全 文 ：植物学通报 2005, 22 (3): 320~324
Chinese Bulletin of Botany
①国家 973项目(G1999011701)和国家自然科学基金(30270934)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: lyb@cau.edu.cn
收稿日期: 2004-04-05 接受日期: 2004-09-27 责任编辑: 孙冬花
实 验 简 报
转 Bt基因抗虫棉(Gossyposium)伤流中
Bt毒蛋白的运输①
芮玉奎 朱本忠 罗云波②
(中国农业大学食品生物技术实验室 北京 100083)
摘要 本文以常规棉品种‘石远321’和抗虫棉品种‘SGK321’与‘99B’为材料, 通过考马斯亮蓝
和ELISA方法分析了伤流中可溶性蛋白和Bt(苏云金芽孢杆菌)毒蛋白含量。结果发现, 转基因抗虫棉
伤流中可溶性蛋白含量显著高于常规棉, 并在抗虫棉伤流中检测到了Bt毒蛋白, 而常规棉伤流中没有
Bt毒蛋白的存在。通过嫁接实验研究发现, 将常规棉嫁接到转Bt基因抗虫棉砧木上, 叶片中也有Bt毒
蛋白的积累。这些结果说明, Bt毒蛋白可以通过木质部伤流液向地上部运输, 并在叶片中积累, Bt毒蛋
白由根系向地上部的运输对棉花的抗虫性是有益的。
关键词 Bt(苏云金芽孢杆菌)棉, Bt(苏云金芽孢杆菌)毒蛋白, 木质部伤流液, 嫁接
Long-distance Transportation of Bt-toxin Through Xylem
Sap in Bt-cotton (Gossyposium)
RUI Yu-Kui ZHU Ben-Zhong LUO Yun-Bo②
(Laboratory of Food Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100083)
Abstract The xylem sap was collected from the stems of regular cotton (Gossyposium cv.
‘Shiyuan321’) and Bt cotton (Gossyposium cv. ‘99B’ and ‘SGK321’), The soluble proteins and Bt-
toxin transportation were analyzed by Coomassie brilliant blue staining and ELISA, respectively.
Bt insecticidal crystal protein existed only in Bt-cotton xylem sap, and the content of soluble
proteins in xylem sap of Bt-cotton was remarkably higher than that of regular cotton. Grafting
showed that Bt toxin could be conveyed to regular cotton leaves from transgenic cotton stock
via xylem sap. Bt toxin distributed in plant tissue through xylem transportation is advantageous
in terms of cotton resistance to worms.
Key words Bt-cotton, Bt toxin, Xylem sap, Grafting
植物营养物质, 如矿质元素、植物激素
(Chen, 1990; Masia et al., 1994)和其他小分子
物质都可以通过木质部导管从土壤和根系运
输到植物地上部(Nooden and Mauk, 1987;
Satoh et al., 1992), 也可以由悬浮培养的植物
细胞分泌到培养基中(可以看作一种细胞外质
3212005 芮玉奎等: 转 Bt基因抗虫棉(Gossyposium)伤流中 Bt毒蛋白的运输
体空间)。除小分子物质以外, 蛋白质(Satoh
and Fujii, 1988; Cleve et al., 1991; Satoh et al.,
1992)和多糖(Satoh et al., 1992) 等特定的大分
子物质也可以通过悬浮培养的细胞向培养基
中分泌。同时有研究显示, 转 Bt基因玉米根
系可以向土壤中分泌Bt毒蛋白, 其分泌量最大
可以达到100 ng·g-1 (Keepak et al., 1999)。但
是转Bt基因抗虫作物外源蛋白(Bt毒蛋白)能
否通过木质部导管向上运输、其运输量以及
不同时期的运输动态尚未见报道。本文选用目
前国内普遍栽培的转 B t 基因棉花新品种
‘99B’和‘SGK321’作为研究材料, 以常规
棉‘石远 321’(‘SGK321’的亲本)为对照, 分
析了它们的木质部伤流中可溶性蛋白和Bt毒
蛋白的存在和运输动态; 特别是通过常规棉和
抗虫棉之间的相互嫁接深入研究了这种木质
部运输的真实性, 并对其意义作了初步分析。
1 材料与方法
1.1 植物材料及管理
常规棉‘石远 3 2 1’和转基因抗虫棉
‘SGK321’(Bt+CpTI), 来自石家庄农业科学
研究院, 转基因抗虫棉‘99B’(Bt)购自河北
河间棉花研究会, 分别于 2003年4月 23日以
相同的条件种植在中国农业大学科学园内。
1.2 伤流的收集
将不同生长时期的棉花茎部在距离地面
8~10 cm的部位用锋利的刀片切断(注意不要
伤及棉花根系)。在最初的3~5滴伤流由切口
处流出(弃掉不要)以后, 用蒸馏水连续冲洗切
口断面处3~5次以除去破损细胞的溢出物, 以
后溢流出的伤流用乳胶管收集到避光的试管
或三角瓶中(应当放置在冰浴中)(Cleve et al.,
1991)。每个棉花品种选择生长一致的 10株
分别收集伤流, 去掉2株最多的和2株最少的,
剩余 6个重复。伤流液用不结合蛋白质的且
孔径为0.22 mm的 PVDF(聚偏二氟乙烯)微滤膜
过滤掉可能污染伤流的杂质或细胞器, 在4 ℃
条件下用蒸馏水透析过夜, 液氮迅速冷冻, 冷
冻干燥后储藏于-40 ℃的冰箱中, 准备测定可
溶性蛋白和 Bt毒蛋白。
1.3 嫁接
嫁接时, 选取带有5~7片真叶且健康的棉
株作为砧木, 选带有2~3片真叶的棉花植株作
为接穗; 用作砧木的植株在第3或第4片真叶
处切掉地上部, 将接穗嫁接在第2片叶的叶腋
处; 接穗和接口用圆纸筒扣住避光 (王云, 1984);
操作过程和嫁接以后, 植株应当一直处在20~25
℃且90%~95%的相对湿度条件下, 当3~4片新
叶出现以后, 将砧木上的老叶全部剪掉。
1.4 可溶性蛋白和Bt毒蛋白的测定
冷冻干燥的样品用特定的样品稀释液定
溶 (Wang et al., 2000), 定溶后的溶液体积与
原伤流的体积比是 1/25。可溶性蛋白的分析
方法参照Bradford (1989); Bt毒蛋白的测定采
用ELISA方法 (Steven and Berich, 1996; Wang
et al., 2000)
2 结果分析
2.1 常规棉和转基因抗虫棉伤流中可溶性
蛋白和Bt毒蛋白含量变化动态
图 1表明在各个生长期常规棉和抗虫棉
伤流中均有可溶性蛋白质的存在, 并且前期可
溶性蛋白的含量随着棉株的生长而增加, 6月
底到8月底之间达到最高峰, 随后随着植株的
衰老又逐渐降低。在整个生长期, 转基因抗
虫棉伤流中可溶性蛋白的含量始终高于常规
棉, 尤其是在6月底到8月底之间, 转基因抗虫
棉和常规棉之间的差别最大, 在苗期和衰老期
这种差别较小。
常规棉自身不能产生 Bt毒蛋白, 所以在
它的伤流中检测不到毒蛋白的存在, 如图2所
示。但是转 B t 基因抗虫棉 (‘9 9 B’和
‘SGK321’)伤流在整个生长过程中均有 Bt
毒蛋白的存在, 并且同一品种在不同时期及不
同品种在同一时期毒蛋白含量都有所不同。
322 22(3)
在 6月 27日到 8月 27日之间, 转Bt基因抗虫
棉(‘99B’和‘SGK321’)伤流中 Bt毒蛋白
含量达到最高值, 这与伤流中可溶性蛋白含量
的动态变化具有相似性(图 1)。从 5月 27日
到 10月 27日整个检测过程中, ‘99B’伤流
中 Bt毒蛋白含量始终高于‘SGK321’。但
是不同时期它们的差别不同, 6月27日到8月
27日之间这种差别明显大于其他时期。
2.2 以转基因抗虫棉为砧木嫁接常规棉以
后地上部倒4叶Bt毒蛋白含量的测定
虽然在常规棉组织和常规棉伤流中检测
不到 Bt毒蛋白的存在, 但是在以转基因抗虫
棉(‘99B’和‘SGK321’)为砧木, 常规棉枝
条为接穗嫁接成活的植株叶片(倒4叶)中却检
测到了Bt毒蛋白的存在, 这说明Bt毒蛋白可
以通过伤流从抗虫棉根部运输到常规棉的地
上组织。以‘99B’为砧木的嫁接植株倒 4
叶Bt毒蛋白含量显著高于以‘SGK321’为砧
木的嫁接组合, 这种现象与上述2种转基因抗虫
棉伤流中Bt毒蛋白含量的差别相似 (图 3)。
3 讨论
转基因作物作为重要的抗虫作物, 自从诞
生以来对于它们的研究主要集中于新品种的
培育、植物生理和 B t 毒蛋白含量等方面
(Benedict et al., 1996; 王保民等, 2002)。但是
外源蛋白的合成部位以及毒蛋白的体内运输
尚未见报道。有研究显示, 转基因抗虫棉与
常规亲本相比其苗期生长缓慢、根系活力下
降并且极易早衰(Tian et al., 1999), 但是造成
这些缺陷的原因还不清楚。
从本试验结果可以看出, 在5月27日到10
月27日整个检测时期内, 转Bt基因抗虫棉伤
流中可溶性蛋白的含量显著高于常规棉。可
溶性蛋白作为伤流中重要的成分之一, 具有调
图 1 常规棉‘石远 321’及转基因抗虫棉‘99B’
和‘SGK321’伤流中可溶性蛋白质含量的变化
动态
1.‘石远 321’; 2 .‘99B’; 3 .‘SGK321’
Fig. 1 Content of soluble proteins in the xylem sap
from transgenic (NuCOTON99B and ‘SGK321’)
and regular cotton (‘Shiyuan321’)
1.‘Shiyuan 321’; 2. NuCOTON-99B; 3.‘SGK321’
图 2 转基因抗虫棉(‘99B’和‘SGK321’)
伤流中Bt毒蛋白含量的变化动态
1.‘石远 321’; 2 .‘99B’; 3 .‘SGK321’
Fig. 2 Content of Bt insecticidal crystal protein in
Bt-cotton xylem sap at different phases
1.‘Shiyuan 321’; 2. NuCOTON-99B; 3.‘SGK321’
3232005 芮玉奎等: 转 Bt基因抗虫棉(Gossyposium)伤流中 Bt毒蛋白的运输
节植株地上部生长发育的作用(Cleve et al.,
1991; Satoh et al., 1992), 但是可溶性蛋白含量
的增加由于消耗了大量的氨基酸和能量, 可能
不利于植株根系的生长发育; 同时植株地上部
同样合成大量的毒蛋白, 而这种蛋白质对植物
本身的生长发育没有直接作用, 这可能是转基
因作物苗期生长缓慢和根系容易早衰的重要
原因(Tian et al., 1999)。外源毒蛋白的向上
运输会增加地上部毒蛋白含量, 对抗虫棉本身
的抗虫性应该是有利的。
许多重要的物质都可以通过木质部导管
向上运输, 例如矿质营养(Nooden and Mauk,
1987)、植物激素(IAA、GA、 ABA 和CTKs)
(Chen, 1990; Masia et al., 1994; Tian et al.,
1999)、蛋白质(Satoh and Fujii, 1988; Cleve
et al., 1991; Satoh et al., 1992; Gong et al.,
2003)和糖类(Satoh et al., 1992), 并且这些物质
的运输量在不同时期有所不同。自转基因作
物产生以来, 人们的研究主要集中于新品种的
培育, 而忽略了外源毒蛋白转运和代谢。本
研究结果表明, 在所研究的2个转Bt基因抗虫
棉品种的伤流中有外源毒蛋白的存在, 但是常
规棉品种中检测不到它的存在, 说明转基因
作物的外源蛋白可以通过根系合成并分泌
到伤流液中再运输到地上部, 运输到地上部
的毒蛋白所起的作用和最终去向仍需要更
深入的研究。
嫁接试验是一种研究根系与地上部物质
信息交流的重要手段, 例如RNA干扰就是通
过这种方法研究发现的 ( P a l a u q u i a n d
Vaucheret, 1998; Voinnet et al., 2000)。通过
嫁接, 发现Bt毒蛋白通过木质部运输到地上部
以后, 可以被分配到叶片等组织中。Bt毒蛋
白作为一种抗虫资源, 能杀死鳞翅目昆虫, 所
以Bt毒蛋白的运输和分配增加了棉株地上部
的抗虫性。但是有关毒蛋白的运输和分配对
植株的具体影响以及毒蛋白的代谢将是以后
研究的重点。
图 3 嫁接后棉花伤流中Bt毒蛋白含量的比较
1.‘石远 321’; 2.‘99B’; 3. 常规棉嫁接到‘99-
B’; 4.‘SGK321’; 5. 常规棉嫁接到‘SGK321’
Fig. 3 Comparison of content of Bt toxin in the forth
leaf after grafting
1. ‘Shiyuan 321’; 2. NuCOTN99B; 3. Regular cot-
ton grafted to NuCOTN99B; 4.‘SGK321’; 5. Regu-
lar cotton grafted to‘SGK321’
参 考 文 献
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