全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (2): 189-193, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-08-04; 接受日期: 2006-10-26
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30470283, 30370126, 30200030, 30670156)、教育部留学回国人员科研启动基金(教外司留[2005]
383号)和广东省教育厅自然科学研究项目(No.Z02018)。
* 通讯作者。E-mail: lishsh@scnu.edu.cn
† 共同第一作者。
.技术与方法.
紫外辐射诱导植物叶片 DNA损伤敏感性差异
王静 1 †, 蒋磊 1†, 王艳 1,2, 李韶山 1*
1华南师范大学生命科学学院, 广州 510631; 2暨南大学理工学院环境工程系, 广州 510632
摘要 单细胞凝胶电泳(彗星检测, comet assay)技术已广泛应用于动物细胞DNA损伤检测, 但在植物细胞DNA损伤检测中
的应用尚不多见。本研究通过对动物细胞彗星检测方法的改进, 利用植物细胞原生质体作为材料, 研究了不同发育期九里香
(Murraya panicuata)叶片对UV-B诱导的DNA损伤的敏感性差异。彗星检测结果表明, 九里香叶片DNA的损伤程度与UV-B辐
射的剂量呈正相关; 在相同UV-B辐射剂量下, 九里香幼嫩叶片比成熟叶片的DNA损伤量大, 表明其幼嫩叶片对UV-B辐射的敏
感性比成熟叶片高。
关键词 彗星检测, DNA损伤, 单细胞凝胶电泳, UV-B辐射
王静, 蒋磊, 王艳, 李韶山 (2007). 紫外辐射诱导植物叶片 DNA损伤敏感性差异. 植物学通报 24, 189-193.
由于氯氟烃(CFC)等化学物质的大量使用, 大气臭氧
层遭到严重破坏, 导致到达地面的太阳紫外辐射(主要是
波长280-315 nm, UV-B)增强(Rozema et al., 2002)。
UV-B辐射增强对植物(农作物)、动物(包括人类)和微生
物以及整个地球生态系统的影响, 已成为备受瞩目的重
大科学问题。近年来大量研究表明, UV-B辐射影响植
物的生长发育和生理生化过程 , 并造成农作物减产
(Björn, 1997)。
紫外辐射(UV-C, 200-280 nm)对微生物DNA损伤
作用已有大量研究。UV-C对 DNA损伤可以使同一条
链上相邻的2个嘧啶碱基以共价键形成嘧啶二聚体环丁
烷嘧啶二聚体(cyclobutane primidine dimmers, CPD)
和 6 - 4 光产物( p y r i m i d i n e 6 - 4 p r i m i d i n o n e
photophoducts, 6-4 PP), 如 TT、TC、CC二聚体等
(Britt, 1996)。DNA分子一旦形成二聚体, DNA双链间
的氢键和双螺旋结构就会受到破坏, 正常的DNA复制、
转录则不能进行。已有研究证实, UV-B对植物DNA的
作用与UV-C对微生物DNA损伤作用类似, 但由于UV-
B光量子的能量比UV-C要低, UV-B对DNA损伤的效
率要低得多。UV-B可以诱导高等植物DNA形成CPD
和6-4 PP, 同时也能导致碱性不稳定位点的形成和DNA
单链的断裂。而且UV-B诱导植物DNA嘧啶二聚体的
形成具有温度依赖性(Li et al., 2001, 2004)。当 DNA
受紫外光照射形成嘧啶二聚体后, 光修复酶(photolyase)
可以利用蓝光和近紫外光(300-500 nm)把二聚体单聚化
(Britt, 1996)。植物 CPD光复活酶活性最早是在拟南
芥中得到证实(Landry et al., 1997), 缺乏 CPD和 6-4
PP修复能力的拟南芥突变体均表现出对UV-B辐射的
高度敏感。
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,
SCGE)是由Ostling等首创, 后经Singh等进一步完善
并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的技
术 , 具有简便、快速、灵敏、样品用量少、无需放
射性标记等特点, 已广泛应用于各种有核细胞经理化因
子诱导的DNA损伤和修复研究(李彦和谢明, 2003)。因
其图像颇似彗星, 又称彗星检测(comet assay)。有核
细胞的DNA分子量很大, DNA超螺旋结构附着在核基
质中。用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上, 在细胞裂
190 植物学通报 24(2) 2007
解液作用下, 细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏, 使
细胞内的 RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶, 继而扩
散到裂解液中, 但核 DNA仍留在原位。如果细胞核内
的DNA未受损伤, 电泳过程中核DNA因其分子量大停
留在核基质中, 荧光染色后显微观察呈现圆形的图像, 无
拖尾现象。若细胞内核DNA受损, 在碱性电泳液(pH >
13)中, 先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链, 单链断裂
的碎片分子量小, 因此可进入凝胶中, 电泳时断链或碎片
离开核区向阳极迁移, 形成拖尾。细胞 DNA损伤愈严
重, 产生的断链或碱易变性, 断片就愈多, 其断链或断片
也就愈小。在电场作用下迁移的 DNA量多, 迁移的距
离长, 表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此, 通
过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量测定
单个细胞 DNA损伤的程度。
运用单细胞凝胶电泳技术检测动物细胞DNA损伤
的研究, 国际上已有一些报道(Mary et al., 2002; Rich-
ard and Scott, 2003), 但应用于植物细胞DNA损伤研
究的尚不多见。本研究通过对动物细胞彗星检测方法
的改进, 完善了植物单细胞凝胶电泳技术, 并利用此方法
比较了九里香(Murraya panicuata)不同生长时期的组织
经 UV-B诱导后 DNA损伤的敏感性差异。
1 材料与方法
1.1 材料
常绿植物九里香(Murraya panicuata)的幼嫩及成熟叶片
均采自华南师范大学生物园。
1.2 紫外光源处理
九里香的若干幼嫩叶片及成熟叶片, 随机分为2组(每组
中均包括幼嫩和成熟的叶片), 分别接受UV-A和UV-B
的照射。紫外光源经过Cellulose diacetate滤膜(截止
型长通滤光片, 292 nm以下波段被滤除)获得UV-B光
源, UV-B辐射照度为0.5 W.m-2(IL1700, International
Light, 美国), 培养室内的光合有效辐射(PAR, 400-700
nm)为 76 W.m-2; 透过Mylar film(截止型长通滤光片,
315 nm以下波段被滤除)获得为UV-A光源作为对照。
1.3 原生质体的制备
叶片浸没于 500 mL分离缓冲液(1.5%纤维素酶, 1.5%
离析酶, 0.4 mol.L-1甘露醇, pH 5.8)中剪碎, 避光27°C
保温60分钟。用移液器去除未酶解的较大组织块, 500
×g离心1分钟, 弃上清液, 沉淀重悬浮于500 mL STN溶
液(0.4 mol.L-1 蔗糖, 0.02 mol.L-1 Tricine, 0.01 mol.
L-1 NaCl, pH 7.8)中即得原生质体悬液。
1.4 单细胞凝胶电泳
单细胞凝胶电泳的方法是在Gichner等(2004)基础上做
了修改。普通载玻片垂直浸入溶化的2%正常溶点琼脂
糖(NMPA)中, 取出后干燥过夜。50 mL原生质体悬液,
和50 mL 1%低熔点琼脂糖(LMPA)(Sigma, 美国)于37
°C混合并充分混匀, 滴加到预处理的载玻片上。于 4
°C水平静置 30分钟后, 将载玻片放入裂解液(2.5 mol.
L-1 NaCl, 0.1 mol.L-1 EDTA, 0.01 mol.L-1 Tris-HCl,
pH10, 1% Triton X-100)中避光裂解 1小时(4 °C)。用
蒸馏水冲洗玻片并放入 4 °C预冷的碱性电泳缓冲液
(0.3 mol.L-1 NaOH, 0.001 mol.L-1 EDTA, pH>13), 浸
泡 30分钟使 DNA变性解螺旋。
DNA变性解螺旋后, 在4 °C下电泳10分钟( 19 V,
300 mA )。之后用 0.4 mol.L-1 Tris缓冲液(pH 7.5)中
和 3次后放入预冷的无水乙醇中 5分钟。自然干燥后,
加 30 mL按 1:10 000稀释的荧光染料 SYBR Gold
(Molecular Probe, 美国)染色5分钟, 在荧光显微镜(TE-
2000U, Nikon, 日本)下观察拍照。每个处理组随机选
取 3 0 个彗星图像 , 用 C A S P 软件进行定量分析
(Krzysztof et al., 2003), 并以OTM值(olive tail moment)
评价 DNA的损伤程度(Sastre et al., 2001)。
2 结果与分析
图1为紫外光照射对九里香幼叶和成熟叶片细胞的DNA
损伤影响的单细胞凝胶电泳图像。从图1可以看出, 未
进行紫外辐射处理(0小时)的样品均无彗尾的产生, 表明
叶片细胞内核DNA保持完好; 但随着紫外辐射剂量的增
加, UV-A和UV-B处理组中的彗尾均逐渐增大, 但两组
191王静等: 紫外辐射诱导植物叶片DNA损伤敏感性差异
之间并没有观察到肉眼可见的显著差别, 而且成熟叶片
与幼嫩叶片之间的差异也较难分辨。
经CASP软件分析, 用OTM值代表DNA的损伤指
数, 结果见图2。UV-A和UV-B处理对九里香幼叶与成
熟叶片都存在剂量效应关系, 即随着处理时间的增长, 叶
片细胞内 DNA损伤量增大。紫外辐射处理 2小时和 4
小时测得各组之间的OTM值均无显著差异(表1); 但在
辐射时间到达８小时时, 各个处理组间的OTM值差异极
显著(P < 0.01), 表明UV-B能强烈诱导九里香叶片细胞
的DNA损伤。比较紫外辐射对九里香不同生长时期的
叶片, 幼嫩叶片的DNA损伤量要比成熟叶片大(图2和表
1)。由此可知, 幼嫩叶片对UV-B辐射的敏感性比成熟
叶片强。
3 讨论
本实验表明, UV-B和 UV-A均能诱导九里香叶片细胞
DNA的损伤, 且相同处理时间下, UV-B比UV-A对细胞
DNA的损伤量大。已有研究表明, UV-B和UV-A引起
的DNA损伤机制不同, UV-B辐射诱导DNA损伤最为普
遍的情况是直接诱导形成嘧啶二聚体(CPD)等光产物, 以
及导致碱性不稳定位点的形成和 D N A 单链的断裂
(Sinha and Häder, 2002); 而UV-A引起的DNA损伤为
间接性的, 在细胞中激发产生一系列的自由基和活性氧,
这些物质均可有效地导致DNA的结构发生变化, 即UV-
A诱导DNA单链断裂主要与细胞内源活性氧自由基水
平的增加有关, UV-A可在一定剂量下诱导少量嘧啶二聚
体的形成(Stary et al., 1997)。但与此同时, 植物细胞
内具有相应的防御机制来降低活性氧等对DNA的损伤,
如超氧化物歧化酶(super oxide dismutase, SOD)、过
氧化氢酶和过氧化物酶等是细胞内清除活性氧自由基的
重要酶系。增强UV-B可明显提高 SOD在拟南芥突变
体中的活性(Rao, 1996)。Hernn等(2002)研究表明,
UV-B辐射提高了向日葵(Helianthus annuus)中过氧化
氢酶、谷胱甘肽还原酶、愈创木酚氧化酶的活性。
细胞DNA在受到损伤后, 在一定程度上其自身具有
修复能力, CPD的修复所利用的光修复酶是在可见光或
UV-A波段(330-450 nm)被激活的(Sinha and Häder,
2002)。在紫外辐射处理 2小时中, 各实验处理组间
DNA的损伤量均没有明显的差异, 可能是由于辐射的剂
量没有达到引起大量DNA损伤的水平, 也可能是细胞内
各种DNA修复机制的作用。但随着紫外辐射剂量的增
加, DNA损伤量逐渐增大, 表明此时的DNA损伤水平要
明显高于修复水平。从图2可看出, 在幼嫩叶片中紫外
辐射造成的DNA损伤要比成熟叶片敏感, 并且紫外辐射
图 1 紫外辐射对九里香叶片 DNA损伤的单细胞凝胶电泳
图像
Figure 1 Image of comet assay on the DNA damage
induced by UV radiation in the mesophyll of Murraya
panicuata
图 2 紫外辐射剂量对九里香叶片细胞DNA损伤的影响
Figure 2 UV-induced DNA damage expressed in olive
tail moment (OTM) in the mesophyll of Murraya panicuata
Samples were harvested after 0, 2, 4, and 8 h of UV-A or
UV-B exposure. Data shown are means (± SD) of 3 in-
dependent replications.
192 植物学通报 24(2) 2007
剂量与细胞的OTM值(损伤量)均呈近线性相关(R2＞
0.9), 表明紫外辐射与其诱导的叶肉细胞DNA损伤存在
剂量 - 效应关系。
九里香不同生长时期的叶片细胞DNA对相同剂量
下 UV-B辐射表现出了不同的损伤程度: 幼嫩叶片的
DNA损伤量比成熟叶片的大(图2), 即幼嫩叶片对UV-B
诱导的DNA损伤的敏感性大于成熟叶片。从解剖结构
上看, 成熟叶片已形成较厚的角质层和蜡质层, 与幼嫩的
叶片相比呈高度革质化, 并且成熟叶片的厚度要比幼嫩
叶片厚。而叶表皮上附着的蜡质和表皮毛的遮掩作用
与植物对UV-B的敏感性具有一定的相关性。光学分析
表明, 去掉表皮毛会导致较多的紫外线通过(Manetas,
2003)。有研究指出, 增强 UV-B可使棉花上表皮的蜡
质含量提高200%, 相同叶面积的大麦和蚕豆的蜡质含
量分别提高 23%和 28%。同时, 叶片增厚是植物减轻
UV-B伤害的一种适应性策略。在 UV-B 处理下, 曼陀
罗属(Daturaferox)植物单位叶面积重量随UV-B强度的
提高而增加, 反映在叶片增厚, 即在一定程度上增加了叶
表皮与叶肉细胞之间的距离, 有助于减少 DNA的损伤
(Ballaré et al., 1996)。本研究利用改进的单细胞凝胶
电泳技术检测紫外辐射诱导的植物细胞DNA损伤, 结果
表明, 处于不同发育时期的植物组织对紫外辐射的敏感
性不同, 幼嫩叶片比成熟叶片更易受到紫外辐射的损伤,
为进一步了解植物对增强的UV-B辐射的适应性机制奠
定基础。
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表 1 不同剂量的紫外辐射对九里香叶片细胞 DNA损伤影响的统计分析
Table 1 Statistic analysis of the DNA damage induced by UV radiation in the mesophyll of Murraya panicuata
Time (h) Comparison
Olive tail moment (OTM)
Mean difference P-value
0 Young leaves vs mature leaves 0.25219 0.47916
2 UV-A, young leaves vs UV-A, mature leaves 0.31491 0.66995
UV-B, young leaves vs UV-B, mature leaves 1.09728 0.41279
UV-A, young leaves vs UV-B, young leaves -2.10875 0.14463
UV-A, mature leaves vs UV-B, mature leaves -1.32638 0.01433
4 UV-A, young leaves vs UV-A, mature leaves 1.96044 0.01114
UV-B, young leaves vs UV-B, mature leaves 1.53549 0.37851
UV-A, young leaves vs UV-B, young leaves -2.11026 0.02886
UV-A, mature leaves vs UV-B, mature leaves -2.53520 0.10967
8 UV-A, young leaves vs UV-A, mature leaves 3.38529 0.00842
UV-B, young leaves vs UV-B, mature leaves 8.58622 < 0.01
UV-A, young leaves vs UV-B, young leaves -11.99952 < 0.01
UV-A, mature leaves vs UV-B, mature leaves -6.79859 0.00005
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Sensitivity of Plant Leaves at Different Developmental Stages
to UV-induced DNA Damage
Jing Wang1†, Lei Jiang1†, Yan Wang1, 2, Shaoshan Li1*
1School of Life Scineces, South China Normal University, Guangzhou 510631, China
2Department of Environmental Engineering, College of Sciences and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract Comet assay or single-cell gel electrophoresis is now widely used to detect DNA damage in cultured animal cells, but
only a few reports describe the application of comet assay in plant cells. Here, the accepted animal cell protocol was modified to
adapt it to plant cells and the sensitivity to UV-B induced DNA damage was investigated in young and mature leaves of Murraya
panicuata. Both UV-A and UV-B irradiation induced DNA damage in mesophylls. The level of DNA damage was much higher in
younger than mature leaves, which indicates that young leaves are more sensitive to UV-B radiation than mature leaves.
Key words comet assay, DNA damage, single cell gel electrophoresis (SCEG), UV-B radiation
Wang J, Jiang L, Wang Y, Li SS (2007). Sensitivity of plant leaves at different developmental stages to UV-induced DNA damage. Chin
Bull Bot 24, 189-193.
* Author for correspondence. E-mail: lishsh@scnu.edu.cn
† These authors contributed equally to this work.
(责任编辑: 白羽红)