全 文 ：植物学通报 2005, 22 (3): 313~319
Chinese Bulletin of Botany
①国家重点基础研究发展规划项目(G1998010100)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zouqi@sdau.edu.cn
收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 孙冬花
研 究 论 文
小麦 Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性①
张 国 李 滨 邹 琦②
(山东农业大学生命科学学院植物系 泰安 271018)
摘要 Rubisco活化酶是广泛存在于光合生物中调节Rubisco活性的酶, 我们利用PCR技术, 从小麦
(Triticum aestivum)叶片cDNA文库中克隆得到Rubisco活化酶基因cDNA片段, 该片段长度为850 bp, 编
码201个氨基酸。Northern blot表明, 小麦叶片在暗诱导衰老的条件下, 叶片中活化酶基因表达水平逐
渐下降; 同时, 小麦叶片的光合特性、叶绿素含量和Rubisco活性呈现下降趋势。这些结果表明, 衰老
时小麦叶片Rubisco活化酶基因表达水平下降与光合速率下降密切相关。
关键词 Rubisco活化酶, 小麦, 衰老
Cloning and Expression of Rubisco Activase Gene in Wheat
ZHANG Guo LI Bin ZOU Qi②
(Department of Botany, College of Life Science, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018)
Abstract Rubisco activase is an ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco in
photosynthetic autotrophs. A cDNA fragment of Rubisco activase gene was cloned from
wheat (Triticum aestivum). Northern blot showed that expression of the gene was down-regu-
lated in dark-induced senescence leaves, where photosynthetic rate, chlorophyll content and
Rubisco activity also showed obvious decline. The results suggest that the decreased expres-
sion level of the gene was related to the decline in photosynthetic rate.
Key words Rubisco activase, Wheat, Senescence
Rubisco是光合生物进行光合碳同化关键
的双功能酶, 它催化RuBP的羧化 -加氧反应,
但效率很低。因为加氧反应除了消耗能量,
还损失了羧化反应中固定的25%的有机碳; 同
时, 各种磷酸糖类能抑制Rubisco的活性, 如:
底物RuBP本身就是Rubisco的强烈抑制剂, 且
活化态Rubisco易于脱氨甲酰化而失活, 这些
因素使Rubisco成为光合速率的限制因子, 因
而也成为提高作物光合效率的研究目标。
Salvucci等(1985)发现了Rubisco活化酶
(Rubisco activase, RCA), 它能够活化Rubisco,
同时具有ATPase活性; 也有人认为RCA是一
种分子伴侣(Spreitzer and Salvucci, 2002)。植
物中Rubisco的活化状态实际是Rubisco的失
活速率和RCA活化Rubisco速率间的平衡状
态(Crafts-Brandner and Salvucci, 2000)。人
314 22(3)
们利用RCA抗体研究发现, RCA普遍存在于
高等植物(包括 C3和 C4植物)、绿藻、部分
蓝细菌和古细菌等光合生物中。
衰老是植物发育过程中的一个阶段
(Smart, 1994), 在衰老过程中最明显的一个变化
是植物光合能力的下降(Correia et al., 1998)。
高辉远研究大豆的生长发育后认为, 衰老时光
合暗反应能力的衰退是光合能力衰退的决定
因素①。对于小麦来说, 旗叶衰老时, 叶绿素
下降包括缓降期和速降期, 而光合速率经历高
值持续期后开始下降(张荣铣和程在全, 1992)。
但小麦衰老时光合衰退与RCA的关系尚未见
报道, 因此本文主要研究连续黑暗处理小麦叶
片诱导衰老时, 小麦光合特性、Rubisco活
性、叶绿素含量和RCA mRNA水平的变化规
律, 探讨衰老时光合衰退的内在因素, 分析RCA
在小麦叶片衰老期间的作用。
1 材料与方法
1.1 小麦叶片Rubisco活化酶基因片段的克
隆
参照构建小麦(Triticum aestivum)叶片
cDNA文库所用pBK-CMV 噬菌粒载体序列,
设计特异性引物T7: 5-GTA ATA CGA CTC
ACT ATA GGG C-3和 T3: 5-AAT TAA
CCC TCA CTA AAG GG-3, 筛选小麦叶片
cDNA文库。
1.2 净光合速率(Pn)、羧化效率(CE)和光
化学效率(Fv/Fm)的测定
小麦幼苗在自然光照条件下, 在Hoagland
培养液中培养15天, 从第16天开始分成两组:
对照组(CR)光照条件不变, 诱导组(DI)进行连
续黑暗培养; 同时从第16天开始(包括第16天)
每隔1天在上午8:30~9:30, 用CIRAS-1便携式
光合系统(英国 PP-Systems公司)测定完全伸
展的第 2片叶的Pn和CE; 用FMS2脉冲调制
式荧光仪(Hansatech公司)测定叶片在自然光
照下光系统Ⅱ的Fv/Fm; 之后取下完全伸展的
第2片叶置液氮中冷冻, 保存于-80 ℃超低温
冰箱, 用于提取叶绿素、小麦叶片总RNA和
制备 Rubisco粗提液, 试验过程共持续 10天,
取样 6 次。
1.3 叶绿素含量的测定
将取好的叶片置于冰冷的研钵中, 加入
STN提取液(400 mmol.L-1蔗糖, 50 mmol.L-1
pH7.2 Tris-HCl, 10 mmol.L-1 NaCl)约2 mL.g-1
FW, 研磨成匀浆, 用网孔36 mm尼龙膜过滤, 滤
液以 5 500g离心 5分钟, 沉淀用 STN漂洗后
再离心 1次。沉淀(叶绿体)用 20 mmol.L-1
pH7.5 HEPES (内含6 mmol.L-1 MgCl2)悬浮, 冰
浴30分钟, 20 200g离心10分钟, 沉淀(类囊体)
再用HEPES悬浮使叶绿素含量保持在 0.8~2
mg.L-1。取0.1 mL悬浮液加入4.9 mL 80%丙
酮摇匀, 5 000g离心2分钟, 用UV-120分光光
度计(日本岛津)测定652 nm OD值: 叶绿素含
量(mg.L-1)＝(A652×5)/(34.5×0.1)=A652×
1.449 (Bugos et al., 1999)。
1.4 Rubisco活性的测定
Rubisco活性测定参见李立人等(1986)的
14C同位素测定方法。将已取好的叶片定量
0.1 g, 加入 1.9 mL预冷提取液[50mmol.L-1
pH7.5 Tris-HCl, 1 mmol.L-1 EDTA, 10 mmol.L-1
MgCl2, 12.5% (V/V) 甘油, 10 mmol.L-1 b-巯基
乙醇, 1% PVP]和石英砂, 低温(4 ℃)研磨成匀
浆, 15 000g离心10分钟, 上清液用于Rubisco
活性测定(李卫芳等, 2001)。计算酶活力公式
见括号内[基于鲜重的 CO2量, mmol/(g·s) =
Δ dpm× V× 10× 1.5/(x× t× V× 60)]其
中: Δ dpm为样品 dpm减去本底 dpm, V为提
取液总体积(mL), x为1.0 mol NaH14CO3的dpm,
t为反应时间(s), V为加入的酶液体积(mL)(翁
晓燕等, 2001)。
1.5 探针的制备和Northern杂交
① 高辉远 (1999) 大豆生长发育过程中光合作用及光合
效率的调节. 博士学位论文, 山东农业大学, 泰安, 8-30
3152005 张 国等: 小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性
用CTAB法提取小麦叶片总RNA, 1.2%甲
醛变性凝胶电泳分离(溴化乙锭染色), RNA(20
mg)在胶上分离后转移到尼龙膜。利用从小
麦叶片cDNA文库得到的RCA基因片段, 设计
引物5-CCGTGATGGTCGTATGGAGA和5-
CAGCAAGAGATGGTGGGTGT, 利用PCR方
法得到片段的 3端作为 northern-blot探针的
模板。利用a-[32P]dCTP标记纯化的50 ng的
PCR产物。在 42 ℃下将转移到尼龙膜的
RNA与制备的探针预杂交 12小时, 然后在
42 ℃下杂交48小时, 洗膜后在-70 ℃放射
自显影(Sambrook et al., 1989 ), 放射自显影
的胶片使用GDS8000凝胶图像分析系统进
行灰度扫描分析。
2 结果
2.1 小麦RCA的 cDNA 部分序列
现在人们已经克隆了一些高等植物的
RCA基因, 例如拟南芥(注册号为BT000613, 下
同)、菠菜(J03610)、玉米(AY110044)、烟
草(U35111)、棉花(AP329934)、水稻(U74321)
和大麦(M55447) 等。
我们从小麦叶片构成的cDNA文库中获
得RCA基因的部分序列, 包含1 054 bp。 测
序结果表明, 它的阅读框架有201个氨基酸
序列, 与其他高等植物的RCA序列具有很高
的同源性(图 1), 其中与大麦、水稻、棉花
和拟南芥的同源性分别为97%、84%、80%
和78%。此片段已在GenBank注册, 注册号
为 AY602372。
植物RCA(除了烟草和玉米等)一般都含a
和b两种亚基, 正常条件下它们具活性, 但只有
a亚基受硫氧还蛋白f(Trx-f)的调节, 原因是其
C-末端具有2个Cys残基而b亚基没有, 这是
Rubisco受光调节的最终原因(Zhang et al.,
2002)。我们所获得的小麦RCA氨基酸序列C
末端也具有对应于拟南芥的2个Cys残基(图1
箭头所指), 这说明它是小麦RCA的 a亚基氨
基酸序列。
2.2 小麦叶片暗诱导衰老过程中Pn、Fv/
Fm、叶绿素含量、CE和Rubisco总活性的
变化
从图2的结果可以看出, 在10天的试验过
程中, 对照组小麦光合速率和羧化效率略有上
升; 而暗诱导衰老小麦随着诱导天数的增加,
叶片逐渐变黄, 各种指标都下降, 但下降幅度
和出现急剧下降的时间不同。暗诱导 2天后,
Rubisco总活性和羧化效率下降幅度比其他指
标下降幅度大, Rubisco活性从第 4天开始就
急剧下降, 到第 6天降到开始时活性的 41%;
羧化效率到第6天降到开始时的54%, 诱导8
天后活性已很低, 基本不能进行羧化。第 10
天时Rubisco活性和羧化效率均接近于0。类
囊体中叶绿素含量从诱导开始即持续减少, 但
在整个诱导过程中, 减少趋势平缓, 几乎与时
间成线性关系, 第6天时含量是开始的55%, 8
天后叶片已完全变黄; 而光合速率在诱导开始
时下降平缓, 6天后为速降期, 第10天净光合
速率已接近于 0。与碳同化的各项指标相反,
反映 PSⅡ功能的指标—— PSⅡ最大 Fv/Fm
降低的十分缓慢, 开始几天几乎不变, 至6天后
才显著降低。
2.3 小麦叶片RCA基因在暗诱导叶片中的
表达特性
暗诱导小麦叶片不同时间后(图 3), 对
RCA的表达进行Northern 分析。结果表明,
对照(D0)的RCA mRNA表达水平最高, 随着
诱导时间的增长, RCA表达量( D1~D5)呈现
出由高到低、逐渐减少的趋势, 诱导 6天后
表达量已经很低, 在 8天时mRNA几乎已不
存在。
3 讨论
通过以上实验结果可以看到, 经过暗诱导
衰老, 小麦叶片中Rubisco活性和羧化效率无
论从下降时间还是下降幅度, 都比叶绿素含
316 22(3)
量、Pn和 Fv/Fm要早要大, 特别是 Pn的下
降时间与叶绿素含量的下降时间相差不多, 但
趋势不一致。在大豆自然衰老情况下, Pn下
降的比叶绿素含量快①, 估计是黑暗影响小麦
叶绿素的合成; Fv/Fm的下降要迟于Pn, 这说
明叶绿素含量和Fv/Fm的下降都不是光合衰
退的原因。因此, 在衰老过程中首先下降的
是Rubisco活性和羧化效率等与CO2同化有关
的过程, 而与光能吸收和转换有关的过程, 是
对暗反应的下降过程作出响应后才与其一起
降低的。综上所述, 小麦在整个衰老过程中,
决定光合能力高低的关键因素始终是光合作
用的暗反应。
Rubisco 的活性下降是衰老的标志(Jiang
and Xu, 1995)。衰老期间光合衰退的直接原
因是Rubisco活性下降, 致使小麦碳同化能力
降低, 不能有效地消耗光反应产生的同化力, 在
较低光强下, 就会产生过剩光能, 叶片将较多
的光能用于热耗散, 表现较严重的光抑制, 同
时导致叶绿体内活性氧增加, 这也是加速小麦
衰老的原因之一(沈文飚等, 1997)。
王焘等(1996)报道了小麦光合日变化过程
中 Rubisco活性的变化规律, 并推测 Rubisco
图 1 5种高等植物 Rubisco活化酶基因的部分氨基酸序列的比较(↓代表 2个保守Cys)
Fig. 1 Alignment of predicted amino acid sequences of RCA from Triticum aestivum, Hordeum vulgare
L, Oryza sativa, Gossypium hirsutum and Arabidopsis thaliana (↓ represent conserved 2 Cys)
① 高辉远 (1999) 大豆生长发育过程中光合作用及光合
效率的调节. 博士学位论文, 山东农业大学, 泰安, 8-30
3172005 张 国等: 小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性
图 2 小麦暗诱导衰老时光合特性的变化
A. 小麦暗诱导衰老叶片Pn对不同细胞间隙CO2浓度(Ci)的响应; B. 小麦暗诱导衰老和对照生长不同
时间叶片 Pn的变化; C. 小麦暗诱导衰老叶片最大 Fv/Fm的变化; D. 小麦暗诱导衰老叶片叶绿素含量
的变化; E. 小麦暗诱导和对照生长不同时间叶片 CE的变化; F. 小麦暗诱导衰老叶片 Rubisco总活性
的变化(D0~D5分别代表暗诱导 0, 2, 4, 6, 8和 10天的叶片; C0~C5分别对应于D0~D5的对照小麦叶
片); DI. 暗诱导小麦材料; CR. 对照小麦材料
Fig. 2 Changes in photosynthesis characteristics in dark-induced aging plants
A. Changes in photosynthesis (Pn) under different intercellular CO2 concentration (Ci) in dark-induced
aging plants; B. Changes in Pn in dark-induced aging plants and control plants; C. Changes in the maximamum
quantum yield of photosystem Ⅱ photochemistry (Fv/Fm) in dark-induced aging plants; D. Changes in
chlorophyll content in dark-induced aging plants; E. Changes in carboxylation efficiency (CE) of dark-
induced aging and control plants; F. Changes in Rubisco total activity of dark-induced aging plants(D0-D5
represent the leaves of dark-induced days respectively: 0, 2, 4, 6, 8, and 10 days; C0-C5 represent the
control leaves response to D0-D5); DI. Dark-induced wheat; CR. Control wheat
318 22(3)
参 考 文 献
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图 3 暗诱导衰老不同时间后RCA基因在小麦叶
片中的表达结果 (RCA表达量通过灰度扫描分析)
Fig. 3 Northern analysis of Rubisco activase gene
expression of wheat in control plants and dark-in-
duced aging plants (expression levels for RCA are
quantified by densitometric analysis)
活性下降与RCA有关。Jiang等(2000)认为水
稻叶片Rubisco初始羧化活性与RCA含量和
活性之间成正相关。这些说明植株体内RCA
的存在, 能有效地保证Rubisco在体内生理条
件下处于高度的活化状态。但随着暗诱导衰
老时间的延长, RCA和 Rubisco含量减少,
RCA含量的减少归结于转录水平的降低, 依次
导致Rubisco活性下降, 叶片羧化效率下降, 无
法保持正常羧化反应, 因此暗反应成为衰老早
期的限制因子, 随衰老的加重, 由于同化力过
剩, 光抑制加重, 活性氧的产生速度和清除速
度严重失调, 最终对光合机构产生不可逆的破
坏作用, 致使光化学效率降低。
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