全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (1): 85-88, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-12-12; 接受日期: 2007-05-21
基金项目: 中国科学院西部行动高新技术项目(No. KGCX2-SW-506)
* 通讯作者。E-mail: jlf hanx ing@126.com
.组织培养简讯.
新疆雪莲体细胞胚胎发生
贾莉芳 1, 2 *, 王晓军1, 赵民安 1
1中国科学院新疆理化技术研究所, 乌鲁木齐 830011; 2中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要 通过体细胞胚胎发生途径实现了新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Ki r.)的植株再生。选用新疆雪莲子叶为外
植体, 接种于MS+0.5 m g.L-1 2 ,4-D+0.05-1 m g.L-1 BA的固体培养基上, 进行愈伤组织的诱导。从第1次继代培养的愈伤组
织中挑选出黄绿色、颗粒状、质地致密的胚性愈伤组织, 转移到含0.05-0.1 m g.L-1 2 ,4-D 的MS液体培养基中进行悬浮培养,
20天后可分化产生大量球形胚。继代过程中相继加入PEG和GA3 , 可以促进体细胞胚的分化和生长。体细胞胚在含有5 m g.
L-1 GA3 的MS固体培养基上, 可发育成完整的植株。
关键词 植株再生, 新疆雪莲, 体细胞胚胎发生, 组织培养
贾莉芳 , 王晓军 , 赵民安 (2008). 新疆雪莲体细胞胚胎发生. 植物学通报 25, 85-88.
新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir. ), 又
名雪莲花、天山总苞雪莲, 为菊科凤毛菊属一次开花结
实的草本药用植物, 在国内民族药行业中具有很高的知
名度。经分析检测证明: 雪莲全草含生物碱、黄酮、
挥发油、雪莲内酯、还原糖和 16 种氨基酸等多种药用
成分。近年来雪莲花在抗风湿、镇痛、强心、抗癌、
降压、平喘、终止妊娠、清除自由基及抗疲劳等方面
的研究取得了可喜进展。在治疗风湿疼痛症、防止心
血管疾病、延缓衰老、抗癌和计划生育等方面显示出
巨大应用潜力。除此之外, 雪莲还是一种具有独特香味
的野生香料。用雪莲香精配制的高级护肤霜, 具有增强
血液循环和抗皮肤衰老的作用(Guo et al. , 2000)。但
是近年来在经济利益的驱动下, 人为大规模的掠夺式采
挖, 使得野生雪莲数量急剧下降。加上雪莲种子自然萌
发率低、生长环境恶劣及人工栽培困难, 故雪莲被列为
国家三级濒危物种而受到保护。
本实验以新疆雪莲为材料, 在诱导产生胚性愈伤组
织后, 通过体细胞胚途径实现了新疆雪莲的植株再生, 为
其大规模人工栽培奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir.)种子取
自新疆和静地区。
1.2 愈伤组织的诱导
种子经 75%的乙醇消毒50-60秒, 0.2%的 HgCl2溶液
消毒 10分钟, 无菌水浸泡和清洗后, 接种于附加 3% 蔗
糖、0.5%琼脂粉的MS培养基(Murashige and Skoog,
1962)上。取生长 15天左右的无菌苗子叶作为外植体,
将其切成 0.5-1 cm 的小段, 接种于含有不同激素组合
的MS培养基上进行愈伤组织的诱导。培养室温度保持
在 25°C左右, 人工辅助光照 16小时 / 天, 光照强度为
2 500 mol.L-1.m-2.s-1。3周后观察各种激素组合下愈
伤组织的诱导频率及生长状况。
1.3 体细胞胚的分化及植株再生
诱导所得愈伤组织经继代培养20天后, 转入含有不同浓
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度激素的MS液体培养基中, 诱导体细胞胚发生, 接种量
为 3%(w/v), 每(7±2)天继代培养 1次。 继代培养 2-3次
后转入含有5-25 mg.L-1 PEG6000的体胚分化培养基
中。待体细胞胚发育成熟, 将其转入含有 1-5 mg.L-1
GA3的MS 固体培养基上, 促使体细胞胚的萌发。
1.4 细胞组织学观察
对培养材料定期取样, 固定于 FAA固定液中, 常规石蜡
法切片, 苏木精染色, 切片 8-10 mm, 在 Leica DMIRB
型荧光倒置显微镜下观察, 用 Canon EOS300D型数码
照相机拍照。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导
通过 2组对比实验, 着重对植物生长调节剂(BA 和 2,4-
D)对愈伤组织诱导的影响进行分析。
随着 BA 浓度的不断增加, 愈伤组织诱导率呈现递
减的趋势(表 1)。这表明过高浓度的BA会抑制2,4-D的
作用, 表现为 5 mg.L-1的 BA对 2,4-D的诱导效应产生
了抑制, 这与文献报道相一致 (Guo and Zhang, 2005)。
2,4-D浓度在 0.05-1 mg.L-1范围内均可诱导出愈
伤组织(表 2)。但诱导出的愈伤组织形态有所不同。大
致分为 3种: (1)淡黄色, 颗粒状, 质地松散; (2)透明, 水
渍状, 质地黏稠; (3)黄绿色, 块状, 质地密实。第 1种
为胚性愈伤, 后 2 种均为非胚性愈伤。
2,4-D作为一种常用的生长素, 应用于多数植物体胚
发生(朱长甫等, 1997; 崔凯荣等, 1998), 但它也具有较
强的畸化作用。因此, 本实验尝试用与其作用相当的
IBA与其它细胞分裂素配比来诱导愈伤。但后期实验结
果表明: 在 IBA与BA实验组合中, 诱导所得愈伤组织表
面发白, 质地坚硬, 为非胚性愈伤。
2.2 体胚分化及植株再生
挑选黄绿色、颗粒状、质地紧实的胚性愈伤(图 1A )转
接到内含 50 mL液态体胚分化培养基(MS+0.1 mg.L-1
2,4-D)的 250 mL摇瓶中, 进行悬浮培养。(10±2)天继代
1次。30天后, 胚性愈伤表面产生大量颗粒状的白色突
起, 此为体细胞胚发育的球形胚(图 1B, E )阶段。
此时从继代培养基中除去 2,4-D, 加入 25 mg.L-1
PEG6000。培养过程中白色突起继续延伸, 此时为体
胚发育的鱼雷形胚(图 1B)阶段。随后加入 1 mg .L-1
表 1 不同浓度BA 对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of BA on callus induction
Plant grow th No. of inoculated Callus Morphological
regulator (mg.L-1) explants induction rate character of callus
2,4-D BA (%)
0.5 0.05 40 100 Yellow ish-green or dark-green, loose
0.5 0.5 38 97.4 Yellow ish-green, dense
0.5 1 39 79.5 Light-green, dense, par tly -brow ned calli
0.5 5 41 9.8 A lit tle calli produced, explant brow ned severely
表 2 不同浓度 2,4-D对愈伤组织诱导的影响
Table 2 Ef fec t of 2,4-D on callus induction
Plant grow th No. of inoculated Callus Morphological
regulator (mg.L-1) explants induction rate character of callus
2,4-D BA (%)
0.05 0.5 38 97.4 Yellow ish-green, loose and dense
0.1 0.5 40 100 Yellow ish-green, loose, granular
0.5 0.5 39 94.9 Light-green, dense, bulk
1 0.5 42 97.6 Dark-green, dense, bulk
87贾莉芳等: 新疆雪莲体细胞胚胎发生
在本研究中, 由于悬浮培养的愈伤组织水渍化程度
高, 分化能力弱, 因而在悬浮培养后期加入了不同浓度的
PEG, 以促进体胚发育。与不添加PEG的空白组对比
发现: 愈伤组织水渍化程度降低, 胚状体发生增多, 推测
是 PEG导致细胞含水量下降、贮藏物质积累增多, 细
胞胚性增强所致。
GA3含量较高的培养基可促进较大的胚状体在短期
内生长, 呈喇叭形, 子叶型胚增多。本实验在体胚发育
后期加入 G A 3, 以促进体胚成熟。但实验中我们也发
现, 加入GA3后体胚易于褐化, 且产生的畸形胚较多, 早
期夭亡的也多, 影响成苗率。如何平衡其利弊还有待于
进一步研究。
2.3 细胞组织学观察
新疆雪莲属菊科, 双子叶植物, 因而拥有类似被子植物合
子胚发生的阶段性典型结构。从体胚发生的石蜡切片
来看, 内部细胞首先形成多细胞的原胚(图 1D), 这些细
胞表现为细胞核大, 有些细胞甚至有多个核, 且细胞质浓
厚(染色深)。随后原胚逐渐突出于表皮之外, 形成具有
独立结构的球形胚(图 1E)。在球形胚进一步发育中, 分
化细胞不断向两端集中。经过心形、鱼雷形胚, 最终
形成子叶型胚(图 1F )。
3 讨论
Sharp等(1980)把体胚发生方式概括为 2种: 一是体胚
间接发生途径, 即由外植体先诱导愈伤组织再产生胚状
体; 二是体胚直接发生途径, 即由外植体直接产生体细
胞 胚 。
本实验选用新疆雪莲无菌苗的子叶为外植体, 因而
主要通过间接发生途径获得体细胞胚, 对于从直接发生
途径获得雪莲体细胞胚, 本实验也进行了初步的尝试, 但
未获得成功。推测子叶作为植物的营养器官, 它已包含
了一些分化型的非胚胎发生型的细胞, 因此必须经过脱
分化形成愈伤组织后才能产生体细胞胚。
体细胞胚胎发生和植株再生体系在植物品种改良、
图 1 新疆雪莲体细胞胚胎发生的不同阶段
(A)胚性愈伤组织; (B)球形胚与鱼雷形胚; (C)具备根和芽的完整
植株; (D)多核细胞; (E)球形胚; (F)子叶型胚
bar=0.1 mm
Figur e 1 Stages of somatic embryogenesis of Saussurea i n-
volucrate Kar. et Kir.
(A) embryonic callus; (B) globular embryoid; (C) plantlet; (D)
multinuc leate cell; (E) globular embryoid; (F) cotyledon embry-
oid
bar=0.1 mm
GA3, 培养 10天后, 可见这些白色的小突起已分化为子
叶 状 。
将成熟体胚转接到琼脂固化培养基MS＋5 mg.L-1
GA3(琼脂 0.7%)上。培养 20天后, 体胚顶端产生萌发
芽, 底部生根(图 1C), 直接获得完整植株。
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人工种子制作和苗木繁殖等方面有重要应用价值(Att ree
and Fowke, 1993)。但是, 在体细胞胚发生系统中, 萌
发成苗难或成苗率低, 是一个经常遇到的问题, 萌发成苗
常成为体胚应用的 “瓶颈”环节。究其原因, 一般认为
是体胚的不正常发育造成的, 有的也可能是体胚休眠所
引起的(Tao, 2001)。新疆雪莲作为一种多年生植物, 其
合子胚具有休眠特性, 推测与其发生途径类似的体细胞
胚也具有休眠的特性。此外, 在培养环境中加入大量的
生长调节剂也可能会造成体胚的暂时休眠。
因此, 在本实验中, 尝试用打破种子休眠的方法, 如
对成熟体细胞胚进行冷冻处理或者加入生长调节剂赤霉
素(GA)以打破其休眠。此外, 合子胚在发育后期, 随着
水分的丧失而进入停止生长期, 这是为将来的萌发所做
的必要准备, 体细胞胚在成熟后, 一般也需经历一个类
似脱水的过程才能萌发成正常的小植株。为此本实验
在体胚发育后期采用干化法对其进行处理, 也有效地提
高了体胚的质量。然而如何进一步提高新疆雪莲成熟
体胚的质量, 减少畸形胚的发生率, 将体胚再生苗大规模
人工种植, 还有待于进一步研究。
参考文献
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Somatic Embryogenesis of Saussurea involucrata Kar. et Kir.
Lifang Jia1,2*, Xiaojun Wang1, Minan Zhao1
1 Xinj iang Institute of Physics and Chemis try, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, Chi na
2 G raduate Univers ity of Chinese Academy of Sc iences , Beij ing 100049, Chi na
Abstr act We used somatic embryogenes is to regenerate snow lotus (Saussurea invol ucrata Kar.et Kir.) . For induction of calli,
cotyledons w ere cultured on solid MS medium w ith 0.5 mg.L-1 2,4-D and 0.05-1 mg.L-1 BA. Globe-shaped yellow ish-green calli
w ere chosen from the f irst subculturing for suspension culture in liquid MS medium containing 0.05-0.1 mg.L-1 2,4-D. After 20 days
of culture, many globular embryoids w ere produced. Polyethylene glycol and gibberellic ac id (GA ) w ere added dur ing subculture
for dif ferentiation and grow th of somatic embryos . Plantlets w ere regenerated w hen somatic embryos w ere trans ferred to MS
medium w ith 5 mg.L-1 GA3.
Ke y w ords pl ant reg ene rat ion, Sa ussure a in vol ucrata Ka r. et Kir., soma tic em bryoge nesis, tissue cu ltu re
Jia LF, Wang XJ, Zhao M A (200 8). So mat ic emb ryog ene sis of Sa ussure a in vol ucrata Ka r. e t Ki r. Ch in Bull Bo t 25 , 8 5-88 .
(责任编辑: 白羽红)
* Author for correspondence. E-mail: jlfhanx ing@126.com