全 文 ：植物学通报 2006, 23 (3): 275~280
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-12-22; 接受日期: 2006-03-09
基金项目: 北京市自然科学基金(5050001)和北京市科技发展计划项目
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: liufan@nercv.com
.组织培养简讯.
结球白菜下胚轴原生质体培养及其体细胞胚植株再生
刘凡1* 赵泓1　　秦帆2
(1国家蔬菜工程技术研究中心 北京 100089) (2四川省农业科学院园艺研究所 成都 610066)
摘要 结球白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis)的原生质体培养由于基因型依赖性强, 细胞易褐化,
愈伤组织的芽诱导率低等而难于再生植株。本实验以结球白菜的下胚轴原生质体为试材, 研究了影响其
细胞分裂及愈伤组织形成的因素, 探索了经过体细胞胚发生途径获得再生植株的技术。结果表明, 试材
的基因型及培养基组成影响细胞分裂及褐化; KM8P是结球白菜原生质体培养更适宜的培养基, 能显著
减轻细胞的褐化; 液体培养基中一定浓度的活性炭能在一定程度上减轻细胞褐化进程, 并有利于星状细
胞团的形成; 基因型Asko中, 愈伤组织形成体细胞胚的结构, 其发生的频率约为5%, 该类体细胞胚能全
部顺利地发育成完整植株。本技术具有再生植株形成容易、频率较高且通过体细胞胚发生途径等优点。
关键词 结球白菜, 体细胞胚, 原生质体培养, 植株再生
The Protoplast Culture of Brassica campestris ssp. pekinensis and
Plant Regeneration via Somatic Embryogenesis
Fan Liu 1*, Hong Zhao 1, Fan Qin 2
(1 National Engineering Research Center for Vegetables, Beijing 100089)
(2 Institute of Horticulture, Sichuan Academy of Agricultural Science, Chengdu 610066)
Abstract Some factors blocking the protoplast regeneration of Brassica campestris ssp. pekinensis
include genotype-dependent cell browning and low frequency of shoot induction. Screening for a
genotype that is easy to culture and establishing an experimental system for efficient shoot induc-
tion will greatly benefit the genetic innovation of B. campestris ssp. pekinensis via somatic
hybridization. Hypocotyl protoplasts of several varieties of B. campestris ssp. pekinensis were
cultured, and factors influencing cell division and browning were studied. Cell division and brown-
ing were influenced heavily by genotypes of materials and the culture media used. KM8P medium
effectively reduced the browning tendency of the cells and was a good medium for protoplast
culture of B. campestris ssp. pekinensis. Activated charcoal had a specific function of reducing
cell browning and promoting the star-shaped microcalli formation. The somatic embryos were
observed on calli of the genotype Asko in shoot-inducing medium containing 3 mg.L-1 AgNO3,
with a frequency of about 5%. Intact plants were developed easily from the embryos. This proce-
dure has advantages in easily regenerating plants with relatively high frequency via a somatic
embryogenesis pathway.
Key words Brassica campestris ssp. pekinensis, somatic embryogenesis, protoplast culture, plant
regeneration
276 23(3)
结球白菜(Brass ica campestr is s sp .
pekinensis)是我国乃至整个亚洲地区最重要的
蔬菜类群之一, 但是在生产上易受到多种细菌及
真菌病害的侵害, 体细胞杂交为在白菜中创造新
的抗原材料提供了途径。
芸苔属作物中, 属于AA基因组的白菜类
作物被公认为是最难于进行生物技术操作的, 其
组织培养离体再生比较困难, 原生质体培养植株
再生频率很低(Glimelius, 1984), 甚至仅能获得愈
伤组织及分化出根(Ulrich et al.,1980; Guo and
Schieder,1983; Zhao et al., 1995)。Khan 等(1998)
在B.campestris 中利用下胚轴原生质体获得了
再生植株, 但再生植株生根困难。侯喜林等
(2001)利用子叶及下胚轴原生质体进行了不结
球白菜的种内杂交, 转移胞质雄性不育性状, 获
得了再生植株, 但愈伤组织的不定芽分化频率
最高为5.5％, 而不定芽的植株再生能力仅为
1.4%。即使在B.campestris中建立了有较高植
株再生频率的技术体系, 也都是在油用类型
(oilseed type)上的工作(李世君等, 1994; Zhao et
al., 1995)。所有关于叶用白菜类作物原生质体
培养的报道也证明了它在不定芽分化及植株再
生上的难度, 因此找到一个具有良好的原生质体
培养能力的叶用白菜基因型, 并建立一套具有较
高不定芽诱导及植株再生频率的试验体系, 是开
展白菜类这一我国重要蔬菜类型的作物体细胞
杂交遗传改良的基础条件。
本文报道了结球白菜下胚轴原生质体培养,
经愈伤组织的 体细胞胚发生获得再生植株的技
术。本技术具有再生植株形成容易, 频率较高
的特点。就作者所知, 这是首例在白菜中观察
到的原生质体愈伤组织体细胞胚形成现象。
1 材料与方法
1.1 材料
试材为结球白菜(Brassica campestris ssp.
pekinensis)栽培品种, 其中Asko 来自德国作物
育种中心园艺作物研究所, 品质较好, 但对多种
十字花科常见病害感病。1138、1140和 98-3-
92来自本中心白菜育种组, 均为具有小孢子培
养高胚状体发生能力的材料。种子用含活性
氯的1%的次氯酸钠溶液消毒15分钟后, 在MS
基本培养基上, 24℃暗培养发芽。6天后, 取下
胚轴游离原生质体。
1.2 原生质体的分离和纯化
将全部受试基因型的下胚轴切成1～5 mm
的小段, 过夜酶解细胞壁, 释放原生质体。所
用酶液为 0.1% Macerozym R-10 (Serve), 1.0%
Cellulose (Onozaku R-10), 0.4 mol.L-1 蔗糖, 于
K3基本培养基(Nagy and Maliga, 1976)(含0.25
mg.L-1 2, 4-D, 0.025 mg.L-1 NAA, 0.025 mg.L-1
6BAP, 0.25%琼脂糖)中。游离出的原生质体经
50～80 mm孔径尼龙膜过滤后, 在液面小心加入
W5溶液(Menczel et al.,1981), 120 g蔗糖密度梯
度离心5分钟, 收集完整原生质体, 再经2次W5
溶液, 100 g离心5分钟清洗后, 调整原生质体密
度为1.0×105个.mL-1, 以直径 6 cm塑料培养
皿, 每皿 2 mL进行 24℃ 暗培养。
1.3 原生质体培养及愈伤组织诱导
实验采用了2种培养基: 1/2(Ryschka et al.,
1996)(含0.5 mg.L-1 2, 4-D, 0.2 mg.L-1 NAA, 0.2
mg.L-1 6-BAP)及 KM8P (Kao and Michayluk,
1975; Glimelius, 1984) (含1.0 mg.L-1 2, 4-D, 0.1
mg.L-1 NAA, 0.1 mg.L-1 6-BAP)。针对培养中
出现的细胞团褐化问题, 在培养8天后的部分培
养皿中每皿加入100 mL活性炭悬浮液(1.0% 活
性炭悬浮在0.5% 的琼脂糖中, 用前摇匀), 以不
加活性炭的培养皿为对照。各种处理至少对3
个皿平行观察记录。当在显微镜下观察到较
多细胞进入1次分裂后, 每3天在每皿中加入400
mL稀释培养基(B5基本培养基, 150 mg.L-1水解
酪蛋白, 2 500 mg.L-1 Glucose, 125 mg.L-1 D-
Ribose, 2% 蔗糖, 激素浓度同 1/2培养基)。材
料在弱光下培养。
当细胞团有20个左右细胞时, 将其移入K3
培养基中, 继续在弱光下培养。当愈伤组织达
2772006 刘凡 等: 结球白菜下胚轴原生质体培养及其体细胞胚植株再生
到肉眼可见大小后, 进行正常光照培养。统计
每皿的愈伤组织数量作为最终植板率。
1.4 芽诱导及植株再生
愈伤组织达到1～4 mm直径时, 转入芽原
基诱导培养基(MS 无机盐类, B5有机物, 150 mg.
L-1水解酪蛋白, 3.0 mg.L-1 AgNO3, 3% 蔗糖,
0.02 mg.L-1 NAA , 2.0 mg.L-1 6BAP , 1% 琼脂)。
4周后, 愈伤组织转入芽生长培养基(MS 基本培
养基, 150 mg.L-1 水解酪蛋白, 3.0 mg.L-1 AgNO3,
3% 蔗糖, 1.0 mg.L-1 6BAP, 0.04 mg.L-1 GA3 ,
1% 琼脂)。形成的幼芽或胚状体及时转入无激
素的MS基本培养基中, 诱导植株形成。
2 结果与讨论
2.1 不同培养基及不同基因型条件下白菜
下胚轴原生质体细胞生长的差异
1/2培养基中, 培养细胞 4～5天后进入第
1～2次分裂(图 1A)。细胞的初始分裂频率在
不同基因型中无明显差异, 大约在5%～10%之
间。培养8天后, 当细胞团达到约15个细胞时,
一些基因型的细胞开始显著褐化, 一些基因型细
胞褐化较轻。褐化较重的细胞其进一步分裂
很快停止, 褐化较轻的细胞团生长也变缓慢,到
培养12天后, 仅有少量小细胞团或极少量的稍
大细胞团。KM8P培养基中, 细胞的第 1次分
裂发生在培养4天左右, 初始分裂频率与1/2培
养基中的细胞相似, 但培养8天后, 各个基因型
中细胞的褐化程度都明显较1/2培养基中轻, 细
胞分裂较快, 细胞团在培养12天后, 与1/2培养
基中的细胞团差异明显, 其色泽淡, 不少细胞团
已经呈典型的芸苔属原生质体培养的星状细胞
团。从表 1中可以看出, 细胞褐化的程度受基
因型的影响, 褐化的程度影响着细胞进一步分裂
的能力。KM8P培养基具有明显减轻细胞褐
化、促进细胞分裂的作用, 适宜于白菜的原生
质体培养。侯喜林等(2000)在不结球白菜子叶
图 1 结球白菜下胚轴原生质体培养及体细胞植株再生
A. 分裂中的结球白菜下胚轴原生质体; B. 在添加活性炭培养基中形成的星状细胞团; C. 愈伤组织上形
成的胚状体; D. 剥离下的具有胚根及子叶的胚状体; E. 自胚状体形成的植株
Fig.1 Hypocotyl protoplast culture of Brassica campestris ssp. pekinensis
A. Divided hypocotyl protoplast of B. campestris ssp. pekinensis after 4 days of culture; B. Star-shaped micro-
calli in KM8P medium with activated charcoal; C. Somatic embryogenesis on callus of Asko in shoot-inducing
medium; D. Isolated embryo with cotyledon and root; E. Plants derived from the somatic embryos
278 23(3)
原生质体培养中选用了4种基本培养基, 也发
现KM8P中的细胞褐化程度低, 细胞生长快,
认为该培养基最适合于不结球白菜的原生质
体培养。
2.2 细胞分裂阶段活性炭的作用
鉴于细胞团的褐化问题, 试图在培养基中
加入1% 活性炭琼脂糖悬浮液来减轻褐化。结
果表明, 活性炭能在一定程度上减轻细胞的褐
化, 并促进星状细胞团的形成(图1B)。但是在
不同基因型中它的效果不同, 在很容易褐化的基
因型(如 98-451和Asko)中效果不明显(表 2)。
活性炭有一定的吸附能力,能吸附培养基中
培养细胞产生的一些有害物质(如致褐化的酚类
物质等), 在白菜小孢子培养中被证明具有很好
的促进体细胞胚发生的效果(刘凡等, 2001)。但
是同时它也能吸附培养基中的其他一些有益物
质, 如糖类。它在原生质体培养中产生的促进
星状细胞团形成的效果, 可能与降低培养基中渗
透压(通过加入低渗培养基)能促进星状细胞团
形成, 提高细胞植板率的效果类似。
2.3 愈伤组织的体细胞胚发生
通常在液体培养基中15天后, KM8P培养
的4份材料中可见到较大细胞团, 在材料1140及
98-3-92中还可观察到一些细胞团呈星状。将
这些细胞团转至K3培养基中约4～5周后, 形成
大量肉眼可见的白色至淡黄色愈伤组织。愈
伤组织转移至芽原基诱导培养基中 约4～5周
后, 可见很多愈伤组织变得质地紧密, 一些愈伤
上出现根或根毛状结构。在材料Asko中, 少
数愈伤组织呈颗粒状胚性结构, 逐步有绿色胚芽
形成。将这些愈伤组织转移至芽生长培养基
中约10天后, 形成肉眼可辨的具有子叶及胚根
端形态的结构(图1C)。已经形成子叶及胚根的
体细胞胚很容易自愈伤组织上剥离出(图 1D),
接入无激素的MS基本培养基中, 20天后可以
形成正常植株(图1E)。胚性愈伤组织出现的频
率约为5％, 产生的体细胞胚基本都能形成完整
植株。该途径有效地克服了白菜类作物组织
培养再生不定芽多为畸形, 难于诱导出完整植株
的问题。
表 1 不同培养基及不同基因型下结球白菜下胚轴原生质体细胞生长的差异
Table 1 Influence of plant genotypes and culture medium on the cell browning and cell division of hypo-
cotyl protoplasts of Brassica campestris ssp. pekinensis
Genotypes Medium
Culture response of protoplasts Final plating
6 days 8days 12days efficiency*
Asko 1/2 2-8 cells Small microcalli, Growth stopped, severe brown 0
light brown
KM8P 2-8 cells Bigger microcalli, Bigger microcalli, light brown 8.0× 10-4
light brown
1138 1/2 2-4 cells No microcalli, No microcalli, severe brown 0
middle brown
KM8P 2-16 cells Many small microcalli, Bigger microcalli, light brown 6.0× 10 -4
light brown
1140 1/2 2-8 cells Small microcalli, Bigger microcalli, severe brown 2.0× 10-5
middle brown
KM8P 2-8 cells Bigger microcalli, Bigger microcalli, some with star 1.2× 10-3
no brown shape, light brown
98-3-92 1/2 2-8 cells Many small microcalli, Many small microcalli, middle 3.0× 10-5
light brown brown
KM8P 2-8 cells Bigger microcalli, Bigger microcalli, some with star 1.5× 10-3
light brown shape, light brown
* K3培养基上平均每皿的愈伤组织数 Average visible calli per dish on K3 medium
2792006 刘凡 等: 结球白菜下胚轴原生质体培养及其体细胞胚植株再生
AgNO3在愈伤组织的体细胞胚形成中可能
起着一定的作用。在白菜类作物组织培养不
定芽诱导的研究中发现, 添加适量的AgNO3能
有效促进不定芽的发生, 并提高正常不定芽的比
率(Zhang et al.,1998)。Khan等(1998)的工作也
表明, AgNO3有利于白菜原生质体再生芽的进
一步生长及繁殖。其原因可能是它能作用于
乙烯作用位点, 从而减轻培养过程中产生的乙烯
对不定芽发生及形态建成的抑制作用。
尽管几个受试基因型细胞的初始分裂能力
没有表现出明显差异, 而且在采用KM8P培养
基后都能获得愈伤组织, 但最后仅在材料Asko
中获得了体细胞胚再生植株, 其他材料中都没有
胚状体或不定芽的形成, 这表明细胞的分裂能力
和分化能力可能有不同的控制机理, 二者没有必
然联系。这个现象与Khan等(1998)在油菜及
Robertson等(1988)在甘蓝中的观察一致。此
外, 虽然在具小孢子培养能力的材料中存在能被
诱导表达的与胚胎发生相关的LEC(leaf cotyle-
don)基因①, 转入LEC1基因的幼苗能够诱导体
细胞胚形成(Lotan et al.,1998), 但本实验条件下,
具有良好的小孢子培养胚状体形成能力的几份
材料, 其下胚轴原生质体培养却未能得到胚状
体。这是由于实验条件尚不够优化, 还是不同
组织材料中基因在结构及表达上的差异所致, 或
是其他因素, 还有待进一步研究。关于Asko的
小孢子培养胚状体发生能力也是一个值得研究
的相关问题。
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表 2 活性炭对结球白菜下胚轴原生质体细胞培养的影响
Table 2 Influence of activated charcoal(AC) in the medium on the cell browning and cell growth of
hypocotyl protoplasts of Brassica campestris ssp. pekinensis
Genotypes Medium AC Microcalli after 12 days of culture Final plating efficiency*
1140 1/2 -AC Smaller , few with star shape, middle brown 2.3× 10-5
+AC Bigger , many with star shape, light color 4.3× 10-4
98-3-92 1/2 -AC Smaller, few with star shape, middle brown 2.0× 10-5
+AC Bigger, many with star shape, light color 3.5× 10-4
98-451 1/2 -AC Smaller, severe brown 1.5× 10-5
+AC Small, middle brown 5.0× 10-5
Asko 1/2 -AC Smaller, severe brown 1.2× 10-5
+AC Small, middle brown 6.5× 10-5
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