全 文 ：植物学通报 2006, 23 (6): 703~707
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2006-03-13; 接受日期: 2006-07-13
基金项目: 广东省自然科学基金 (No. 021105)
* Author for correspondence. E-mail: xujie@scnu.edu.cn
.技术与方法.
植物乙醇酸氧化酶分离纯化方法的改进
郭晋雅,董宇亮,杨净,徐杰*,尹汗萍,曾秋莲
华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州 510631
摘要 通过缩短DEAE-Cellulose柱长度, 加快流速并采用pH8.8的80 mmol.L-1 Tris-HCl为洗脱液, 可在9
小时内快速地从菠菜、菜心和豆角绿叶中纯化得到乙醇酸氧化酶。该酶具高活性(54.6～197.0 U.mg-1)
及高等电点(pI >10.0)。产率为4.1%～71.5%, 纯化倍数为21.6～122.68。经SDS-PAGE检测均有40 kD带,
表明3种植物乙醇酸氧化酶的亚基大小无区别。
关键词 乙醇酸氧化酶, 纯化, 菠菜, 菜心, 豆角
Improvement of the Purification Method of Plant
Glycolate Oxidase
Jinya Guo, Yuliang Dong, Jing Yang, Jie Xu*, Hanping Yin, Qiulian Zeng
College of Life Sciences, South China Normal University, Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant
Development, Guangzhou 510631, China
Abstract By reducing the length of diethylaminoethanol-cellulose and increasing the pH in elution solution,
we developed an improved method for purifying glycolate oxidase with high isoelectric value (pI > 10.0) from
green leaves of Spinacia oleracea, Brassica parachinensis, and Phaseolus vulgaris. Purified glycolate oxidase
showed high specific activity (54.6-197.0 U.mg-1) and high pI (>10.0). We achieved 21.6-122.68-fold purifi-
cation and 4.1%-71.5% yield from crude solution during this purification procedure. SDS-PAGE of the
glycolate oxidases revealed a 40-kD band, which indicates that the subunit molecular weight of glycolate
oxidases in the 3 different plants was identical.
Key words glycolate oxidase, purification, Spinacia oleracea, Brassica parachinensis, Phaseolus vulgaris
乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase, GO)是植
物光呼吸的关键酶。抑制其活性可提高C3植
物的产量(Zelitch, 1975)。但目前人们并未找到
有效抑制GO活性的方法, GO的蛋白性质仍有
许多疑问。目前普遍认为GO只含有1种亚基,
是因为从多种植物中纯化了GO, 经SDS-PAGE
检测呈单带。但亚基分子量差异较大: 如菠菜
GO为38 kD(Frigerio and Harbury, 1958)或40 kD
(Stenberg and Lindqvist, 1996), 南瓜(Nishimura
et al., 1983)、小麦(Hall et al., 1985)和黄瓜
(Behrends et al., 1982)GO均为43 kD, 豌豆GO
为48 kD(Kerr and Groves, 1975), 藻(S. pacificum)
的GO为49 kD (Iwamoto et al., 1996)。用免疫
印迹法, 则证实豌豆GO的亚基大小为 45 kD
(Stefania et al., 1999)。这种差异是因为不同植
物材料, 或因为纯化中GO发生了降解, 还是因
704 23(6)
为 SDS-PAGE方法本身的误差所造成仍不清
楚。另外, 用粗提物和纯化GO蛋白为材料, 均
发现GO有多种pI, 但结果却有不同: 用粗提物
为材料, 发现菜心则有 7.0、8.5、8.8和大于 8.8
共 5种不同 pI的 GO组分(王炜军和李明启,
1998); 豌豆GO有多种pI, 均大于9.6(Kerr and
Groves, 1975)。用纯化GO蛋白为材料, 则发现
不同植物GO的 pI只有 1种, 均为 9.6或小于
9.6: 如黄瓜GO的pI为8.4～8.7(Behrends et al.,
1982), 浮萍大于9(Emes and Erismann, 1984), 藻
(M. viride)为7.4(Iwamoto and Ikawa, 2000), 藻(S.
pacificum )为9.6(Iwamoto et al., 1996), 小麦为
7.7(Hall et al., 1985); 大麦为7.1(Roth-Bejerano
and Lips, 1978)。可见, 虽然检测出豌豆粗蛋白
中含有pI大于9.6的多种GO, 但并未把它们纯
化出来。为此, 本文采用改进后的方法, 希望
从菠菜、菜心和豆角 3种材料中纯化出 pI大
于 9.6的 GO, 并分析其亚基的大小是否有差
异 。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
菠菜(Spinacia oleracea)和菜心(Brassica
p a r a c h i n e n s i s )绿叶购自市场, 新鲜豆角
(Phaseolus vulgaris)绿叶采于农场。DEAE-
cellulose为Whatman产品; 乙醇酸等其它试剂
均为国产分析纯。
1.2 方法
GO纯化程序参照文献报道(徐杰和李明启,
1996)并作如下改进: 新鲜叶片200 g加入200 mL
的100 mmol.L-1磷酸缓冲液(pH8.0)研磨, 4层纱
布过滤得到粗蛋白。所得滤液加 10%HAC调
节至pH5.3, 4℃下4 000 g 离心30分钟, 所得上
清液经15%～30%硫酸铵分步盐析。沉淀用40
mL的 5 mmol.L-1 Tris-HCl (pH8.3)溶解, 以 5
mmol.L-1 Tris-HCl(pH6.8)为洗脱液, 上3.5 cm×
15 cm的Sephadex G-25柱, 流速为2 mL.min-1。
收集最先洗下的高GO活性的蛋白溶液50 mL,
加 100 mL的 1 mmol.L-1 FMN。在 3.5 cm× 8
cm的DEAE-Cellulose上层析, 用80 mmol.L-1
Tris-HCl(pH8.8)为洗脱液, 流速为2 mL.min-1。
GO比活测定按徐杰和李明启(1996)的方法, 蛋
白含量测定按Bradford(1976)的方法。
GO的蛋白质SDS-PAGE、IEF和醋酸薄膜
电泳均按张龙翔等(1982)的方法, 后者电泳缓冲
液为100 mmol.L-1 Tris-HCl(pH10.0)。
2 结果与分析
2.1 菠菜、菜心和豆角绿叶GO的纯化
前人普遍采用pH5.3沉淀、硫酸铵分步沉
淀、鱼精蛋白沉淀、Sephadex G-25、DEAE-
Cellulose和Sepharose-6B柱层析分离纯化GO。
其中DEAE-Cellulose柱层析为主要的纯化步骤,
整个过程需2～3天完成(Frigerio and Harbury,
1958; Kerr and Groves, 1975; Behrends et al., 1982;
Nishimura et al., 1983; Emes and Erismann, 1984;
Hall et al., 1985; Stenberg and Lindqvist, 1996;
Iwamoto and Ikawa, 2000)。本文在以上步骤的
基础上, 做以下改进: (1) 取消最后一步的
Sepharose-6B柱层析; (2)把DEAE-Cellulose柱
层析的长度大幅缩短; (3)采用 pH8.8, 而不是
pH8.3的80 mmol.L-1 Tris-HCl为DEAE-Cellulose
柱层析的洗脱液, 并且加快流速为2 mL.min-1。
改进的依据是: DEAE-Cellulose柱层析采用洗脱
剂的pH一般要高于目标蛋白的pI值1～2个单
位, 目的是使目标蛋白带负电并和阴离子交换树
脂发生作用, 并利用和杂蛋白的电荷性质的区别
而加以纯化。现我们要纯化的是pI > 9.6的GO,
在以往的纯化步骤中, 采用pH8.3的洗脱液, GO
带正电, 故不能和阴离子交换树脂发生作用, 因
而会快速被洗脱下来。现在把洗脱液的pH提
高至8.8, 可以使更多的杂蛋白带负电, 和阴离子
交换树脂紧密结合, pI > 9.6的GO仍带正电。
pI > 8.8的杂蛋白则希望在硫酸铵分步沉淀等步
骤中除去。因此, 在DEAE-Cellulose柱层析中,
只有GO带正电荷; 而杂蛋白均带负电荷。这
7052006 郭晋雅 等: 植物乙醇酸氧化酶分离纯化方法的改进
样, 就可以把DEAE-Cellulose柱层析的长度大
幅缩短, 流速也可以加快, 从而快速获得GO。
用改进后的方法, 纯化可在9小时内完成,
其中DEAE-Cellulose柱层析可在2小时左右完
成。粗蛋白经各种预处理和Sephadex G-25柱
层析, 比活性已提高了近10倍, 表明纯度已得到
部分提高。经DEAE-Cellulose柱层析后, 均可
收集到一个黄色的蛋白峰。产率为 4.1%～
71.5%, 纯化倍数为21.6～122.68。最后获得的
菠菜GO的比活为45.5 U.mg-1, 菜心GO的比活
为197.5 U.mg-1, 豆角GO的比活为90.6 U.mg-1
(表 1)。
2.2 菠菜、菜心和豆角GO亚基组成和大小
获得的菠菜GO经SDS-PAGE检测, 其相对
分子量为40 kD(图1第1行), 表明只含1种亚基,
这与Stenberg 和Lindqvist(1996)报道的结果一
致。菜心GO经SDS-PAGE后有1条明显的主
带, 相对分子量为40 kD, 在其下方还有2条信
号较弱的条带, 相对分子量分别为27和16 kD
(图 1第 3行)。豆角GO经 SDS-PAGE后也有
1条明显的40 kD主带, 另外还有75、27和16kD
等弱带(图 1第 4行)。上述结果表明, 从菠菜、
菜心和豆角绿叶中分离纯化GO, 其组分不同, 但
都含有 40 kD 亚基。值得一提的是, 图 1的第
3和4行中是加入过量的蛋白, 目的是检测其中
微量的蛋白带。如果上样量减少, 可能就只出
现 1条 40 kD带。和菠菜GO一样, 菜心和豆
角GO也含40 kD亚基, 因此这3种植物无区别。
2.3 菠菜、菜心和豆角GO的pI
以上3种GO在DEAE-Cellulose柱层析中
均快速被洗脱, 表明它们在pH 8.8的洗脱液中
是带正电荷, 即其pI > 8.8。为分析其具体的pI,
将3种GO 在pH3.0～9.5范围内进行等电聚焦。
结果发现均无蛋白带(数据未显示), 表明GO的
pI可能大于9.5或小于3.0。为进一步分析GO
的pI, 把菠菜和菜心GO作pH10.0的醋酸纤维
薄膜电泳。菠菜GO(图2第1行)和菜心GO(图
2第 2行)呈现向负极泳动, 表明其 pI >10.0。
表 1 菠菜、菜心和豆角中GO的纯化
Table 1 Purification of glycolate oxidase with high activity and high isoelectric point from green leaves of
Spinacia oleracea, Brassica parachinensis, and Phaseolus vulgaris
Step Materials
Total Total Total Specific
Yield Purification
protein activity volume activity
(%) fold
(mg) (U) (mL) (U.mg-1)
Crude S. oleracea 699.2 839.0 800 1.2 100 1.0
B. parachinensis 460.28 741.05 617 1.61 100 1.0
P. vulgaris 2 820 11 844 1 000 4.2 100 1.0
pH5.3 S. oleracea 266.4 719.3 740 2.7 97 2.25
precipitant B. parachinensis 337.28 634.09 640 1.88 85.6 1.17
P. vulgaris 783 7 752 910 9.9 65.5 2.36
(NH4) 2SO4 S. oleracea 10.0 82 40 8.2 11.3 6.83
precipitant B. parachinensis 63.4 931.34 50 14.69 125.6 9.12
P. vulgaris 116 2 920 70 25 25 5.96
Sephadex G-50 S. oleracea 67.2 369.6 70 5.5 44.3 4.58
B. parachinensis 61.38 906.58 60 14.47 122.3 8.99
P. vulgaris 79 3 239 80 40.6 27 9.7
DEAE-Cellulose S. oleracea 4.9 267.4 35 54.6 32 45.5
B. parachinensis 2.8 553 20 197.5 71.5 122.68
P. vulgaris 5.25 476 42 90.6 4.1 21.6
706 23(6)
2.4 菜心GO低置存放稳定性分析
将菜心GO溶解在80 mmol.L-1 Tris-HCl
(pH8.3)中, 在4℃下放置30天后, 测其活性, 其
比活已完全消失; 再经SDS-PAGE, 仍只有1
条 40 kD带(图 3)。可见, 菜心 GO 40 kD亚
基很稳定。
可见, 本文采用改进后的方法, 通过缩短
DEAE-Cellulose柱长度, 加快其流速, 把洗脱液
的pH值从原来的pH8.3提高到pH8.8, 可在9小
时内快速地从菠菜、菜心和豆角3种材料的绿
叶中纯化出等电点大于 10.0的GO。能在 9小
时内完成整个纯化过程, 且纯化所得的GO的等
电点大于 10.0, 此方法与结果未见有报道。
SDS-PAGE表明, 这些GO都含有 40 kD亚基。
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图 1 菠菜、菜心和豆角绿叶中GO的 SDS-PAGE
1. 菠菜GO (6.2 mg); 2. 菜心GO (18.4 mg); 3.豆角GO
(40.0 mg); M. 蛋白标准
Fig. 1 Glycolate oxidase was subjected to SDS-
PAGE
1. Spinach glycolate oxidase (6.2 mg); 2.Glycolate oxi-
dase from Brassica parachinensis (18.4 mg); 3. Glyco-
late oxidase from Phaseolus vulgaris (40.0 mg); M.
Markers
图 2 菠菜GO和菜心GO作 pH10.0的醋酸纤维
薄膜电泳(电泳的极性如图所示, 箭头所指是蛋白点
样的位置)
1. 菠菜GO (6.2 mg); 2. 菜心GO (14.5 mg)
Fig. 2 Glycolate oxidase was subjected to SDS-
acetate cellulose membrane electrophoresis. The polar-
ity was shown and the arrow indicated the original of
protein sample.
1. Spinach glycolate oxidase (6.2 mg); 2. Glycolate oxi-
dase from Brassica parachinensis (14.5 mg)
图 3 菜心GO的 SDS-PAGE
1. 在 4℃下 80 mmol.L-1 Tris-HCl (pH8.3)中放置30
天的菜心GO (4.6 mg); M. 蛋白标准
Fig. 3 Glycolate oxidase from green leaves of Bras-
sica parachinensis was subjected to SDS-PAGE.
1. Glycolate oxidase stored in 80 mmol.L-1 Tris-HCl
(pH8.3) at 4℃ for 30 days (4.6 mg); M. Markers
7072006 郭晋雅 等: 植物乙醇酸氧化酶分离纯化方法的改进
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