谢研究则更欠
缺(Yi等2010)。然而, Cys及下游产物如Met、GSH
等在细胞功能活动中所起的重要作用使其代谢状况
不但对植物的生存和抗逆性至关重要, 而且是决定
作物营养品质和提高抗逆性的重要方面, 因此硫代
谢研究近年来进展很快。但是 SAT和OAS-TL及
硫代谢的其他许多组分为小家族蛋白, 功能多样, 其
表达与氮等其他大量营养元素代谢之间关系密切。
因此与硫代谢有关的Cys合成研究任重道远, 下面
几个研究方面想必尤其需要重视。
(1)不像氮代谢, 植物之间硫代谢差别较大。
不同形式同工酶在其他代谢方面的催化功能特征有
待进一步研究, 尤其是低丰度或表达弱的同工酶形
式, 如拟南芥中的AtcysD2和AtcysD1等, 人们对
它们的真正功能还一无所知。
(2)在细胞中, 与SAT相比, OAS-TL远远过量,
约5%与SAT结合为酶复合物, 其余95%游离存在
(Haas等2008), 但转基因植株过表达OAS-TL时, 如
上所述, 仍会使Cys等含量有所增加, 抗逆性增强。
这一现象表明, OAS-TL合成 Cys的调控机制比目
前人们了解到的要复杂, 显然存在更精细的调控模
式有待进一步阐明。只有彻底弄清 Cys的合成调
控模式, 提高含硫氨基酸和增加抗性的作物改良才
会有成效。
(3)分布在细胞不同区室的SAT和OAS-TL同
工酶差异表达和活性强弱与细胞正常代谢及胁迫反
应之间的关系以及各成员在进化过程中的关系也是
将来需要加强的研究领域。
(4) Cys的合成与植物其他营养代谢尤其与
氮、磷等营养元素代谢之间的协调关系目前的研
究还很少。改良作物提高含硫氨基酸含量不能以
降低氮磷钾等主要营养为代价, 因此重视包括 Cys
合成在内的大量营养元素代谢整合研究具有重要的
现实意义。
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