全 文 ：植物学通报 2004, 21 (1): 66~73
Chinese Bulletin of Botany
两相法分离地被菊叶片质膜的研究 ①
沈 漫
（北京农学院植物科学技术系 北京 102206）
摘要 以地被菊(Dendranthema×grandiflorum Kitamura)叶片为材料，通过水溶性聚合物Dextran T-500
和PEG 3350所构成的两相分配体系制备质膜。在一定盐浓度（5 mmol.L-1 NaCl）下选用5种不同的聚
合物浓度（5.8%、6.0%、6.2%、6.4%、6.6%，W/W），研究了地被菊叶片质膜在两相体系中的分配情
况，在此基础上进一步研究了不同盐浓度（2、4、5、10、20 mmol.L-1 NaCl）对地被菊叶片质膜的纯
度及蛋白产率的影响。标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测的结果表明，地被菊叶片选用6.2%（W/W）
聚合物浓度和7 mmol.L-1 NaCl组成的两相分配体系可获得较高纯度的密实正向型质膜囊泡。
关键词 两相分配法，质膜，地被菊，标志酶，磷钨酸染色
Preparation of Plasma Membrane from Leaves of Grand-cover
Chrysanthemum by Aqueous Polymer Two-phase Partition
SHEN Man
( Department of Plant Science & Technology, Beijing Agriculture College, Beijing 102206 )
Abstract Plasma membranes were prepared from grand-cover chrysanthmum (Dendranthema×
grandiflorum Kitamura) leaves by aqueous polymer two-phase partitioning system which was com-
posed of Dextran T-500 and PEG 3350. The effect of the concentration of polymer and salt on partition
of plasma membrane in aqueous polymer system was studied. The results from the electron micro-
graph staining with phosphotungstic acid and the mark enzyme activity analyses showed that the
preparation of the right-side-out plasma membrane vesicles from grand-cover chrysanthmum leaves
had obtained high purity and yield by the system which consisted of 6.2%(W/W) Dextran T-500 and
PEG 3350, 7 mmol.L-1 NaCl.
Key words Aqueous two-phase partition, Plasma membrane, Grand-cover chrysanthmum, Mark
enzyme, Phosphotungstic acid staining
植物细胞质膜是细胞进行细胞间内外物质交换、能量转换及信息传递等重要生命活动的关
键部位，现已成为细胞生物学、植物生理学和生物化学的重要研究领域。近年来，质膜及其
H+-ATP酶在环境胁迫中的作用问题受到广泛关注。然而，要进行这些研究工作必须首先分离
出高纯度的质膜。由于植物细胞存在着细胞壁、各种次生代谢物以及液泡中各种水解酶类，使
①北京市科委“科技新星计划”资助项目（项目编号N o . 9 5 5 8 1 0 1 6 0 0）。
作者简介：沈漫，女，副教授。主要从事植物逆境生理方面的研究工作。1 9 9 7年毕业于南京林业大学林木
遗传育种专业，获农学博士学位；同年进入北京林业大学博士后流动站。1999年至今任教于北京农学院植
物科学技术系。 E-mail: shenman@vip.sina.com.
收稿日期：2002-12-11 接受日期：2003-05-19 责任编辑：孙冬花
672004 沈漫：两相法分离地被菊叶片质膜的研究
得对植物细胞质膜的研究落后于其他材料质膜的研究。两相法是近年来较为常用的分离质膜的
方法，到目前为止，已从数十种植物组织中分离出了高纯度的质膜（Sandelius and Morré ，
1990；胡章立等，1993；王建华等，1994），与传统的蔗糖密度梯度离心法相比具有明显的优
越性，但在质膜分离过程还有待完善，两相体系的组分、分配条件和操作步骤等不同制备条件
以及不同的植物材料对质膜的分离效果都会有较大的影响。
地被菊(Dendranthema×grandiflorum Kitamura)是一类具有许多优良观赏性状、抗逆性强的
新品种群，主要由早菊和7~8种野菊经过30年杂交培育而成。根据露地栽培情况发现，地被菊
十几个品种可在严寒地区（哈尔滨）和干旱地区（兰州）露地越冬并正常开花。这对于气候恶
劣、土地贫瘠地区的大规模绿化，无疑具有重要的实用价值。
目前对地被菊抗逆性与生物膜的相关性研究尚未见报道。为此，本文以地被菊叶片为材
料，研究了聚合物和盐浓度对质膜制备纯度及产率的影响，并通过标志酶检测和磷钨酸染色电
镜观察对分离纯化的质膜纯度和产率进行了检测，这将为下一步深入研究地被菊抗逆性与质膜
结构和功能的相关性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 化学试剂
葡聚糖（Dextran）T-500，Pharmacia产品；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）3350、
十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）、2-(N-吗啡啉)乙磺酸（2-(N-moropholino)
ethanesulfonicacid，MES），Sigma产品；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、苯甲基磺酰氟
（phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF）、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（N-(2-hydroxyethyl)pip-
erazine-N (2-ethanesulfonic acid)，HEPES）和ATP-Na，Boehringer产品；Triton X-100，Fluka
产品。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 植物材料
地被菊(Dendranthema×grandiflorum Kitamura)幼叶采自北京农学院园艺实验苗圃。
1.3 差速离心法制备微粒体
参照Palmgren等（1990）、Leonard等（1973）及Lester和Stein （1993）等的方法加以改
动。叶片鲜重（g）与匀浆液（mL）以1∶4的比例混合。匀浆液的成分为：250 mmol.L-1蔗
糖、3 mmol.L-1 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、25 mmol.L-1 Tris-MES
（pH7.8）、 25 mmol.L-1 HEPES（pH7.5）、10%(V/V)甘油、0.2%（W/V）牛血清白蛋白(bovine
serum albumin，BSA)、1 mmol.L-1 PMSF、1 mmol.L-1 DTT、0.6%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮
（polyvinylpyrrolidone，PVP）、5 mmol.L-1维生素C（scorbutanin，Vc）。叶片在匀浆液中真
空浸提5 min后，DS-1型高速组织匀浆器中速打磨4～5次，每次6～8 s。用四层纱布过滤，滤
液10 000×g离心15 min，收集上清液。合并两次上清液，100 000×g离心1 h，沉淀即为微粒
体，用少量悬浮液悬浮。悬浮液成分为：250 mmol . L-1蔗糖、5 mmol . L-1磷酸缓冲液
（p H 7 . 8）。液氮速冻后，-3 5℃保存备用。
1.4 两相法分离纯化质膜
参照Sandelius 和Morré（1990）的方法及Larsson等（1987）的方法进行。整个操作过程
均在4℃进行。微粒体用等浓度Dextran T-500和PEG 3350两相体系进行纯化。取1 g微粒体悬
68 21(1)
浮液加到两相混合液中，形成8 g两相体系。两相混合液包括一定浓度的Dextran T-500和PEG
3350、一定浓度NaCl、5 mmol.L-1磷酸缓冲液（pH7.8）、250 mmol.L-1蔗糖以及重蒸水。本实
验选用5种聚合物浓度（5.8%、6.0%、6.2%、6.4%和6.6%，W/W）和5种NaCl浓度（2、4、5、
10和20 mmol.L-1）。经过比较最后选用6.2%（W/W）聚合物浓度和7 mmol.L-1 NaCl的两相体
系。取微粒体 7.5 g形成 40 g两相体系。将两相充分混匀（颠翻 30~40次）后，1 000× g
离心 5 min分相，将上清液转移至含有新鲜下相的离心管中，混匀后再离心分相，如此重复3
次。收集上清液，用5倍体积悬浮液稀释后，100 000×g离心1 h。收集沉淀用少量悬浮液悬
浮，即得富含质膜的组分。液氮速冻后-35℃保存。
1.5 标志酶活性测定
以pH6.5下对钒酸钠（Na3VO3）敏感的ATP酶（VO33--ATPase）作为质膜标志酶；以pH
8.0下对硝酸钾（KNO3）敏感的ATP酶（NO3--ATPase）作为液泡膜标志酶；以pH8.0下对叠氮
钠（NaN3）敏感的ATP酶（NaN3-ATPase）作为线粒体膜标志酶。抑制剂Na3VO3、KNO3、
NaN3的浓度分别为0.1 mmol.L-1、100 mmol.L-1、1 mmol.L-1。ATP酶活性测定参考Gallagher和
Leonard （1982）、Sandstrom等（1987）和Briskin等（1987）方法。测定酶活的体系由50
mmol.L-1 Tris-MES(pH6.5或pH8.0)、50 mmol.L-1 KCl、4 mmol.L-1 MgSO4、80 μmol.L-1
Na2MoO4、3 mmol.L-1 ATP-Na、各种抑制剂、0.01%Triton X-100（视条件加或不加）及适量的
膜制剂组成。ATP酶水解反应在37℃恒温振荡水浴中进行30 min后，加入10% （W/V）SDS终
止反应。显色反应参照王建华等（1994）进行，在各反应试管中加入显色剂后，在37℃恒温振
荡水浴30 min，冰浴15 min终止反应。用UV-756MC型分光光度计测定反应液在820 nm处的光
吸收值。
1.6 磷钨酸染色
质膜纯度检测参考Roland等（1972）的低pH值磷钨酸染色方法，并稍作修改。将质膜囊
泡组分在3%（W/V）戊二醛中0℃固定4 h，磷酸缓冲液（pH7.0）冲洗3次，每次10 min。然
后1%（W/V）锇酸固定2 h，缓冲液冲洗同前。系列浓度的酒精脱水，丙酮浸泡过夜。环氧
树脂包埋，70℃聚合8 h。在LKD-3型超薄切片机（瑞典）上切片，用带有支持膜的镍网收集，
并对其进行常规的铅铀染色和低pH值磷钨酸染色。染色切片在日立H-700型透射电镜（日本）
下观察并照相。常规的铅铀染色能使所有的膜囊泡着色，而低pH值磷钨酸染色只能使质膜囊
泡专一着色，因此通过两种染色方法的比较，可以计算质膜囊泡所占的百分比。
1.7 蛋白质含量的测定
按Bradford（1976）方法进行。以BSA为标准蛋白。
2 结果与分析
2.1 两相体系中聚合物和盐浓度的选择
实验材料经组织匀浆和差速离心后，得到的微粒体（粗膜）在主要由Dextran-500和PEG3350
组成的水-聚合物两相系统中进行分配。两相法主要是利用不同膜囊泡在两相体系中分配系数
不同而达到分离纯化质膜的目的，影响膜在两相系统中分配系数的因素很多，如聚合物或盐浓
度、上下相的体积比、离子浓度以及微粒体的加入量，其中以聚合物和盐浓度影响最大。
692004 沈漫：两相法分离地被菊叶片质膜的研究
到的U3组分即为纯化的质膜。从表1可见，微粒体经过3次分相纯化，膜蛋白只有原来的12%左
右，但是质膜的标志酶VO33--ATPase的活性保留了近80%，这说明上相收集了绝大部分质膜。
一般可把膜标志酶对各专一性抑制剂的敏感性作为鉴定质膜相对纯度的标准。表2所示是
U3组分对不同抑制剂的不同反应。由表2可见，经过3次纯化，两相体系的上相富含质膜组分。
分离纯化的质膜组分中仅含少量内膜，如液泡膜5%，线粒体1.1%，而质膜组分的相对纯度在
80%以上，比微粒体组分提高了88%。因此，通过两相法分离纯化质膜，可以得到大部分质
在两相体系中，聚合物浓度不同，质
膜在上相的分配情况有明显差异。在
NaCl浓度为5 mmol.L-1的两相体系中，使
聚合物浓度从5.8%逐渐增加到6.6%，质
膜在两相体系中的分配如图1所示。随着
聚合物浓度的提高，上相中蛋白产率迅速
下降，而质膜标志酶VO33--ATPase的活性
逐渐升高。图1表明，选用6 . 2 %（W /
W）聚合物浓度较为合适。
在选用6.2%（W/W）聚合物浓度的
两相体系中，改变盐浓度，使NaCl浓度
从2 mmol.L-1增加到20 mmol.L-1。图2显
示不同盐浓度对质膜组分在上相中分配的
影响。由图2可见，分离纯化地被菊叶片
质膜，选用 6 . 2 %（W / W）聚合物和
7 mmol.L-1 NaCl的两相体系，既可以得到
较高纯度的质膜，又能保证较高的质膜产
率 。
2.2 质膜纯度的鉴定
微粒体经过6.2%（W/W）聚合物和
7 mmol.L-1 NaCl两相体系3次分配后，得
● 蛋白产率 PM harvest
■ 相对酶活VO33- -ATPase relative activity
图1 不同聚合物浓度对质膜组分在两相体系中分配的
影响
Fig. 1 Effect of polymer concentration on partition of
plasma membrane in two-phase system
8 g两相体系的NaCl浓度为 5 mmol.L-1。以每 100 mg
微粒体所得上相中蛋白质微克数表示质膜蛋白产率；
以 6.6%（W/W）两相体系的VO33- -ATP酶特异性酶
活为 100%求得相对酶活。
8 g two-phase system contained 5 mmol.L-1 NaCl. U3s mg
protein per 100 mg microsome stand for PM harvest; VO33-
-ATPase specific activity of U3 in 6.6% (W/W) two-phase
system as 100%.
表 1 质膜组分蛋白产率和标记酶活性在两相系统中的分配
Table 1 Distribution of protein and plasma membrane mark VO3
3- -ATPase in enriched PM
fraction obtained by two-phase system
项目(%) 微粒体
上相组分
Item Microsome
Upper fractions obtained by two-phase partition
U1 U2 U3
VO33--ATPase相对酶活
VO33--ATPase relative activity 100 90.9± 2.15 83.8± 2.41 77.0± 1.93
相对蛋白产率
Relative protein content 100 35.8± 2.14 24.2± 2.37 12.1± 1.69
表中数据以3次实验的均值±标准差表示。 两相体系由 6.2%（W/W）聚合物和 7 mmol.L-1 NaCl构成。
The data stand for mean± s, n=3. Two-phase system two-phase system contained 6.2% (W/W) Dextran T500/PEG
3350 and 7 mmol.L-1 NaCl.
70 21(1)
要是封闭性较好的正向型囊泡（rignt-side-out vesicles）。
3 讨论
分离纯化质膜的方法主要有蔗糖密度梯度离心法、两相分配法和自由流动法（free-flow
electrophoresis）。常见的是前两种方法。用差速离心法制备微粒体后，过去常用蔗糖密度梯
度离心法分离纯化质膜，但由于其原理是依据各种膜囊泡的密度与颗粒大小不同来进行分离，
因此很难将密度相同而性质不同的膜分开，提取的质膜容易受线粒体膜、叶绿体膜等污染，而
图 2 不同盐浓度对质膜组分在两相体系中分配的影响
Fig.2 Effect of NaCl concentration on partition of plasma
membrane in two-phase system
8 g两相体系的聚合物浓度为 6.2%（W/W）。以每 100 mg
微粒体所得上相中蛋白质微克数表示质膜蛋白产率；以
5 mmol.L-1 NaCl两相体系的VO33- -ATP酶特异性酶活为
100%求得相对酶活。图例参考图 1。
8 g two-phase system contained 6.2% (W/W) Dextran T-500
and PEG 3350. U3s μg protein per 100 mg microsome stand
for PM harvest; VO33- -ATPase specific activity of U3 in 5
mmol.L-1 NaCl two-phase system as 100%. Marks are the
same as Fig.1.
膜，去除绝大部分杂膜。
由于标志酶法只能给出相对纯度
（Widell and Larsson，1990），为了更
好地评价质膜组分的质量，进一步通过
磷钨酸染色法进行质膜纯度检测。由图
3A 1可见，微粒体组分比较复杂，磷钨
酸只能使少量的囊泡着色（图3 A 2），
说明在微粒体组分中质膜囊泡只占较少
的部分。图3B1、B2是6.2%（W/W）聚
合物和7 mmol.L-1 NaCl两相体系纯化3次
后的U3组分，比较二者可以看出，磷钨
酸使绝大部分U3组分着色，证明U3为质
膜，而且囊泡大小较均匀，囊泡边缘完
整清晰。
通过测定VO33--ATPase的活性潜势
大小可鉴定所纯化质膜囊泡的类型。活
性潜势是指0.01%Triton X-100使ATPase
活性增加的部分与激活后ATPase活性的
百分比（王建华等，1994）。实验结果
表明，U3组分的VO33--ATPase的活性潜
势达83%，说明分离纯化的质膜囊泡主
表 2 两相体系纯化后质膜和微粒体的纯度比较
Table 2 Comparison on purity of plasma membrane by two-phase system between microsome fraction
标志酶敏感性 * 特异部位 微粒体 质膜组分
Mark enzyme sensitivity Specific fraction Microsome Plasma membrane fraction
VO33- -ATPase （pH6.5） 质膜 Plasma membrane 43.8± 2.51 82.3± 2.09
NO3- -ATPase （pH8.0） 液泡膜 Tonoplast 19.1± 2.37 5.0± 1.04
NaN3-ATPase （pH8.0） 线粒体膜 Mitochondria 7.3± 1.49 1.1± 0.83
表中数据以3次实验的均值±标准差表示。两相体系由 6.2%（w/w）聚合物和 7 mmol.L-1 NaCl构成。*. 敏
感性(%)=被抑制的H+-ATPase活力 /总H+-ATPase活力× 100%。
The data stand for mean± s, n=3. Two-phase system two-phase system contained 6.2% (w/w) Dextran T-500/PEG
3350 and 7 mmol.L-1 NaCl. *. Sensitivity (%)=H+-ATPase specific activity inhibited / total ATPase activity ×
100%.
712004 沈漫：两相法分离地被菊叶片质膜的研究
且这种方法所需时间长，获得的质膜产率低。目前主要用两相法从微粒体中制备质膜，已在数
十种植物组织中获得了成功(王建华等，1994)。两相法的基本原理是在一定浓度范围内两种高
分子的亲水聚合物Dextran T-500和PEG 3350 （或PEG 4000）不能充分溶合而形成悬浮的两相，
这样可以利用膜微囊的表面电荷和亲水基团不同，使其在两相体系中分配在不同的相，质膜倾
向于分配在富含PEG的上相，而其他内膜主要分配在下相或界面，从而达到分离的目的。两相
图 3 地被菊叶片膜组分的电镜图
A.铅铀染色；A1. 微粒体；A2. 质膜; B.磷钨酸染色；B1. 微粒体；B2. 质膜
Fig. 3 Electron micrographs of membrane fractions from grand-cover chrysanthemum leaves
A. Section stained with conventional uranyl acetate-lead citrate; A1. Microsome; A2. PM fraction;
B. Section stained with phosphotungstic acid at low pH; B1. Mirosome; B2. PM fraction
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法需要的设备少，操作简便，获得的质膜纯度高，对绿色植物组织的质膜制备特别实用
（Sandelius and Morré ，1990；Larsson et al，1987）。
从植物中制备质膜的一个重要步骤就是在制备微粒体时对组织匀浆液成分的选择。Yoshida
等（1983）认为10 mmol.L-1乙二醇四乙酸（ethylene glycol-bis-tetraacetic acid，EGTA）可以最
大限度地减少磷脂酶的毒害作用，本研究以3 mmol.L-1 EDTA作为替代。BSA具有抑制磷脂酶
及多酚氧化酶、吸附游离脂肪酸和保护膜密实性等多种功能，所以匀浆液中高浓度的BSA是必
需的。我们选择了0 . 5 %的B S A加入到匀浆液中，这样可以避免分离时膜中的脂加氧酶
（lipoxigenase）促使脂肪酸和过氧化物释放所产生的毒害作用以及防止膜渗漏。为了减少叶片
中酚类物质氧化造成的干扰，我们在匀浆液中加入了较高浓度的抗氧化剂DTT和Vc以及酚类物
质吸附剂PVP。另外用1 mmol.L-1 PMSF来抑制脂加氧酶和蛋白酶的活性。这样尽量保证在制
备时膜的酶和蛋白活性不受影响。
对分离纯化地被菊叶片质膜来说，采用6.2%（W/W）Dextran T-500/PEG 3350和7 mmol.L-1
NaCl两相体系是比较适宜的，能够获得较高纯度、均一密实的正向型质膜囊泡，这与Larsson等
（1987）、Sandstrom等（1987）分离燕麦根（6.2%聚合物；3 mmol.L-1、4 mmol.L-1 KCl）、
Palmgren等（1990）分离甜菜叶片（6.5%聚合物，5 mmol.L-1 KCl）、Lester和Stein（1993）分
离香瓜果实（6.2%聚合物，3 mmol.L-1 KCl）所采用的体系尽管不同，但它们都有一个共同点，
即可以归为“高浓度聚合物低浓度盐”的两相体系。而在制备有些植物材料的质膜时，如桑
树树皮（Yoshida，1984）、Dactylis glomerata 草种根茎（Yoshida et al，1983）、Vicia faba
（Blum et al，1988），则是由较低浓度聚合物和较高浓度盐组成分离质膜的两相体系（5.6%聚
合物，17.5~50 mmol.L-1 NaCl）。这主要是由于制备质膜的材料来源不同，因而其组织膜微囊
表面特性不同而需要选择不同的两相分配体系的缘故。因此，在制备不同植物或相同植物不同
部位的质膜时，应首先建立适合的分离体系，以保证制备质膜组分的纯度和产率。
致谢 感谢中国农业大学生物学院张学琴老师提供的帮助。
参 考 文 献
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