全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 415-429, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-09-06; 接受日期: 2007-11-21
基金项目: 国家 948项目(No.2005-4-35)
* 通讯作者。E-mail: lyhshen@126.com
.研究论文.
草原龙胆 MADS-box基因的克隆及表达分析
徐启江, 关录飞, 吴笑女, 孙丽, 谭文勃, 聂玉哲, 李玉花 *
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040
摘要 植物MADS-box 基因家族编码高度保守的转录因子, 参与了包括花发育在内的多种发育进程。为阐释双子叶植物草
原龙胆(Eustoma grandiflorum)花器官发育的分子调控机制, 根据MADS-box基因保守序列设计简并引物, 用3-RACE方法从
草原龙胆中克隆了4个花器官特异表达的MADS-box家族基因。序列和系统进化树分析表明, 这4个基因分别与金鱼草DEF基
因、矮牵牛FBP3基因和FBP6基因以及拟南芥SEP3基因具有很高的同源性, 分别属DEF/GLO、AG-like和SEP-l ike亚家族。
从而将这4个基因分别命名为EgDEF1、EgGLO1、EgPLE1和EgSEP3-1。推导的氨基酸序列显示, 这些基因编码的蛋白质
都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域, 每个基因均有其亚家族特异的C-末端功能域。基因特异性RT-PCR检
测结果显示: EgDEF1 在萼片、花瓣、雄蕊及胚珠中高丰度表达, 在心皮中微量表达; 而EgGLO1在花瓣和雄蕊中高丰度表
达, 在萼片中微量表达; 在根、茎、叶等营养器官中均未检测到上述2个基因的表达。EgPLE1在雌蕊、心皮和胚珠中特异表
达, 但表达的丰度存在差异, 在雄蕊中的表达有所减弱。SEP- like亚家族基因EgSEP3-1在四轮花器官和胚珠中均特异表达,
且表达丰度相对一致。
关键词 花器官发育, 草原龙胆, MADS-box基因, 3-RACE
徐启江 , 关录飞 , 吴笑女 , 孙丽 , 谭文勃 , 聂玉哲 , 李玉花 (2008). 草原龙胆MA DS-box基因的克隆及表达分析. 植物学通报 25, 415-
429.
参与调控高等植物花器官特征的MADS-box 基因
是近年来植物发育生物学研究的热点。前人基于对模
式植物拟南芥、矮牵牛和金鱼草花同源异型突变体的
研究, 提出了花器官发育的 ABCDE 模型(Coen and
Meyerowitz, 1991; Colombo et al., 1995; Palaz et al.,
2000; Honma and Goto, 2001; Theissen and Saedler,
2001; Jack, 2004)。该模型认为, A 和 E 功能基因调
控萼片的发育, A、B 和 E 功能基因调控花瓣的发育,
B、C和 E 功能基因调控雄蕊的发育, C和 E 功能基因
调控心皮的发育, C、D和 E 功能基因调控胚珠的发育,
A 和 C 功能基因相互拮抗。除 APETALA2基因外, 所
有的花器官特征属性基因均编码MADS-box 转录因子,
具有典型的MIKC结构域模型(Adam et al., 2007), 通
过与其它转录因子共同作用或者直接结合到靶基因的调
控区, 激活或抑制下游基因的表达, 从而调控花器官的发
育(Theissen et al., 1996, 2000; de Folter et al., 2005;
Kaufmann et al. , 2005)。
草原龙胆(E us tom a g rand i f l orum )为龙胆科
(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)观赏植物, 原产于美国
中南部(Shinners , 1957), 因其适应性强、花姿典雅、
花茎颀长、花色丰富艳丽而成为国际流行的鲜切花
(Davies et al. , 1993; Uddin et al., 2002)。草原龙胆
既有单瓣花又有重瓣花(2-3轮)(图1 A, B), 重瓣花的四
轮花器官发育正常且雄蕊数目稳定, 这与重瓣花多存在
雄蕊发育异常、出现瓣化的现象不同, 而且存在较多的
自然突变体(图 1C, D)。有关花发育的分子机理是基于
金鱼草、拟南芥和矮牵牛的研究而阐明的, 但未涉及亚
重瓣的分子本质。本研究采用 3-RACE 方法克隆了参
与调控草原龙胆花器官发育的MADS-box基因, 为深入
了解草原龙胆花发育的分子机制, 并通过基因工程技术
416 植物学通报 25(4) 2008
培育新品种提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
草原龙胆(Eustoma grandiflorum (Raf. ) Shinners)取自
东北林业大学花卉生物工程研究所种质资源圃, 为淡黄
色单瓣品系(图 1A)。采集 3-5 cm 花芽、成花各部分
器官, 即萼片、花瓣、雄蕊、心皮、胚珠以及根、
茎、叶等营养器官。采集后立即用液氮冰冻, 分别保
存于-80°C冰箱中, 作为提取总 RNA 的植物材料。
1.2 cDNA的合成
用 TRIzol试剂(Gibco BRL)提取花芽总RNA, 具体实验
步骤按照操作手册进行。用 m R N A 纯化试剂盒
(Amersham)从总 RNA 中纯化 Poly(A)+ mRNA。利用
寡聚核苷酸引物5-GACTCGAGTGCACATCGA(T)17 -3
以 50 ng mRNA 为模板合成第一链 cDNA。具体操作
方法参照 Mara thon TM c DNA A mp li fi ca t ion Ki t
(C l o n t e c h )操作手册。利用 c D NA 末端快速扩增
(RACE)法克隆全长 cDNA(Frohman et al. , 1988)。在
进行 3-RACE时, 以第一链 cDNA为模板, 扩增MADS-
box基因的特异引物为 5-A(A/G)CTCAC(C/T)GT(G/C)
CT(C/T)TG(C/T)GA(C/T)GC-3, 接头引物为 5-GACT
CGAGTGCACATCGA-3。扩增片段经胶纯化后克隆入
pGEM®-T 载体(Promega)。
1.3 DNA序列及系统进化分析
克隆的 cDNA 在MegaBACE500毛细管自动测序仪
(Amersham phamacia Biotech Inc. )上进行双脱氧链末
端终止法测序。利用在线软件 ClustalW 对核苷酸序列
及推导的氨基酸序列与EMBL/DDBJ/GenBank DNA数
据库中已知基因进行同源序列比对 , 以邻位相连法
(neighbor-joining, NJ) 构建系统发生树。用于系统进
化分析的氨基酸序列见表 1。
1.4 草原龙胆MADS-box基因表达的RT-PCR 分
析
用 T R I z o l 试剂提取根、茎、叶、萼片、花瓣、雄
蕊、雌蕊和胚珠等器官的总 RNA, 用 cDNA 合成试剂
盒(ReverTra Ace-a-TM, TOYOBO) 分别以各样品的
0.5 mg 总 RNA 为模板、Oligo(dt)20 为引物合成第一链
cDNA。以 cDNA 为模板进行基因特异性 PCR。20 mL
PCR扩增体系包含 2.0 mL 10×缓冲液 (加Mg2+)、3.0
mL dNTP(各 2.5 mmoL·L-1)、浓度为 0.02 mmol·L-1 的
上下游特异引物各 1 . 0 mL、100 ng 的模板 DNA、
0.4 mL ExTaq酶 (5 U·mL-1, Takara), 加灭菌蒸馏水至
总体积 20 mL。扩增产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳后进
行检测。特异引物分别是EgDEF1(5-AATTCATCC-
CTA CCA CTACG -3 和 5 -AG TTTCTCGA TA GA -
CAACAC-3)、EgGLO1 (5-AGTACATCAGCCCT-
TCTACTG-3和5-G ATAGTGAATAGACACGAACAC-
3)、EgPLE1 (5-AGGTTGCTCTTATTGTCTTCTC-3和
5-GAA ACTGAAGTTCAAGGGCTC-3) 和 EgSEP3-1
(5-A TGG GGA GAG GAA AGA TA-3和 5-TTACTT
GTGAAGCATAGA-3)。使用蛋白质合成过程中的延伸
因子 EF-1a 及肌动蛋白 ACTIN作内参, 特异引物分别
图 1 草原龙胆单重瓣两性花及突变体
Figur e 1 Bisexual simple f low er (A), double f low er (B) and
mutants (C,D) of Eustoma grandif lorum
417徐启江等: 草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析
表 1 用于构建系统进化树的氨基酸序列及其序列号
Table 1 The amino acid sequences and their Genbank accession numbers f or generating the phy logenetic tree
No. Loci Accession No. Species No. Loci Accession No. Species
1 ApMADS2 BA C66963 Agapanthus praecox 51 MDA G2 AA S45693 Meliosma di llenii fol ia
2 AmSEP3A AA P83364 Antir rhinum maj us 52 MCMA DS AA O20104 Momordica charantia
3 DEF P23706 An. maj us 53 NA P1-2 AA D01422 Ni cotiana tabacum
4 DEFH28 AA K72467 An. maj us 54 NtMADS5 AA D39035 N. tabacum
5 DEFH49 CA A64741 An. maj us 55 NTGLO Q03416 N. tabacum
6 DEFH72 CA A64742 An. maj us 56 NTDEF CA A65288 N. tabacum
7 GLO Q03378 An. maj us 57 NtPLE36 AA D09499 N. tabacum
8 FAR CA B42988 An. maj us 58 NA G1 Q43585 N. tabacum
9 PLE AA B25101 An. maj us 59 NtMADS4 AA F76381 N. tabacum
10 SQUA CA A45228 An. maj us 60 NymA G1 AA S45692 Nymphaea sp.
11 AqaA G1 AA S45699 Aquil egi a alpi na 61 NymA G2 AA S45691 Nymphaea sp.
12 AP1 CA A78909 Arabi dopsis thaliana 62 NymA G3 AA S45690 Nymphaea sp.
13 AP3 AA M64919 A. thaliana 63 OsMADS14 Q7Y023 Oryza sati va
14 AGL8/FUL Q38876 A. thaliana 64 OsMADS2 Q40702 O. sati va
15 AG NP_567569 A. thaliana 65 OsMADS16 Q944S9 O. sati va
16 AGL6 AA A79328 A. thaliana 66 OSMADS3 AA A99964 O. sati va
17 CA L NP_564243 A. thaliana 67 OsMADS13 Q2QW53 Oryza sati va
18 P I AA D51997 A. thaliana 68 OsMADS6 AA B64250 O. sati va
19 SHP1/AGL1 NP_191437 A. thaliana 69 OsMADS7 Q6Q9I1 O. sati va
20 SHP2/AGL5 NP_850377 A. thaliana 70 OsMADS45 AA B50180 O. sati va
21 STK/AGL11 NP_001078364 A. thaliana 71 FBP Q03488 Petunia hybri da
22 SEP4/AGL3 NP_178466 A. thaliana 72 FBP3 CA A50549 P. hybri da
23 SEP3/AGL9 NP_850953 A. thaliana 73 FBP4 AA K21247 P. hybri da
24 AOGLOA BA D13495 Asparagus off ici nal is 74 FBP6 CA A48635 P. hybri da
25 AODEF BA C75969 As .offici nal is 75 FBP26 AA F19164 P. hybri da
26 AVAG1 BAD18011 As . virgatus 76 FBP7 CAA57311 P. hybri da
27 BpMADS1 CA B95648 Betul a pendula 77 FBP9 AA K21249 P. hybri da
28 BA G1 AA A32985 Brass ica napus 78 FBP11 CA A57445 P. hybri da
29 BoAGL3-a CA D48302 B. oleracea 79 FBP23 AA K21254 P. hybri da
30 CsA G1 AA S45688 Chloranthus spi catus 80 PMADS1 AA Q72510 P. hybri da
31 CCGLO BA D80746 Commelina communis 81 PMADS2 CA A49568 P. hybri da
32 CCDEF BA D80747 C. communis 82 PMADS3 CA A51417 P. hybri da
33 CUM1 AA C08528 Cucumis sativus 83 PFG AA F19721 P. hybri da
34 CUM26 AA D02250 Cucumis sativus 84 PhSEP3 AA P83395 P. hybri da
35 CUS1 CA A66388 C. sativus 85 PhaA G1 AA S45681 Phytolacca amer icana
36 CA G1 AA D01742 C. sativus 86 MAGL4 AA L08423 Popul us tremul oides
37 DePI AA C42572 Di centra eximia 87 RbAGL6 AA P83408 Ranuncul us bul bosus
38 DeA P3 AA C42590 D. ex imia 88 RA G AA D00025 Rosa hybri da
39 DiAG ABR68545 Di llenia i ndi ca 89 ScPI AA D31699 Sanguinaria canadens is
40 GtMADS2 BA D38888 Genti ana tri flora 90 ScA P3 AA D31696 S. canadens is
41 GHMADS2 AA N15183 Gossypium hirsutum 91 SxcA G1 AA S45705 Saxifraga careyana
42 HvAGL6 AA S48128 Hordeum vulgare 92 SxcA G2 AA S45704 S. careyana
43 HvAGL9 AA S48129 H. vulgare 93 LeMADS MC AA M15776 Solanum lycopersicum
44 HOMADS1 AA F08830 Hyaci nthus or iental is 94 TM4 Q40170 S. lycopersicum
45 HA G1 AA D19360 H. or iental is 95 LeA P3 AA C42583 S. lycopersicum
46 LpDEF AA S45972 Leucocarpus per fol iatus 96 LeSEP3 AA P83377 S. lycopersicum
47 LMADS2 AA S01766 Li lium l ongif lorum 97 TAGL1 AA M33101 S. lycopersicum
48 LA G AAD38119 Li qui dambar styrac ifl ua 98 TAG1 AA A34197 S. lycopersicum
49 MPMA DS11 BA B70746 Magnolia praecoci ssi ma 99 TAGL11 AA M33102 Solanum lycopersicum
50 MpMADS4 BA B70739 M. praecoci ssi ma 100 SvPI AA C42576 Syringa vul gar is
418 植物学通报 25(4) 2008
表 1 (续) Table 1 ( continued)
No. Loci Accession No. Species No. Loci Accession No. Species
101 SvA P3 AA C42584 S. vul gar is 116 ZmMADS3 AA G43200 Z. mays
102 SvAGL6 AA P83412 S. vul gar is 117 ZMM1 CA A57073 Z. mays
103 SvSEP3 AA P83410 S. vul gar is 118 ZMM2 CA A57074 Z. mays
104 TcPI AA F73942 Tacca chantieri 119 ZMM6 CA D23438 Z. mays
105 TcAP3 AA F73935 T. chantieri 120 ZMM7 CA A70485 Z. mays
106 VvMADS9 AAY79173 Vi tis vinifera 121 ZMM16 CA C33848 Z. mays
107 VV MADS1 AA K58564 V. vinifera 122 ZMM23 CA D23413 Z. mays
108 VvMADS3 AA M21343 V. vinifera 123 ZMM25 CA D23415 Z. mays
109 VvMADS4 AA M21344 V. vinifera 124 SILKY1 AA F59838 Z. mays
110 VvMADS5 AA M21345 V. vinifera 125 EgDEF1 EF569227 Eustoma grandif lorum
111 ZA P1 AA B00081 Zea mays 126 EgGLO1 EF569228 E. grandif lorum
112 ZA G1 AA A02933 Z. mays 127 EgPLE EF569229 E. grandif lorum
113 ZA G2 CA A56504 Z. mays 128 EgSEP3-1 EF569230 E. grandif lorum
114 ZA G3 AA B00078 Z. mays 129 EgMADS1 AA S01765 E. grandif lorum
115 ZA G5 AA B00079 Z. mays
为EF-1a (5-AATCCCATTTGTGCCAATCTCTG-3和5-
TGGGCTCCTTCTCAATCTC CTTAC-3)和 ACTIN (5-
A TG G CA G A CG G A GA G G A TA TTCA G -3 和 5 -
GCACTTCTTGTGGACAAT AGAAGG-3)。
2 结果与分析
2.1 草原龙胆花器官特征基因克隆及序列比对
将草原龙胆花芽总RNA (图2A)在AMV反转录酶的作用
下合成第一链 cDNA, 利用MADS-box 基因特异引物
PAD进行 PCR扩增, 扩增产物的大小约为 900 bp (图
2B), 切胶回收 PCR产物, 克隆入 pGEM®-T 载体。共
测序 100个克隆, 将测序结果在 NCBI(National Center
for Biological Information)的核苷酸数据库中进行 blastn
(nucleot ide query vs . nucleot ide database)分析, 并在
蛋白数据库中进行 blastp (protein query vs . protein
dat abas e)分析。实验共获得 75 条基因序列, 具有
MADS-box 基因家族的 2个高度保守的MADS 结构域
和K结构域, 其中的4个基因分别与金鱼草的DEF基因
(B 功能基因, X52023)、矮牵牛的 FBP3基因 (B 功能
基因, X71417) 和 FBP6基因 (C功能基因, X68675)以
及拟南芥的 SEP3基因 (E 功能基因, AY306171) 具有
很高的同源性, 分别命名为EgDEF1 (E F569227 )、
EgGLO1 (E F569228 )、EgPLE1 (E F569229 )和
EgSEP3-1 (EF569230)。
EgDEF1 cDNA 长 833 bp, 3-端非翻译区为 232
bp, poly(A)尾长 17个腺苷酸。根据 cDNA 序列推测的
多肽由193个氨基酸组成, 编码的蛋白质含有23个氨基
酸的MA DS 结构域、29 个氨基酸的 I 结构域、69 个
氨基酸的 K结构域和 72个氨基酸的 C结构域 (图 3A)。
与毛泡桐DE F 基因、金鱼草 DE F 基因(S c hwarz -
Sommer et al. ,1992)、拟南芥 AP3基因、细叶金鱼
图 2 草原龙胆花芽总RNA(A)及 3-RACE PCR产物电泳图(B)
1-3: 草原龙胆花芽总RNA; 4: cDNA 产物; M: DL2000标准样品
Figur e 2 Electrophoresis of total RNA (A) extracted from flow er
bud of Eustoma grandifl orum and 3-RACE PCR products (B)
1-3: Total RNA; 4: cDNA produc ts; M: DL2000 marker
419徐启江等: 草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析
草 DE F 基因、烟草 Nt DE F 基因、野丁香 SvAP 3基
因及 Leucocarpus perfol iatus LpDEF基因的氨基酸序
列同源性分别为 75%、75%、54%、75%、75%、
70%及 74% (图 3B)。序列比对显示, EgDEF1的 C末
端具有保守的 PI-derived和 euAP3基序。
EgGLO1 cDNA 长 837 bp, 3-端非翻译区为 280
bp, poly(A)尾长 18个腺苷酸。根据 cDNA 序列推测的
多肽由178个氨基酸组成, 编码的蛋白质含有23个氨基
酸的MA DS 结构域、29 个氨基酸的 I 结构域、69 个
氨基酸的 K结构域和 57个氨基酸的 C结构域 (图 4A)。
与矮牵牛 FBP3基因 (Angenent et al. , 1994)、金鱼
草G LO 基因、番茄 T PI 基因 (de M art ino e t al . ,
2006)、黄瓜 CUM26 基因、番木瓜CpPI 基因、葡
萄 VvMADS9基因(Sreekantan et al. , 2006)和拟南芥
PI 基因 (Purugganan and Suddith, 1999)的氨基酸序
列同源性分别为 69%、58%、63%、62%、64%、
62%和 55% (图 4B)。序列比对显示, EgGLO1的 C末
端具有保守的 PI-derived和 PI 基序。
EgPLE1 cDNA 长 749 bp, 3-端非翻译区为 193
bp, poly(A)尾长 20个腺苷酸。根据 cDNA 序列推测的
多肽由178个氨基酸组成, 编码的蛋白质含有26个氨基
酸的MA DS 结构域、29 个氨基酸的 I 结构域、67 个
氨基酸的 K结构域和 56个氨基酸的 C结构域 (图 5A)。
与三花龙胆GtMADS2基因 (Mishiba et al., 2005)、矮
牵牛 FB P6 基因和 P A GL1 基因、金鱼草 P LE 基因
(Bradley et al. , 1993)、五桠果 DiAG基因及拟南芥
SHP 1基因的氨基酸序列同源性分别为 68%、64%、
65%、65%、65% 和 58%(图 5B)。序列比对显示,
EgPLE1的 C末端具有保守的 AG基序 I和 AG基序 II。
EgSEP3-1 cDNA 长762 bp, 3-端非翻译区为127
bp, poly(A)尾长 21个腺苷酸。根据 cDNA 序列推测的
多肽由204个氨基酸组成, 编码的蛋白质含有23个氨基
酸的MA DS 结构域、34 个氨基酸的 I 结构域、67 个
氨基酸的K 结构域和 80个氨基酸的 C结构域(图 6A)。
与番茄 LeSEP3基因(Lit t and Irish, 2003)、矮牵牛
P hS E P 3 基因(L i t t and I r i s h , 2003 )、金鱼草
Am SE P3A 基因(Li t t and Ir i sh , 2003)、野丁香
SvSEP3基因、烟草 NsMADS3基因 (Jang et al. ,
1999)、葡萄 VvMADS4基因 (Boss et al., 2002)及拟
南芥 S E P 3 基因的氨基酸序列同源性分别为 87 %、
86%、83%、82%、87%、84% 和 71% (图 6B )。
序列比对结果显示, EgSE P3-1的 C末端具有保守的
SEP基序 I和 SEP基序 II, 同时具有 SEP/AGL6基序。
2.2 EgDEF1、EgGLO1、EgPLE1和EgSEP3-1
与其它MADS-box基因的系统进化关系
通过对分子系统进化树的分析表明, 涉及花器官发育的
M A D S - bo x 花同源异型基因分别属于 5 个亚家族
(subfamily), 即 AP1/SQUA-l ike、AP3/PI -l ike或DEF/
GLO-l ike、AG-like、FBP7/FBP11-like和 SEP -like
基因亚家族。为确定草原龙胆 MADS-box 基因的进化
地位, 我们收集了相关数据库中的 MADS-box基因, 构
建了系统发生树(图 7)。结果表明, EgDEF1与 DEF 聚
为一支 (clade), EgGLO1与GLO聚为一支, 属于AP3/
PI类; EgPLE1与PLE聚为一支, 属于AG类; EgSEP3-
1与 SEP3聚为一支, 属于 SEP 类。
2.3 基因特异性RT-PCR 分析
为分析草原龙胆花发育相关MADS-box基因在野生型花
器官中的表达空间特异性, 以草原龙胆的根、茎、
叶、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊和胚珠等器官的总 RNA
为模板, 进行基因特异性RT-PCR检测。结果表明, 草
原龙胆 B 功能基因EgDEF1 在萼片、花瓣、雄蕊及胚
珠中高丰度表达, 在心皮中微量表达; 而 EgGLO1在花
瓣和雄蕊中高丰度表达, 在萼片中微量表达 (图8); 在营
养器官根、茎、叶中均未检测到 2 个基因的表达。与
EgGLO1不同, EgDEF1除在花瓣和雄蕊中高丰度表达
外, 在萼片和胚珠中也有高丰度表达。EgGLO1在心皮
中无表达, 而 EgDEF1却有微量表达。草原龙胆 C功
能基因 EgPLE1在雌蕊、心皮和胚珠中特异表达, 但表
达的丰度存在一定的差异, 在雄蕊中的表达有所减弱 (图
8)。草原龙胆E 功能基因EgSEP3-1在四轮花器官和
胚珠中均特异表达, 且表达的丰度相对一致(图 8)。在
拟南芥中, SEP1/2/4 基因在花发育的早期, 即在花分生
420 植物学通报 25(4) 2008
图 3 EgDEF1 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与其它DEF- like的同源性比较
(A) EgDEF1 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
MADS、I、K和C结构域分别用单、双、波浪和点线标记, 箭头标注的序列为引物序列, 左右两侧的数字分别标注核苷酸及氨基酸
的位置;
(B) EgDEF1 cDNA 推导的氨基酸序列与其它DEF- like的同源性比较
MADS区、K区以及PI der ived基序和euA P3基序分别用方框标注, 星号表示保守氨基酸
Figur e 3 Nuc leotide and deduced amino acid sequences of EgDEF1 cDNA and comparison of the deduced amino ac id sequences
of EgDEF1 gene w ith other DEF-like genes
(A) Nucleotide and deduced amino acid sequences of EgDEF1 cDNA
MA DS, I, K and C domains are underlined and def ined by s ingle, double, w ave and dash line, respec tively. The arrow s under
sequences indicated primer sites, and the pos it ions of the nuc leotides and amino acids are show n on the left and the r ight,
respectively
(B) Comparison of the deduced amino acid sequences of EgDEF1 gene w ith other DEF-like genes
The MA DS- and K-domains are boxed, as are the PI motif -derived and euAP3 motif regions. The consensus amino acids are
indicated by asteris ks
A
B
421徐启江等: 草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析
图 4 EgGLO1 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与其它GLO- like的同源性比较
(A) EgGLO1 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
MA DS、I、K、C结构域分别用单、双、波浪和点线标记, 箭头标注的序列为引物序列, 左右两侧的数字分别标注核苷酸及氨基酸
的位置;
(B) EgGLO1 cDNA 推导的氨基酸序列与其它GLO- like的同源性比较
MA DS区、K区以及PI基序分别用方框标注, 星号表示保守氨基酸
Figur e 4 Nucleotide and deduced amino ac id sequences of EgGLO1 cDNA and compar ison of the deduced amino acid
sequences of EgGLO1 gene w ith other GLO-like genes
(A) Nucleotide and deduced amino acid sequences of EgGLO1 cDNA
MA DS, I, K and C domains are underlined and def ined by s ingle, double, w ave and dash line, respec tively. The arrow s under
sequences indicated primer sites, and the pos it ions of the nuc leotides and amino acids are show n on the left and the r ight,
respectively
(B) Comparison of the deduced amino acid sequences of EgGLO1 gene w ith other GLO-like genes
The MADS- and K-domains are boxed, as is the PI motif region. The consensus amino ac ids are indicated by asteris ks
A
B
422 植物学通报 25(4) 2008
图 5 EgPLE1 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与其它 AG - like的同源性比较
(A) EgPLE1 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
MA DS、I、K、C结构域分别用单、双、波浪和点线标记, 箭头标注的序列为引物序列, 左右两侧的数字分别标注核苷酸及氨基酸
的位置;
(B) EgPLE1 cDNA 推导的氨基酸序列与其它AG - like的同源性比较
MA DS区、K区以及A G基序 I和A G基序 II分别用方框标注, 星号表示保守氨基酸
Figur e 5 Nuc leotide and deduced amino acid sequences of EgPLE1 cDNA and comparison of the deduced amino ac id sequences
of EgPLE1 gene w ith other AG -like genes
(A) Nucleotide and deduced amino acid sequences of EgPLE1 cDNA
MA DS, I, K and C domains are underlined and def ined by s ingle, double, w ave and dash line, respec tively. The arrow s under
sequences indicated primer sites, and the pos it ions of the nuc leotides and amino acids are show n on the left and the r ight,
respectively
(B) Comparison of the deduced amino acid sequences of EgPLE1 gene w ith other AG -like genes
The MADS- and K-domains are boxed, as are the AG motif I and AG motif II regions. The consensus amino ac ids are indicated by
as ter is ks
A
B
423徐启江等: 草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析
图 6 EgSEP3-1 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与其它 SEP- like的同源性比较
(A) EgSEP3-1 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
MA DS、I、K、C结构域分别用单、双、波浪和点线标记, 箭头标注的序列为引物序列, 左右两侧的数字分别标注核苷酸及氨基酸
的位置;
(B) EgSEP3-1 cDNA推导的氨基酸序列与其它SEP- like的同源性比较
MA DS区、K区以及SEP基序 I、SEP/A GL6基序和SEP基序 II分别用方框标注, 星号表示保守氨基酸
Figure 6 Nuc leotide and deduced amino ac id sequences of EgSEP3-1 cDNA and compar ison of the deduced amino acid
sequences of EgSEP3-1 gene w ith other SEP-like genes
(A) Nucleotide and deduced amino acid sequences of EgSEP3-1 cDNA
MA DS, I, K and C domains are underlined and def ined by s ingle, double, w ave and dash line, respec tively. The arrow s under
sequences indicated primer sites, and the pos it ions of the nuc leotides and amino acids are show n on the left and the r ight,
respectively
(B) Comparison of the deduced amino acid sequences of EgSEP3-1 gene w ith other SEP-like genes
The MA DS- and K-domains are boxed, as are the SEP motif I, SEP/AGL6 motif and SEP motif II regions . The consensus amino acids
are indicated by asteris ks
A
B
424 植物学通报 25(4) 2008
425徐启江等: 草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析
组织中起始表达, 早于 SEP3表达; 而 SEP3主要在内
三轮花器官的原基中表达。随着花原基的发育, SEP1
和 SEP2在四轮花器官中均表达, 而 SEP3仅在花瓣、
雄蕊和雌蕊中表达, SEP4 主要在萼片中表达。本实验
结果显示, EgSEP3-1表现出 SEP1 和 SEP2 基因的
表达模式, 有待于通过原位杂交进一步分析。
3 讨论
开花是有花植物或被子植物的中心特征属性, 需要众多
转录因子的参与, 从拟南芥和金鱼草等模式植物中已克
隆鉴定了大量花器官特征属性基因。如 A 功能基因有
拟南芥中的APETA LA1 (AP 1)和 AP 2, 金鱼草中的
S Q U A MO U S (S Q U A )、L I P LE S S 1 (L I P 1 )、
LIPLESS2 (LIP2), 其中 LIP1 和LIP2是AP2的同源基
因, 具有部分 A功能(Keck et al. , 2003); B功能基因有
拟南芥中的 A P3 和 P I S T I LLT A (P I ) , 金鱼草中的
DEFICIENS (DEF)和GLOBOSA (GLO); C功能基因有
拟南芥中的AGA MOUS (AG ), 金鱼草中的PLE NA
(PLE)和 FARINELLI (FAR); D功能基因有拟南芥中的
SEEDSTICK (STK)和 SHATTERPROOF1/2 (SHP1/
2), 矮牵牛中的 FLORAL BINGDING PROTEIN7/11
(FBP7/11); E 功能基因有拟南芥中的 SEPALLA1/2/3/
4 (SEP1/2/3/4), 金鱼草中的 DEFH49/72/200, 矮牵牛
中的 FBP2/4/5/9等。除 AP2及其同源基因外, 其它花
器官特征基因均为MADS-box (MCM1、AGAMOUS、
DEFICIENS、SRF)基因(Theissen et al., 2000)。这
些基因属于 Type I I基因, 由保守程度不一的 MADS-
box、I、K 和 C结构域组成, 又称MIKC-type MADS-
box基因(Alvarez-Buy lla et al. , 2000; Kers tin et al. ,
2005; Soltis et al. , 2007)。由于M、I、K 和 C结构
域的蛋白质间以及蛋白质与 DNA 之间的相互作用构成
了花的形态多样性(W inter et al. , 2002; Kaufmann et
al., 2005)。为阐释草原龙胆花器官发育的分子机制, 作
者用3-RACE技术成功克隆了参与草原龙胆花器官发育
的MADS-box 基因 (图 3-6)。序列比对和聚类分析结
果表明, EgDEF1和 EgGLO1、EgPLE1、EgSEP3-
1分属 B、C、E 功能基因(图 7 )。
作为转录因子的蛋白质具有高度保守的DNA 结合
域和蛋白质间相互作用所必需的基序, 但产生新的C-末
端功能域是转录因子功能多样化的关键(Nakamura et
图 7 以邻位相连法构建的植物MA DS-box 蛋白的系统发生树
用 1 000个重复进行 bootstrap检验, 结点部位的值代表可信度, 草原龙胆的MA DS-box蛋白用方框标注
Figur e 7 The phylogenetic tree of plant MADS-box genes resulting from the neighbor- joining method
The numbers next to the nods present boots trap values from 1 000 replicates, the MADS-box proteins of Eus toma grandif lorum are
boxed
图 8 草原龙胆MA DS-box基因器官特异性表达的RT-PCR 检测
以延伸因子EF-1a 基因和肌动蛋白ACTIN基因作为内参
R: 根; S: 茎; L: 叶; Se:萼片; Pe: 花瓣; St: 雄蕊; Ca: 心皮; Ov: 胚
珠
Figur e 8 Gene-spec if ic RT-PCR analys is of organ-spec if ic
expression of MADS-box genes of Eustoma grandif lorum
EF-1a and ACTIN w ere selected as internal s tandards
R: Root; S: Stem; L: Leaf; Se: Sepal; Pe: Petal; St: Stamen; Ca:
Carpel; Ov: Ovule
®
426 植物学通报 25(4) 2008
al. , 2005; 崔荣峰和孟征, 2007)。Kramer等(1998)研
究发现, B 功能基因的不同进化系均具有各自特异的C
末端基序。聚类分析结果显示, EgDEF1基因的 C末端
具有 PI-derived基序和 euAP3基序, 属于 euAP3型基
因; 而 EgGLO1基因的 C末端只具有 PI基序, 属于 PI
型基因。有关 EgDEF1和 EgGLO1的 C末端基序在蛋
白质间发生相互作用的功能有待于进一步研究。
AG亚家族在进化过程中发生了 2次主要的基因重
复事件。第 1 次基因重复事件的结果产生了 A G 和
AGL11进化系。AG进化系经历第 2次基因重复事件
产生 euAG和 PLE 进化系(Kramer and Hall, 2005;
Zahn et al., 2006)。在 euAG和 PLE 进化系中, 拟南
芥中的 A G 与金鱼草中的 P L E 是旁系同源基因
(paralogous gene), 拟南芥的 SHP1/2是金鱼草中PLE
的直系同源基因(orthologous gene)。这些不同类型的
基因在序列上十分相似, 即使在保守性较差的C末端, 仍
然拥有 2个保守区域: AGI和 AGII基序(Kramer et al. ,
2005)。我们从草原龙胆中克隆的EgPLE1基因同样具
有AG亚家族成员保守的序列结构特点 (图5), 但未发现
具有MD基序(Yun et al., 2004)。
SEP-l ike MADS-box基因的 C末端同样具有保守
的 C末端功能域, 如 AGL2基序、ZMM3基序和 ZMM7
基序等(Vandenbussche et al. , 2003)。Zahn等(2005)
报道 SEP-l ike基因的C末端具有保守的SEPI和SEPII
基序。Kanno等(2006)又将 SEPI基序细分为SEPI和
SEP/AGL6基序, SEPI基序的保守程度要高于SEPII基
序。这说明 SEPII基序具有另外的功能, 而 SEPI基序
是 SEP -l ike基因发挥原始功能所必需的。EgSEP3-1
具有保守的 SEPI、SEP/AGL6和 SEPII基序, 是典型
的 SE P -l i ke基因。
系统进化分析结果显示, EgDEF1属于 DEF/AP3-
like亚家族中 euAP3进化系成员, EgGLO1属于GLO/
PI -l ike亚家族中PI 进化系成员。RT-PCR分析表明,
这 2 个基因主要在花瓣和雄蕊中高丰度表达, 但在萼
片、心皮和胚珠中表现出不同的表达模式。EgDE F1
基因几乎参与了四轮花器官的发育。在金鱼草中, DEF
mRNA在萼片原基发育阶段就可检测到, 尽管在花瓣和
雄蕊中高丰度表达, 但在萼片和心皮中也有微量表达; 在
花发育的后期, DEF mRNA同样能够维持表达(Adam et
al. , 2007)。GLO mRNA 的表达最早在萼片原基出现
时就可检测到, 它在花瓣和雄蕊中高丰度表达, 在心皮的
发育早期也有表达(Adam et al. , 2007)。
EgPLE1 基因属于 AG亚家族中的PLE 进化系成
员(Kramer and Hall, 2005), 具典型 C功能基因的表达
模式, 即在雄蕊和心皮中高丰度表达, 控制雄蕊和心皮的
发育。旁系同源基因 AG和 PLE 在决定雄蕊和心皮的
特征上具有非常相似的功能。金鱼草的 FAR是拟南芥
AG的直系同源基因, 促进了雄蕊的发育(Kramer et al.,
2004; Caus ier et al., 2005)。
EgMADS1 属于AGL11进化系成员, 主要控制胚珠
的发育。Tzeng等(2002)的 Northern blot t ing结果表
明, E gMA DS 1 在心皮和胚珠中高丰度表达, 说明
E gP LE 1 和 E gMA DS1 可能协同控制心皮的发育。
EgPLE1 和EgMADS1在控制心皮特征中表现一定的功
能冗余, 有各自不同的作用, 如同矮牵牛的 pMADS3和
FBP6的功能 (Kapoor et al., 2002)。拟南芥的AG、
金鱼草的 FARINELLI (FAR)、矮牵牛的PMADS3 属
于 euAG进化系成员。拟南芥的SHP1/SHP2 (曾命名
为 AGL1/AGL5)、金鱼草的 PLE、矮牵牛的 FBP6 属
于 P LE 进化系成员。拟南芥的 S T K (曾命名为
AGL11)、矮牵牛的 FBP7和 FBP11 属于 AG-l ike 进
化系成员。C/D (AG-l ike)亚家族成员的 C-末端结构域
中具有保守的 AGI和 AGII基序(Kramer et al. , 2004)。
拟南芥中的AG、SHP1/ SHP 2、ST K 的序列有着高
度一致性。在控制心皮发育上, AG 和 SHP1/SHP2 表
现出一定的功能冗余性。SHP1/SHP2和 STK 共同控
制胚珠的发育, SHP1/SHP2 兼有 C和D 两种功能。引
发表达模式修饰的基因重复, 在花同源异型基因的功能
多样化中起关键作用。
草原龙胆 SEP-l ike基因 EgSEP3-1在四轮花器官
和胚珠中均特异表达, 且表达丰度相对一致, 这与模式植
物拟南芥 SEP3 的表达模式有所差异。SEP 作为花器
官同源异型基因 ABCD的共因子(co-fac tor)在各轮花器
官决定中发挥作用(Pelaz et al. , 2000)。各进化系的
427徐启江等: 草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析
表达模式存在差异(Malcomber and Kellogg, 2005)。例
如, 加州婴粟(E s c hs c h o l z i a c a l i f o rn i c a )中的
EScaAGL9在萼片原基起始后开始表达, 主要集中在花
瓣、雄蕊和心皮原基中, 并且在花的发育过程中持续表
达, 该基因在发育的种子中也有很高的表达水平(Zahn et
al., 2006)。虽然 E 类基因的表达模式在被子植物不同
的物种中有差异, 但该基因对所有花器官的发育都是必
需的, 这一功能是十分保守的。
调控花器官发育的 MADS-box 基因在不同物种中
行使功能的时空模式呈现多样化特征。我们通过
RACE 技术克隆了调控草原龙胆花器官发育的 MADS-
box基因, 并对其亚家族的分属及其功能基序进行了分
析。但有关其时空表达模式和功能 , 还有待于利用
Northern杂交和基因敲除等策略进行深入研究, 并最终
为阐明草原龙胆花器官发育的分子调控机理奠定基础。
致谢 承蒙日本东北大学生命科学研究科菅野明
(Akira Kanno)教授的热情支持 , 在此深表谢意。
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Abstr act Plant MADS-box genes are a family of highly conserved transc ription fac tors involved in many different developmental
processes, including f low er development. To elucidate the molecular mechanisms of f loral development in the dicoty ledonous
spec ies lisianthus (Eustoma grandi florum), w e isolated cDNA of f our f low er-spec if ic MA DS-box genes from this plant by the
method of 3 rapid amplif ication of cDNA ends using degenerate pr imers designed according to the MADS-box protein family
conserved region from f low er buds . Sequence and phy logenetic analysis indicated a high degree of predic ted protein sequence
identity w ith DEF f rom Antirrhinum majus, FBP3 and FBP6 from Petunia, and SEP3 f rom Arabidops is thal iana. The f our genes
w ere termed EgDEF1, EgGLO1, EgPLE1 and EgSEP3-1, respectively. Alignment of the predic ted amino acid sequences from
these genes, as w ell as w ith that from previously published subfamily members , revealed the MADS, intervening (I) and keratin-like
(K) domains. Gene-specif ic RT-PCR perf ormed w ith RNA isolated from the vegetative organs and f loral organs revealed both
EgDEF1 and EgGLO1 s trongly expressed in petals and stamens. EgDEF1 expression w as strongly detec ted in sepals and ovules,
but EgGLO1 express ion w as w eak in sepals and not detected in ovules. EgPLE1 is specif ically expressed in stamens, carpels,
and ovules , but the expression in stamens w as low . EgSEP3-1 w as strongly expressed in four f low er w horls . Thus, the four
MA DS-box genes are expressed specif ically in the f loral organs of lis ianthus.
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* Author for correspondence. E-mail: lyhshen@126.com
(责任编辑: 白羽红)
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