全 文 :植物学通报 2006, 23 (4): 374~379
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2006-03-13; 接受日期: 2006-05-10
基金项目: 浙江省自然科学基金(302785)和浙江省科技计划重点项目(001101110)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: jinjiesun@163.com
.实验简报.
NO和茉莉酸甲酯对黄芩悬浮细胞生长及黄芩苷
合成的影响
张进杰* 徐茂军
(浙江工商大学食品、生物与环境工程学院 杭州 310035)
摘要 以硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)为一氧化氮(nitric oxide, NO)的供体, 向黄芩(Scutellaria
baicalensis)悬浮培养细胞系中添加SNP和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MJ), 考察这两种诱导子在不同
的添加时间、添加浓度及混合配比使用对黄芩悬浮细胞系生长和黄芩苷含量的影响。研究结果表明:低
浓度的外源NO有利于细胞的生长, 但对黄芩苷积累无作用, 而MJ有利于黄芩苷的合成, 但抑制细胞生长,
且两者的适用浓度范围和添加时间存在差异。在细胞培养初期(0天)添加0.05 mmol.L-1 SNP, 而在细胞
生长对数中期(8天)添加10 µmol.L-1的MJ, 细胞鲜重可达到对照的1.2倍, 黄芩苷总量达到对照的2.96倍。
关键词 一氧化氮, 茉莉酸甲酯, 黄芩细胞, 诱导子, 黄芩苷
Effects of Nitric Oxide and Methyl Jasmonate on the Baicalin
Production and Cell Growth in Suspension Cultures
of Scutellaria baicalensis
Jinjie Zhang*, Maojun Xu
(College of Food Science and Biotechnology and Environmental Engineering,
Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035)
Abstract We studied the influence of nitric oxide (with sodium nitroprusside used as the donor) and
methyl jasmonate on the baicalin formation in and growth of suspension cultures of Scutellaria
baicalensis cells. Nitric oxide could not enhance the accumulation of baicalin, but low concentrations
promoted cell growth. Methyl jasmonate greatly enhanced the accumulation of baicalin and restricted
the growth of cells. Maximal baicalin production was achieved with 0.05 mmol.L-1 sodium nitroprus-
side and 10 µmol.L-1 methyl jasmonate added at days 0 and 8, respectively; fresh weight and total
baicalin yield was 1.2- and 2.96-fold higher, respectively, than in untreated cell cultures.
Key words nitric oxide, methyl jasmonate, Scutellaria baicalensis , suspension cells, elicitor
baicalin
黄芩(Scutellaria baicalensis)为唇形科
(Labiatae)黄芩属(Scutellaria)植物,其干燥根是
我国的传统中药,最早收载于《神农本草经》
,被列为草根的上品。黄芩的有效成分主要包
括黄芩苷和黄芩素等多种活性物质。据报道,
黄芩有清热燥湿、泻火解毒、止血和安胎的
功能 (丁如贤和张汉明, 1998)。黄芩苷可有效
抑制前列腺增生,很可能成为治疗前列腺增生理
3752006 张进杰 等: NO和茉莉酸甲酯对黄芩悬浮细胞生长及黄芩苷合成的影响
想的药物 (戴岳等, 2003); 黄芩苷元和千层纸黄
素A分别对大肠癌细胞WiDr的增殖和人宫颈
癌细胞HeLaS3具有强烈抑制作用 (西井奈绪美,
2004; 小西真由子, 2004); 黄芩配合其他中药治
疗肝癌有特效 (唐由君等, 2004)。因此大规模
开发黄芩, 将会有很大的经济效益和社会效益。
但是, 目前, 我国的野生黄芩资源由于过度开垦,
产量日趋下降,有的产区种群已濒临灭绝, 而人
工栽培黄芩存在生产周期长、成活率低、农
药残留超标和有效成分较低等弊端。因此, 利
用植物组织培养技术对黄芩进行悬浮细胞培养
来生产其有效成分将是解决目前黄芩供需矛盾
的有效途径之一。
目前, 国内关于黄芩的组织培养研究已有
报道, 并建立起稳定的愈伤组织培养体系 (吴晓
玲等, 2005a, 2005b), 为工业化生产黄芩活性物
质提供了可行的条件。诱导子作为一种特殊
的生化信号, 植物次生代谢过程中, 能快速、专
一和有选择地诱导某些特定基因的表达, 从而调
节细胞中次生代谢产物的合成。因此, 通过向
黄芩悬浮系中添加诱导子, 期望能够进一步提高
培养物中黄芩苷的含量, 从而降低黄芩苷的生产
成本, 满足工业化生产的要求。NO是一类脂
溶性的可扩散小分子物质, 可以作为细胞内或细
胞间的信号分子。NO在人体及动物神经、心
血管和免疫系统中的作用已引起了人们的广泛
关注。最近的研究表明, 植物细胞中存在着与
哺乳动物类似的NO合酶(nitric oxide synthase,
NOS) (Guo et al., 2003)。由NOS催化形成的
NO在植物体内具有促进种子萌发、植株根和
叶的生长发育以及诱发植物防卫反应和防御基
因活化等多种功能。NO已成为引人注目的一
种新型植物信号分子。研究表明, NO是介导
病原物和微生物诱导子诱发植物防卫反应所必
需的信号分子之一。现已有外源NO提高药用
植物金丝桃细胞生物量及次生代谢物质含量的
报道 (徐茂军等, 2005)。茉莉酸甲酯(methyl
jasmonate, MJ)是一种非常有效的诱导子, 已在
多种药用植物细胞培养中使用, 效果显著(Kang
et al., 2004; Wang et al., 2004; 徐亮胜等, 2005)。
但在黄芩悬浮细胞中的研究尚未见报道。本
研究以硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)作为
NO的供体, 用SNP和MJ处理黄芩悬浮细胞, 比
较系统地研究了外源NO和MJ对黄芩悬浮细胞
生长及对黄芩苷合成的影响。
1 材料和方法
1.1 植物材料及培养条件
新鲜黄芩(Scutellaria baicalensis)由杭州市
药物种植场提供。黄芩愈伤组织由本实验室
诱导选育。将在MS固体培养基上稳定继代两
年的愈伤组织培养12天后, 转入含有50 mLMS
培养液的250 mL的三角瓶中进行悬浮培养, 摇
床转速90 r.min-1,培养温度(25±1)℃, 光强为
45 mmol.m-2.s-1。接种量约为60 g.L-1鲜种,培
养液中附加 1× 10-5mol.L-1 NAA和 1× 10-6
mol.L-1 BA, 3%蔗糖, pH6.0(灭菌前)。每隔15
天继代 1 次。
1.2 黄芩悬浮细胞的诱导子处理
硝普钠(SNP)和茉莉酸甲酯(MJ)购自上海
百灵威公司, 以SNP作为一氧化氮(NO)的供体,
SNP用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)
配成溶液, 经0.22 mm滤膜过滤后直接加入到灭
菌后的培养基中, 或在细胞培养的不同时期添加
到培养基中。控制 SNP的添加量使培养液中
SNP浓度达到所需值。茉莉酸甲酯的处理与
SNP相同。
1.3 悬浮细胞生长的测定
悬浮细胞每2天收获1次, 用蒸馏水冲洗3
遍, 减压抽滤至不滴水后称得鲜重(fresh weight,
F W )。
1.4 黄芩苷含量的测定
黄芩苷的提取和含量测定方法参照苏健等
(2005), 稍做改进。将烘干细胞样品碾磨, 取
0.5 g黄芩干细胞粉用甲醇超声提取2次, 每次
干细胞:甲醇为1:100(W:V); 混合2次提取液减压
376 23(4)
长及黄芩苷合成的影响
细胞接种前分别向培养基中添加 0 、1 、
5 、10 、20、50和 100 µmol.L-1的茉莉酸
甲酯, 在培养过程中发现MJ随着浓度的增加对
黄芩悬浮细胞生长的抑制作用逐渐加强, 在第
12天测得鲜重, 结果如图 4, 这与Yukimune等
图 1 黄芩悬浮细胞生长及黄芩苷的动态变化
Fig. 1 Kinetics of growth and accumulation of baicalin
content in suspension cultures of Scutellaria
baicalensis
图2 不同浓度硝普钠处理下黄芩悬浮细胞生长曲
线
Fig. 2 Growth curve of Scutellaria baicalensis sus-
pension cells treated with different concentrations of
sodium nitroprusside (SNP)
SE of FCW<10%, n=3
浓缩至浸膏状, 用甲醇溶解定容至50 mL, 过
0.45 mm有机滤膜, 进高效液相仪检测, 采用C18
柱并进行全波长紫外扫描, 在280 nm处有最大
吸收, 与文献(苏健等, 2005)报道的结果一致。
黄芩苷标品购自浙江中药材鉴定所。测得其
标准曲线为y=33987x+21.919(r=0.99955), 其中x
为黄芩苷浓度(单位: mg.L-1), y为对照品峰面积
分值, 曲线适用浓度为0.0244~0.244 mg.L-1。
依此算出各黄芩干细胞样品中黄芩苷含量。
2 结果
2.1 悬浮细胞生长与黄芩苷积累的动态变
化
悬浮培养细胞的生长周期约为16天, 初期
生长缓慢, 4天后生长速度增加, 至10天左右生
长速度开始降低, 第12天达到最大鲜重(图1)。
整个生长周期黄芩苷含量变化如图1所示, 在细
胞培养前期, 黄芩苷含量逐渐降低, 到第4天为
最低, 然后随着细胞的迅速生长而逐渐升高, 12
天以后达到最高, 为 13.97 mg.g-1 (DW)。
2.2 NO对黄芩悬浮细胞的生长及黄芩苷
积累的影响
以SNP为NO的供体, 在细胞接种前分别向
培养基中添加浓度为 0.01、0.05、0.1、1和
10 mmol.L-1的SNP, 考察不同浓度的SNP对黄
芩悬浮细胞生长的影响, 结果如图2, 低浓度的
SNP对黄芩悬浮细胞的生长具有明显的促进作
用, 表现为细胞生长的延滞期缩短, 细胞生长速
度和细胞鲜重都大于对照, 且在浓度为 0.05
mmol.L-1时效果最佳, 第10天就达到细胞鲜重
最大值。高浓度的SNP(10 mmol.L-1)对黄芩细
胞生长则有明显的抑制作用, 这与徐茂军等
(2005) 报道的结果类似。另外, 在第12天同时
测定了黄芩苷含量, 结果如图3, 得出NO对黄
芩细胞中黄芩苷含量变化无显著影响。所以
确定0.05 mmol.L-1为促进黄芩细胞生长的最
佳浓度。
2.3 茉莉酸甲酯(MJ)对黄芩悬浮细胞的生
3772006 张进杰 等: NO和茉莉酸甲酯对黄芩悬浮细胞生长及黄芩苷合成的影响
入MJ又太晚, 黄芩苷含量只增加了 36%。这
说明MJ的添加时间不同对NO促进细胞生长作
用和细胞次生代谢物的合成有很大的影响。
3 讨论
N O 是动物体内一种重要的信号分子
(Guan and Lin, 1999), 其在动物体内的作用已为
图3 不同浓度硝普钠处理下黄芩悬浮细胞中黄芩
苷的含量
Fig. 3 Baicalin accumulation in Scutellaria baicalensis
suspension cells treated with different concentrations
of sodium nitroprusside (SNP)
图 4 不同浓度的茉莉酸甲酯对悬浮细胞的影响
Fig. 4 Effect of different concentrations of methyl
jasmonate (MJ) on fresh cell weight, baicalin content in
suspension culture of Scutellaria baicalensis
(1996)和徐亮胜等(2005)报道MJ作为诱导子, 对
细胞生物量有明显的抑制作用的结果类似。
MJ在1~20 µmol.L-1范围内, 细胞鲜重随着MJ
浓度的增加逐渐降低, 但下降幅度不大(FW<8%,
图4)。当MJ浓度为50 µmol.L-1 时, 细胞鲜重
降低为对照的70.2%。当MJ浓度为100 µmol.
L-1时, 在添加后2天, 培养基出现浑浊, 细胞逐
渐褐化死亡。这说明1~20 µmol.L-1为MJ浓
度的适用范围。在第12天测定黄芩苷含量, MJ
浓度为10 µmol.L-1时黄芩苷含量最高(32 mg.
g-1 DW, 图 4), 为对照的 2.2倍, 因此确定 10
µmol.L-1为MJ的最佳浓度。
2.4 不同时期添加硝普钠(SNP)和茉莉酸
甲酯(MJ)对黄芩悬浮细胞生长及黄芩苷产
量的影响
以上实验结果表明, 低浓度的NO能够促进
黄芩悬浮细胞的生长, 但对黄芩苷合成无促进作
用, 而高浓度的MJ对黄芩悬浮细胞中黄芩苷的
合成有促进作用, 但抑制细胞的生长。为了获
得黄芩细胞生长总生物量和黄芩苷含量的最佳
产出效果, 我们在细胞培养初期添加低浓度的
SNP(0.05 mmol.L-1), 并在细胞培养的不同时期
分别加入10 µmol.L-1的MJ, 培养12天后, 测定
细胞鲜重、黄芩苷含量和单位体积培养液中
黄芩细胞总黄芩苷含量, 结果如图5, 在培养0、
2和4天添加MJ, 细胞鲜重只有对照的101.9%、
103.8%和 107.1%, 而在 6、8和 10天添加, 细
胞鲜重达到对照的114.9%、118.5%和120.9%,
说明在促进细胞生长作用上MJ对NO有削减作
用, 且在细胞进入对数期前加入MJ比在细胞对
数期中和对数期后加入影响要大, 这与Javier等
(2003) 的报道结果相类似。但在黄芩苷合成方
面发现, 在细胞生长指数中期加入MJ作用最为
明显, 即第8天加入MJ黄芩苷含量和总量分别
为对照的2.5和2.96倍。这与鲁明波等 (1998)
在红豆杉培养中加真菌诱导子提高紫杉醇合成
量的现象相似。加入MJ过早细胞生长受到抑
制, 且细胞黄芩苷含量也没达到最高, 10天后加
378 23(4)
人们所熟知。最近的研究报道表明植物也具
有合成NO的能力 (Guo et al., 2003)。NO在植
物生长发育、种子萌发和抗病反应中的作用
引起了研究者的广泛重视 (Hu et al., 2003; Xu et
al., 2004)。本文研究结果表明, 0.05 mmol.L-1
的SNP处理对黄芩细胞生长具有明显的促进作
用, 而高浓度的SNP处理对黄芩细胞生长具有
抑制作用。虽然目前对NO影响植物细胞生长
的作用机制尚不十分清楚, 但这种现象似乎是普
遍存在的。Anderson和Mansfield (1979)发现
用低于2.0×10-5 mol.L-1的NO处理番茄植株
可以促进其生长, 而当NO浓度超过4.0×10-5
mol.L-1时则抑制番茄的生长, 在豌豆和莴笋等
植物中也发现类似的情况 (Hufton et al., 1996;
Leshem et al., 1996)。
MJ作为植物防御反应的信号分子, 诱导植
物中与抗逆有关的多种次生代谢物的积累
(Wang et al., 2004; Kang et al., 2004; 徐亮胜等,
2005), 本研究表明MJ对黄芩细胞中黄芩苷含量
的积累的诱导作用非常明显, 但对细胞的生长却
有抑制作用。为提高黄芩细胞中黄芩苷总产
量, 本研究结合NO和MJ两种不同诱导子对黄
芩细胞诱导的不同特点, 进行配比使用, 以期达
到最佳效果。由于诱导子作用的效果还依赖
于培养细胞的生理状态, 不同的诱导子只有在细
胞处于一定生长时期才有最佳诱导效果。本
研究结果表明, 在黄芩细胞生长初期加入合适的
NO供体SNP(0.05 mmol.L-1)有利于黄芩细胞生
长抑滞期的缩短和细胞总鲜重的提高; 在细胞
对数中期(第8天)加入适量的MJ(10 µmol.L-1)
对黄芩细胞鲜重影响最小, 诱导黄芩苷合成效果
最好, 黄芩苷总量达到最高。说明在黄芩细胞
生长对数期接受MJ信号能力最强, 且相对于在
黄芩细胞生长前期(0、2、4和 6天)加入MJ
对抑制NO促进细胞生长作用弱, 这可能是黄芩
细胞生长的不同时期对诱导子MJ和NO的信
号接受能力不同, 有关机理还需进一步研究。
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图 5 在已添加硝普钠(0.05 mmol.L-1)细胞的不同
时期添加茉莉酸甲酯 (10 µmol.L-1)对黄芩悬浮细胞
生长及黄芩苷产量的影响
Fig. 5 Effects of methyl jasmonate (MJ) (10 µmol.
L-1) added as different growth stages on baicalin pro-
duction and fresh weight(FW) in suspension cell cul-
tures Scutellaria baicalensis, which already added so-
dium nitroprusside (SNP) (0.05 mmol.L-1)
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(责任编辑: 孙冬花)