全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (3): 319-329, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-01-08; 接受日期: 2007-02-12
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30570932)、教育部新世纪优秀人才支持计划(No. NECT-06-0327)和黑龙江省普通高等学校青年学
术骨干支持计划项目(No. 1152G015)
E-mail: daishaojun@hotmail.com
.综述.
花粉蛋白质组学研究进展
戴绍军 1,2
1东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040; 2哈尔滨师范大学生命与环境科学学院, 哈尔滨 150080
摘要 花粉是高度退化的生物体(雄配子体), 在植物有性生殖过程中具有重要作用。解析花粉发育、花粉-柱头识别、萌发
和花粉管生长等细胞学过程的分子机制是当前研究的热点问题之一。近年来, 应用高通量的蛋白质组学技术平台, 对水稻、
拟南芥和裸子植物花粉的蛋白质组学研究揭示了花粉中表达蛋白质的功能类群特征。花粉中参与细胞壁代谢、蛋白质代
谢、细胞骨架动态和信号转导的蛋白质被高度代表, 并且近1/4蛋白质有多个同工型。本文综述了花粉蛋白质组学的研究
进展。
关键词 花药, 萌发, 花粉, 蛋白质组
戴绍军 (2007). 花粉蛋白质组学研究进展. 植物学通报 24, 319-329.
植物花粉(雄配子体)是高度退化的二细胞或三细胞
生物体。花粉粒是在花药中由小孢子母细胞经过连续
的减数分裂和有丝分裂形成。成熟的花粉落到柱头上
后, 利用花粉外被与花粉壁中的蛋白质和脂类等成分完
成与柱头的识别, 然后通过极性生长的花粉管将精细胞
送入胚囊完成受精作用。在这一过程中, 花粉作为简单
的生物体能够完成多细胞生物体所具有的信号传导、
细胞识别、能量代谢和细胞生长等重要代谢过程。这
种功能特异性不仅是影响植物繁殖和进化的关键因素,
而且对于改良作物的性状具有重要意义。对这种功能
特异性细胞学过程分子机制的研究既是深入解析植物有
性生殖特性的基础, 也关系到作物杂种优势在育种实践
中的利用, 是理论研究与生产实践的有机结合。因此,
花粉功能特异性研究一直是植物科学研究领域的热点问
题之一。几十年来, 人们不断利用生物化学、分子遗
传学、转录组学和蛋白质组学的研究策略解析了花粉
功能特异性的分子机制。本文综述了近年来花粉蛋白
质组学的研究进展。
1 花粉发育与萌发过程中的关键事件
1.1 花粉的发生
花粉在植物雄蕊中发生。雄蕊花药的 4个小孢子囊(花
粉囊)分化形成外层的花药壁和包含在中央的造孢细胞。
花药壁的最内层为绒毡层, 为花粉的发生提供营养。造
孢细胞发育为小孢子母细胞, 小孢子母细胞经过减数分
裂产生4个单倍性的小孢子, 小孢子被共同的胼胝质壁
包围, 成为四分体。胼胝质壁解体后释放出来的小孢子
体积开始增大, 内部逐渐形成 1个大液泡, 将核推向一
极。然后通过1次不对称的有丝分裂产生1个大的营养
细胞和1个小的生殖细胞, 形成双细胞花粉。营养细胞
接受了原来小孢子的大部分细胞质和细胞器, 而生殖细
胞的细胞器较少。营养细胞合成和储藏大量的营养物
质和mRNA供花粉进一步发育和花粉管生长需要。被
子植物中30%个科的植物的生殖细胞在花粉粒中再进行
1次有丝分裂形成2个精细胞(雄配子), 进而形成三细胞
花粉。精细胞缺少细胞壁, 被自己的质膜和营养细胞包
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围。2个精细胞之间及其中1个精细胞与营养核之间形
成稳定的紧密联结, 称为雄性生殖单位。双细胞花粉
(70%科的植物)的生殖细胞分裂形成精细胞的过程发
生在花粉管中。人们已经分离到了部分参与花粉发生
过程中减数分裂、有丝分裂和细胞极性化等过程的基
因/蛋白质, 但对一些关键事件具体的调控机制仍不十
分清楚。
1.2 花粉-柱头识别和花粉萌发
花粉落到柱头上以后, 通过附着(adhesion)、水合、极
性化、启动萌发和花粉管入侵生长等过程 , 将雄性
生殖单位送到胚囊完成受精作用。附着时首先通过
花粉外壁聚合物和柱头表面的生物物理和(或)化学作
用完成初始附着, 然后通过花粉外被物质与柱头表面
物质相互作用完成花粉外被的活化。附着完成后 ,
花粉通过水合作用迅速完成从代谢静止向代谢活跃
状态的转变, 同时由非极性细胞转化为高度极性的细
胞(Bui t ink et a l . , 2000)。在水合后的几分钟内 ,
花粉粒迅速组织它的细胞质和细胞骨架来支持花粉
管伸出。花粉管通过突破花粉壁伸出 , 或者溶解萌
发孔的内壁, 移开保护花粉孔的孔盖直接从萌发孔伸
出。花粉管穿过柱头屏障进入花柱 , 并在花柱内依
靠典型的顶端生长到达胚囊。花粉管中分布的各种
类型的囊泡对花粉管极性生长过程的多糖合成、物
质转运和信号转导等过程起作用。来自高尔基体的
囊泡含有细胞壁前体材料, 它们与花粉管顶端的细胞
膜融合, 囊泡膜参与质膜生长, 囊泡内涵物分泌到胞
外为细胞壁生长提供原料。人们已经发现肌动蛋白
细胞骨架调节的细胞核极性定位 ( L a l a n n e a n d
Twell, 2002), 分泌囊泡极性运输导致的胼质脂在花
粉管出现的部位沉积 (Johnson and McCormick,
2001), 线粒体和多糖颗粒在花粉管顶端集结(Mazina
et al., 2002), 以及ROP1蛋白(一种GTP结合蛋白)
参与的F-肌动蛋白运动和花粉管尖端钙离子梯度的
建立(Gu et al., 2003)等事件对于花粉极性建立和
花粉管顶端生长具有重要作用, 但是这些事件的分子
机制并不清楚。
2 分子遗传学策略解析的花粉表达基因
早期的生物化学研究证明, 成熟花粉已经预合成了参与
花粉萌发与早期花粉管生长所必需的蛋白质, 而萌发后
新合成的蛋白质仅用于后期花粉管生长和与受精相关的
过程(Mascarenhas, 1993)。近 20多年来, 人们通过
分子遗传学技术分析了拟南芥等植物中大约150个花粉
特异表达基因(Twell, 2002)。它们主要参与果胶质代
谢、细胞骨架、转录调控和信号转导等重要生理过程,
还包括一些编码蛋白激酶、花粉过敏源和花粉壁蛋白
质的基因(Twell, 2002)。同时, 鉴定了部分参与花粉 -
柱头识别和花粉水合等过程的关键基因/蛋白质, 如: 通
过UB/26S蛋白小体途径参与金鱼草自交不亲和作用的
F-box蛋白AhSLF-S2(Qiao et al., 2004), 参与烟草花
粉水合过程的LAT52(Tang et al., 2002), 以及芸薹属和
旱金莲属植物中花粉管穿破柱头表面薄层细胞进入柱头
过程中起重要作用的几丁质酶等(Hiscock, 2002)。此
外, 对花粉管极性生长的分子机制也有了初步了解, 并确
定了一些参与调节极性生长的基因 /蛋白质。一方面体
现在对细胞骨架相关蛋白质在极性生长过程中重要作用
的认识, 如: 花粉管中部的肌动蛋白束与近顶端肌动蛋白
纤维的动态重塑是维持花粉管极性生长所必需的, 肌动
蛋白抑制蛋白和肌动蛋白解聚因子直接调控肌动蛋白的
动态变化(Allwood et al., 2002); 另一方面体现在对极
性生长过程中信号转导机制的理解, 如证明了花粉管顶
端定位的Ca2＋梯度与顶端质膜定位的GTPase调控花
粉管的极性生长(Kim et al., 1999; Li et al., 1999; Fu
et al., 2001)。这些重要的进展使我们对受精识别和花
粉管极性生长机制有了基本的了解。但是, 由于授粉与
受精过程涉及花粉在柱头上的黏着、花粉 -柱头识别、
萌发启动、花粉管极性生长、花粉管与花粉管通道细
胞识别, 以及花粉管顶端适时解体释放出精子等一系列
相对复杂的过程, 该过程是由多个蛋白质或由其调控的
代谢环节协作完成的。通过单基因 /蛋白质的功能分析
难以全面解释这一过程中的复杂问题。目前对其中的
许多重要问题仍缺乏基本的理解, 如花粉萌发能力是在
其成熟时已经建立, 还是受外界信号诱导形成的; 哪些分
321戴绍军: 花粉蛋白质组学研究进展
子调节了GTPase的顶端定位; 哪些代谢途径决定了花
粉的功能特异性等。近年来的花粉转录组研究为解释
这些问题提供了转录本水平的证据。
3 转录组研究揭示的花粉表达基因的功
能特征
基因芯片技术的出现为人们从整体上认识花粉的功能特
征提供了新的技术平台。国际上3个实验室利用基因芯
片技术分析了拟南芥成熟花粉转录本发育时期的特征和
功能类群(Becker et al., 2003; Lee and Lee, 2003;
Honys and Twell, 2003, 2004; Boavida et al., 2005;
魏丽勤和王台, 2007)。
3.1 花粉发育各时期基因表达的不均一性
“早期”基因的转录本在减数分裂刚 刚完成时就可以被
检测到, 在成熟花粉粒中降解; “晚期”基因的转录本在
第1次有丝分裂刚 刚完成时可以检测到, 并且一直持续
到在成熟花粉粒中聚集(Mascarenhas, 1990)。拟南芥
花粉发育过程中转录本多样性下降, 而且在双细胞花粉
向三细胞花粉转变的过程中尤其显著(Honys and Twell,
2004; Boavida et al., 2005)。
3.2 花粉中表达的基因与营养器官中的相比具
特异性
从转录本数量上看, 成熟花粉中的转录本数量比4个时
期(子叶开放期、四叶莲座期、第一可见花芽期和第一
开花期)营养器官中的少30%-60%(Honys and Twell,
2003)。经过纯化后成熟花粉中的转录本与幼苗、叶
片、根和角果4种营养组织中的存在明显差异, 营养器
官中持续表达的基因有1/3在花粉中没有表达(Becker
et al., 2003)。而且, 花粉中有超过 10%的基因是花粉
特异表达。Boavida 等(2005)对拟南芥同一生态型营养
器官(苗、叶片、角果和花)与花粉转录组的比较研究
表明, 成熟花粉中 1 1% 的基因为花粉选择性表达。
Honys 和 Twell(2003)的转录组结果表明花粉中特异表
达的转录本为 39%。另外, 从转录本表达丰度来看, 花
粉中高丰度mRNAs的比例为17%, 明显高于各时期的
营养器官(5.2%-8.2%); 中等丰度mRNAs在花粉中的
比例也要高于营养器官。花粉高丰度转录本占花粉全
部转录本的25%-30%, 比营养器官自身高丰度转录本
所占比例高很多(Becker et al., 2003; Lee and Lee,
2003; Honys and Twell, 2004; Boavida et al., 2005)。
花粉和营养器官(以莲座叶时期为代表)表达的基因之间
缺乏相关性, 两者共有的基因明显属于低丰度的类群
(Honys and Twell, 2003)。
3.3 花粉表达基因表现为功能类群特异性
成熟花粉中积累的转录本的功能类群倾向于易于花粉萌
发和花粉管生长。从基因表达丰度上看, 参与细胞壁代
谢、信号转导、细胞骨架、基础代谢和防御胁迫的转
录本在花粉中被高度代表。其中, 前3类的相对表达丰
度占全部花粉特异表达基因相对表达丰度的 45%。而
参与 DNA代谢和细胞循环、转录、蛋白质合成、蛋
白质命运和转运的转录本被低度代表(Honys and Twell,
2003; Pina et al., 2005)。从转录本数量上看, 参与细
胞壁代谢的转录本成为主体(占 15%), 6个最强丰度的
mRNA中有5个编码的蛋白质参与细胞壁代谢(比如多
聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶), 而且4种是花粉特异表达,
1种是花粉高度优势表达。其次是参与细胞骨架动态的
转录本, 占花粉表达转录本数量的2%, 如编码肌动蛋白
4、微管蛋白b-4和微管蛋白b-9的转录本都是花粉中高
度富含的(Honys and Twell, 2003; Pina et al., 2005)。
另外, 参与转录、蛋白质合成、氧化代谢、糖酵解和
线粒体电子转运等代谢过程的转录本在成熟花粉中被低
度代表。这些低度代表的转录本类群能否满足快速生
长的花粉管的需要, 是否存在转录后的调控机制, 我们很
难从转录组的研究结果中找到这些问题的答案。花粉
蛋白质组研究结果为回答这些问题提供了证据。
4 花粉蛋白质组学
4.1 花粉蛋白质组学技术平台
近年来, 蛋白质组学技术在植物花粉研究中的应用使我
322 植物学通报 24(3) 2007
们能够从蛋白质水平深入认识花粉的功能特异性。蛋
白质组是指一个功能单位(如蛋白质复合体)、细胞器、
细胞、组织、器官或个体所具有的蛋白质(包括种类和
功能信息)的总称, 是连接基因与代谢活动或性状的纽
带。蛋白质组学是分析和描述生物体蛋白质、蛋白质 -
蛋白质相互作用以及蛋白质修饰的科学。蛋白质组学
研究可以系统地确定细胞或组织内的每一个蛋白质的表
达、蛋白质复合体的组成、蛋白质的互作关系和每一
个蛋白质的丰度与被修饰的状态等。
获得蛋白质表达谱和蛋白质定性分析特征是蛋白质
组研究的基础工作。目前获得蛋白质表达谱的有效手
段是一维或二维凝胶电泳技术。O’Farrell (1975) 建立
的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)技术, 经过20多年的
不断完善已经成为目前广泛使用的从复杂生物样品中分
离蛋白质的重要手段。等电聚焦(isoelectric focusing,
IEF)固相 pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)胶
条、SDS-PAGE预制胶的使用和与之相匹配的考马斯
亮蓝或硝酸银染色等凝胶染色方法的完善, 以及高分辨
CCD照相系统或激光扫描仪等数字图像处理系统和商业
化的凝胶分析软件的普及, 使得基于凝胶电泳技术的蛋
白质分离平台更加适于高通量的蛋白质组学研究。在
蛋白质组研究中, 蛋白质的鉴定是利用质谱(mass spec-
trometry, MS)分析获得的肽质量指纹图谱(peptide
mass fingerprinting, PMF)和多肽序列标签(PST), 与数
据库中已有的相关基因 / 蛋白质信息进行比较来实现
的。20世纪80年代后期建立的生物质谱技术成为目前
开展蛋白质组学研究的关键技术平台。近年来, 基于不
同的离子源和质量分析器组合出现了各种类型的质谱仪,
并且已在植物(花粉)蛋白质组研究中有以下几种应用:
(1)应用1988年德国科学家Karas和Hillenkamp发现的
基质辅助激光解析电离(matrix-assisted laser desorp-
tion ioni zation, MALDI)理论(Karas and Hillenkamp,
1988)设计的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪
(MALDI-TOF-MS), 可以高通量地得到PMF, 然后通过
肽质量检索, 定性鉴定多肽或蛋白质。这种质谱仪具有
高通量、高灵敏度和操作简便等优点, 适合分析基因组
信息清楚的物种。由 2个 TOF质量分析器串联组成的
质谱仪(MALDI-TOF-TOF-MS), 除了具备上述特点外, 还
可以完成PST分析, 进而实现跨物种的蛋白质鉴定。(2)
电喷雾电离三级四极杆质谱仪(ESI-TQ-MS)是基于美国
科学家Fenn等在20世纪80年代后期发明的电喷雾电
离(electrospry ionization, ESI)技术设计的(Fenn et al.,
1989)。这种质谱仪通过运行产物离子扫描模式, 先选
择多肽离子 , 再在碰撞活化室内完成碰撞诱导解离
(collision induced dissociation, CID)生成碎片离子, 然
后通过分析碎片离子, 得到多肽片段的氨基酸序列信
息。这种质谱仪可以利用纳升电喷雾离子源(nanoelec-
trospray ionization, nanoESI)通过对蛋白质溶液的连续
喷雾, 或者与毛细管高效液相色谱(capi l lary l iquid
chromatography, CapLC)联机, 实现对多个蛋白质样品
的自动化分析, 适于分析鉴定蛋白质混合物。(3) 四极杆
与飞行时间分析器串联组成的电喷雾电离四极杆飞行时
间质谱仪(ESI Q-TOF MS), 保持了单级四极杆质谱仪的
优点, 还大大增加了质量范围和质量准确度。(4)ESI源与
离子阱(ion trap, IT)结合的电喷雾电离离子阱串联质谱仪
(ESI-IT-MS), 通过线性变化离子阱环形电极上的高射频
电压, 同时对端盖电极施加小电压, 使连续质荷比的离子
共振发射, 得到完整的质谱图。通过它可以实现三级
(MS3)甚至多级(MSn)串联质谱实验, 主要用于分析生物
大分子修饰位点与修饰类型。
4.2 花粉蛋白质组特征
花粉在未成熟之前是在花药中发育, 而且在有丝分裂之
前, 小孢子处于未分化状态, 因此很难获得大量花粉发育
各时期的样品。导致多数研究只针对花粉有丝分裂后,
尤其是从成熟花粉和萌发花粉表达特异蛋白质方面展开,
而花粉发育早期的蛋白质组研究则主要以花药为材料。
4.2.1 花粉发育过程中的花药蛋白质组
花粉是在花药中发育成熟的, 由于在花粉发育过程中很
难从花药中大量分离出来, 所以人们试图通过研究花粉
发育过程中花药蛋白质组的变化来解析调控花粉发育的
关键基因 /蛋白质。Imin 等(2001)报道了水稻幼孢子
体时期花药蛋白质组特征。他们通过硝酸银染色在
323戴绍军: 花粉蛋白质组学研究进展
pH6-11的2-DE胶上检测到4 000多个蛋白质斑点, 鉴
定了其中75个斑点(代表62种蛋白质)。他们认为这些
蛋白质斑点数量代表了水稻基因组总量的 10%。实际
上, 因为很多蛋白质在行使功能的时候以多个同工型
(isoform)的形式存在, 一种蛋白质在2-DE胶图谱上经常
表现为多个蛋白质斑点, 所以用2-DE胶图谱上的蛋白质
斑点数量与基因组数量进行比较是不科学的。随后, 这
个实验室比较了水稻花粉发育6个不连续时期(花粉母细
胞、四分体、早期幼小孢子、单细胞花粉、双细胞
花粉和三细胞花粉)花药的蛋白质组差异(Kerim et al.,
2003), 确定了159个差异表达的蛋白质斑点, 并鉴定了
其中40个斑点(代表33种蛋白质)。这些蛋白质主要参
与糖代谢、细胞延长和伸展等生理过程, 并且很多蛋白
质以多个同工型的形式存在。在开花期的花药中Jab1/
CSN5同源物的表达量上调, 表明在花药开裂时COP9
信号酶体(signalosome, 组成型光形态建成受体)参与光
信号敏感的调节。另外, 参与半乳糖生产的b-牛乳糖酶
的表达量在花药发育后期也上调, 可能对花粉细胞壁松
弛和花粉增大起作用。在此基础上, Im in 等(2004,
2006)检测到水稻幼孢子体经过早期冷害后, 其花药蛋白
质在2-DE胶上差异表达的70个斑点, 并鉴定了18种蛋
白质。在冷处理 1、2和 4天后, 37种花药蛋白质表达
丰度的变化在2倍以上。其中, 参与应答冷胁迫的蛋白
质(如半胱氨酸合酶、20S蛋白酶体 b-6亚基、细胞色
素 c氧化酶 VB亚基等)表现为明显地上调。而水稻冷
诱导花药蛋白质OsCIA的mRNA表达水平变化不明显,
表明水稻花药可能通过转录后调控应答冷胁迫(Imin et
al., 2006)。由于花药中含有花药壁和绒毡层细胞等大
量孢子体成分, 所以对花药的蛋白质组研究只能初步分
析花粉发育过程的蛋白质组变化, 并不能真正反映花粉
蛋白质组的功能特异性。
4.2.2 花粉外被蛋白质组
花粉细胞外包裹着具独特结构的花粉壁。在花粉发育
过程中, 绒毡层细胞破裂后释放的物质和花粉细胞的分
泌物都沉积在花粉壁表面形成花粉外被。花粉外被 /花
粉壁中高度多样性的蛋白质调控花粉与柱头的识别, 在
植物有性生殖过程中具有重要的作用, 比如一些花粉外
被蛋白和芸薹属S位点相关蛋白(SLR1)间存在相互作
用, 决定了某些植物自交不亲合的特性(Luu et al. ,
1999)。随着人们对花粉外被成分认识的深入, 不断有
新的花粉外被 /花粉壁中的蛋白质被发现。早期研究表
明, 花粉外壁中存在琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶; 内
壁中存在核酸酶和酸性磷酸酶; 而过敏原蛋白、磷酸化
酶、淀粉酶、b-呋喃果糖苷酶、b-1,4葡聚糖酶和多
聚半乳糖醛酸酶在内壁和外壁中都存在。在花粉外
被、内壁和花粉管中检测到的酸性磷酸酶、核糖核酸
酶、酯酶、淀粉酶、蛋白酶、几丁质酶、果胶质
酯酶、果胶酸盐裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶等可能在
花粉管入侵到柱头表面以及在花柱内生长过程中起着重
要作用, 而受体激酶可能是花粉和柱头间的通讯媒介。
富含大量亮氨酸重复序列的受体激酶家族成员LePRK1
和 LePRK2定位于生长的花粉管(Muschietti et al.,
1998)。这些激酶的候选配体包括细胞壁重建蛋白和含
有胞外信号的富含半胱氨酸蛋白。花粉特异表达的富
含半胱氨酸蛋白是花粉体外水合、萌发和体内花粉管
生长所必备的。有证据表明它在体内与 LePRK2相互
作用, 这暗示着LAT52和LePRK2可能参与调节和保持
花粉管的生长(Tang et al., 2002)。拟南芥花粉外被含
有 6种脂肪酶, 8种富含甘氨酸且含有脂质结合结构域
的油脂蛋白(Fiebig et al., 2000; Mayfield et al., 2001)。
其中最丰富的是油脂蛋白GRP17, GRP17突变会延迟
花粉水合启动并且降低花粉的萌发能力(Mayfield and
Preuss, 2000)。十字花科植物中的GRP蛋白在序列
上有广泛的差异, 破坏十字花科植物花粉外被蛋白能够
延迟或者关闭花粉水合(Fiebig et al., 2000; Mayfield et
al., 2001)。推测这些蛋白质可能与脂类一起成为花粉-
柱头相互作用时的起始信号。Dai 等 (2006) 利用乙醚
洗脱的方式富集了水稻花粉外被蛋白质, 并且通过SDS-
PAGE结合CapLC ESI Q-TOF MS/MS分析从14个电
泳条带中鉴定了 37种蛋白质。同时, 利用等渗洗脱的
方式获得了水稻花粉细胞壁/外被相关和可释放蛋白质
组分, 并利用双向电泳结合质谱的方式鉴定了307种蛋
白质(在2-DE胶上表现为507个蛋白质斑点)。其中, 10
324 植物学通报 24(3) 2007
种是此前已经报道过的花粉外被蛋白质, 包括b-1,4-木
聚糖酶、延展蛋白、肌动蛋白抑制蛋白、果胶质甲基
化酶抑制因子、酯酶、淀粉酶、多聚半乳糖醛酸酶、
花粉过敏原蛋白、亲环蛋白和钙网蛋白; 而另外8种是
此前曾被报道存在于细胞外基质中的蛋白质, 包括纤维
素合酶、果胶乙酰酯酶、b - 葡萄糖苷酶、b - 半乳糖
苷酶、似枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶、过氧化物
酶、无孢子生殖相关蛋白和硫氧还蛋白; 其余140种是
被首次报道在花粉细胞壁/外被相关和可释放蛋白质组
分中存在, 主要参与信号转导、细胞壁代谢、胁迫防
御和糖代谢过程。对这些蛋白质功能的深入研究将有
助于理解花粉 -柱头识别过程的分子机制。
4.2.3 成熟花粉蛋白质组
早期研究发现蛋白质合成抑制剂并不影响花粉萌发过程,
这表明花粉萌发需要的蛋白质已经存在于成熟花粉中,
新合成的蛋白质只是供给萌发后花粉管生长
(Mascarenhas, 1993)。花粉蛋白质组研究不仅为此提
供了进一步的证据, 而且揭示了花粉中表蛋白质的功能
类群特征。拟南芥成熟花粉蛋白质半数以上参与了花
粉代谢、能量合成、细胞壁代谢、细胞构建和蛋白质
代谢过程(Holmes-Davis et al., 2005; Noir et al.,
2005)。水稻成熟花粉蛋白质也表现为相似的功能类群
特征(Dai et al., 2006)。从水稻成熟花粉3个不同组分
(花粉外被蛋白、花粉外被 /细胞壁相关和可释放蛋白、
花粉内在蛋白)中鉴定出的322种蛋白质, 主要参与信号
转导、细胞壁重塑与代谢、蛋白质代谢以及糖类和能
量代谢等过程(Dai et al., 2006)。这表明成熟花粉中不
仅储藏了mRNA, 而且预合成了花粉萌发所必需的蛋白
质。同时, 蛋白质组学研究首次揭示出了一些在花粉中
表达的蛋白质, 包括蛋白激酶、受体激酶相互作用蛋
白、GDP解聚抑制因子、含有 C2结构域蛋白质和亲
环蛋白等参与信号转导的蛋白质 eIF4A、线粒体加工
肽酶、UFD1和 AAA+ ATP酶等参与蛋白质合成、装
配与降解的蛋白质以及逆糖基化多肽、似纤维素合酶
OsCsLF7等参与细胞壁重塑和代谢的蛋白质等(Dai et
al., 2006)。拟南芥成熟花粉中特异表达的蛋白质包括
参与细胞构建的糖基水解酶家族蛋白质、似萌发素蛋
白(germin-like protein, GLP8)、果胶甲酯化酶抑制蛋
白家族蛋白、肌动蛋白 4、肌动蛋白解聚因子; 还包括
参与细胞构建、细胞生长和分裂的蛋白质, 参与基础代
谢的烯丙基乙醇脱氢酶, 参与能量代谢的苹果酸氧化还
原酶, 参与转运的液泡 ATP合酶 E亚基等(Mayfield et
al., 2001)。这些蛋白质可能对于花粉完成生物学功能
具有重要作用。另外, 生物信息学分析表明, 花粉中有
一部分蛋白质(水稻花粉中占 11%, 拟南芥花粉中约占
27%)的功能未知并且不含有任何已知的功能结构域, 它
们的生物学功能值得进一步研究(Noir et al., 2005; Dai
et al., 2006)。
4.2.4 萌发花粉蛋白质组
早期研究表明, 开花植物和松属植物的成熟花粉与萌发
花粉蛋白质组成大体相似(Mascarenhas et al., 1984)。
对水稻与东方白皮松(Pinus strobus)萌发花粉蛋白质组
的研究结果支持了这一观点。两种植物萌发花粉都表
现出与成熟花粉相似的中高丰度蛋白质表达谱
(Fernando, 2005; Dai et al., 2007)。在水稻萌发花粉
和成熟花粉 2-DE凝胶图谱中, 共检测到 2 300多个蛋
白质斑点, 只有66个蛋白质斑点在萌发前后特异性表达
(Dai et al., 2007)。东方白皮松成熟花粉蛋白质在 2-
DE胶上表现为645个蛋白质斑点, 而萌发花粉为647个
斑点, 并且94%萌发花粉中表达的蛋白质在成熟花粉中
也存在(Fernando, 2005)。
花粉萌发后差异表达蛋白质表现为功能特异性。
细胞壁相关蛋白质被高度代表是其中一个重要特征。
水稻花粉萌发后差异表达蛋白质中, 参与细胞壁代谢的
蛋白质数量占 24%, 表达丰度占 30%(Dai et a l . ,
2007)。并且水稻花粉中有 41种蛋白质可能在萌发过
程中被释放到培养基中(柱头上), 它们可能参与了柱头细
胞和花粉管通道细胞细胞壁的松弛和水解, 如第3类过
氧化物酶家族成员、多聚半乳糖醛酸酶、b-1,4-木聚
糖酶和一些花粉过敏源蛋白; 也可能参与了花粉 -柱头
的信号识别过程, 如钙网蛋白和含有C2结构域的蛋白
(Dai et al., 2007)。其中, 有 8种传统认为是细胞内参
325戴绍军: 花粉蛋白质组学研究进展
与糖类和能量代谢的酶可能在萌发过程中被从花粉释放
出来, 如烯醇酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸甘油酸激酶等
(Dai et al., 2007)。在东方白皮松花粉萌发后 19个表
达丰度上调的蛋白质中也包括参与细胞壁形成的a-延展
素蛋白(Fernando, 2005)。
花粉蛋白质组分析表明, 活跃的蛋白质合成和选择
性降解可能对花粉管生长有重要作用。在水稻成熟花
粉中预合成了参与蛋白质合成和折叠的蛋白质, 而且萌
发过程表达丰度变化的蛋白质中有11%是参与蛋白质
代谢, 其中参与蛋白质合成的eIF4A与eIF4G上调, 而
抑制蛋白质合成的TCTP下调; 同时, 成熟花粉中贮藏了
参与蛋白质降解的26S蛋白酶体成分, 并且在萌发过程
中26S蛋白酶体水解部分14个亚基中有6个亚基上调
(Dai et al., 2006, 2007)。
花粉蛋白质组研究还表明, 活跃的细胞骨架动态变
化和能量代谢为花粉管迅速完成极性生长提供了条件。
在水稻花粉体外萌发过程差异表达蛋白质中120种参与
糖类和能量代谢(占 24%)、细胞骨架动态变化(占 8%)
的蛋白质被高度代表。而且, 在表达丰度上调的蛋白质
中, 参与这两类代谢的蛋白质也占主要部分(Dai et al.,
2006, 2007)。在东方白皮松花粉萌后 19个上调的蛋
白质中, 多数也是参与糖代谢(如ADP-葡萄糖焦磷酸化
酶)、能量代谢(ATP合成酶 b亚基等 7种)、胁迫反应
(异黄铜还原酶等5种)、基因调控(核酸结合蛋白等4种)
和信号转导(钙依靠的蛋白激酶等4种)等过程的蛋白质
(Fernando, 2005)。在有花粉管生长抑制剂latrunculin
B (LATB)存在时, 另一种松科植物白杆(Picea meyeri)
花粉萌发过程中有53种蛋白质丰度发生变化, 其中参与
细胞骨架、信号转导、细胞生长和能量代谢的蛋白质
占多数(Chen et al., 2006)。
4.2.5 花粉中表达的同工型蛋白质
蛋白质组学研究表明, 营养器官表达的蛋白质经常以多
个同工型的形式存在, 花粉中也表现出相似的特点。蛋
白质表现为多个同工型主要由于2种原因, 一种是不同
基因编码的具有高度序列相关性的蛋白质, 这种同工型
被称为isotypes; 另一种是同一基因编码的多肽多样性
(包括可变剪切和翻译后修饰) , 这种同工型被称为
isoforms。这些同工型蛋白质, 尤其是被翻译后修饰的
蛋白质对花粉完成生物学功能具有重要的作用。目前
已知的翻译后修饰有200余种, 翻译后修饰对于蛋白质
功能的开关、亚细胞定位和蛋白质 -蛋白质相互作用具
有重要意义。
在水稻成熟花粉和萌发花粉中, 肌动蛋白、b-微管
蛋白、a-微管蛋白、电压依赖性阴离子通道蛋白和延
展蛋白表现为多种 isotypes(Dai et al., 2006, 2007)。
在水稻成熟花粉中, 有23%的蛋白质以多个同工型的形
式存在, 它们主要参与了细胞壁代谢、糖类和能量代
谢、细胞骨架、胁迫反应和离子运输等代谢过程(Dai
et al., 2006)。花粉萌发后, 有 24种蛋白质的多个
isoforms表达丰度发生变化, 它们在2-DE胶上表现为
59个蛋白质斑点, 其中 37个在萌发后上调, 3个下调,
另外 19个可能在体外萌发过程中被释放到培养基中。
荧光染色可以初步判断其中14种蛋白质可能被磷酸化
或者糖基化修饰(Dai et al., 2007)。这 24种蛋白质主
要参与细胞壁代谢、糖类与能量代谢、细胞骨架、胁
迫反应和离子运输。其中, 上调的蛋白质和萌发后新出
现的蛋白质主要参与花粉管生长过程中能量供应和以细
胞骨架动态变化为基础的细胞壁代谢。而那些可释放
蛋白质则可能参与花粉-柱头识别, 以及花粉管穿透花粉
管通道细胞过程中的重要事件(Dai et al., 2007)。在拟
南芥成熟花粉中, 具有同工型的蛋白质约占30% (Noir
et al., 2005; Holmes-Davis et al., 2005)。其中, 27
种蛋白质存在 isotype, 并且 16种蛋白质存在 isoform
(Noir et al., 2005)。在水稻花药中, 3种参与糖类物
质代谢的酶都至少有2个以上的同工型, 说明不同的翻
译后修饰在其完成生理功能时起了重要的作用。其中,
以多个同工型形式存在的液泡酸转化蛋白在开花前5天
表达量很低, 然后开始聚集并在开花前达到很高的水平,
这可能与花粉中淀粉含量的增加有关。在第1次有丝分
裂后, 肌动蛋白抑制蛋白3个同工型的表达量都开始增
加, 在抽穗期达到最高。 b-延展素的3个同工型只在后
期表达, 推测在花粉细胞生长和花粉管穿过柱头过程中
对细胞壁起松弛作用(Kerim et al., 2003)。
326 植物学通报 24(3) 2007
5 花粉蛋白质组与转录组的关系
基因表达过程中存在复杂的调控机制, 在一个生物体中
表达的蛋白质数量可能远远超出基因的数量, 因此, 转录
组特征并不一定与蛋白质组特征完全一致。在全基因
组范围内比较花粉转录本和蛋白质表达水平对于分析花
粉的基因表达调控方式具有一定意义。然而, 目前的
基因芯片技术很难获得全基因组信息, 即使是ATH1芯
片也只覆盖了80%的拟南芥基因组, 而蛋白质组技术就
几乎不可能在全基因组范围内来评价功能蛋白质的表达
情况。已经报道的拟南芥花粉转录组特征主要来自3个
研究组(Becker et al., 2003; Lee and Lee, 2003; Honys
and Twell, 2003, 2004; Pina et al., 2005), 他们分别使
用了Affymetrix AG基因芯片(覆盖1/3拟南芥基因组)、
ATH1基因芯片(覆盖超过80%的拟南芥基因组)和基因
表达系列分析技术(serial analysis of gene expression,
SAGE)。由于技术和样品纯度的差异, 它们所反映出
的拟南芥转录组的具体信息并不完全一致。而应用 2-
DE-MS技术对花粉蛋白质组进行研究时, 由于受到材料
和实验方法的限制 , 也只获得了部分蛋白质信息
(Holmes-Davis et al., 2005; Dai et al., 2006, 2007)。
因此, 很难在全基因组范围内比较花粉转录组和蛋白质
组的关系。
目前已经报道的对拟南芥花粉蛋白质组与转录组的
比较, 都是将数据库提供的转录本丰度信息或上述研究
中报道的转录本信息, 与2-DE-MS策略获得的蛋白质组
信息进行的比较(Holmes-Davis et al., 2005; Noir et al.,
2005)。这些比较结果主要表现为 2种情况: 其一, 蛋
白质与相应转录本表达丰度一致。部分参与基础代
谢、细胞构建、蛋白质加工和胁迫防御的蛋白质与其
转录本都表现为高丰度, 而部分参与能量代谢和信号转
导的蛋白质与其转录本都为低丰度; 其二, 蛋白质与相应
转录本表达丰度相反。一些参与能量生成的蛋白质高
丰度表达, 但转录本丰度较低; 而一些参与细胞构建的蛋
白质低丰度表达, 但转录本丰度却较高。此外, 在成熟
花粉中未检测到肌动蛋白 1(At2g37620)、多聚半乳糖
醛酸酶(At3g07850)和逆糖基化多肽(At5g15650)等9种
蛋白质的转录本(Holmes-Davis et al., 2005)。这些结
果表明, 在花粉发育和萌发过程中, 转录调控和转录后调
控都起到了重要作用。一些转录本在花粉成熟时就已
经存在(如部分参与细胞构建的转录本), 但是并不翻译,
而是为花粉管生长过程中的蛋白质合成做准备。同时,
有些蛋白质在花粉成熟以前就依靠当时高丰度表达的转
录本大量合成(如部分参与能量代谢的蛋白质), 并在成
熟花粉中积累(其转录本已经降解), 为花粉萌发做准
备。另外, 那些在成熟花粉中表达却没有检测到转录
本的蛋白质有可能是绒毡层细胞释放并沉淀在花粉外
被中的蛋白质。
6 问题与展望
花粉蛋白质组学研究新发现了大量在花粉中表达的蛋白
质, 并揭示了花粉中表达蛋白质的功能类群特征, 为认识
花粉发育、萌发和花粉管生长的分子机制提供了新的
信息。但是由于受到生物学材料和技术手段的限制, 仍
然存在以下几方面的不足。(1)只获得了有限的花粉蛋白
质组信息。只是通过 2-DE-MS策略获得了拟南芥、水
稻和部分裸子植物花粉的部分蛋白质组信息。花粉蛋
白质表达谱局限在通过使用 IPG胶条(等电点范围在
pH3-10、pH6-11或 pH4-7)进行 2-DE获得, 这种手
段获得的表达谱只是全部表达蛋白质中有限的部分。
同时, 由于获得的花粉表达蛋白质数量有限, 基于这些信
息进行的蛋白质功能类群特征的分析也是片面的。(2)对
同工型蛋白质的分析十分有限。虽然利用2-DE获得的
蛋白质表达谱表现了由翻译后修饰形成的蛋白质同工型
的数量, 并通过特异荧光染料染色推测了可能的修饰类
型, 但是缺乏对蛋白质同工型修饰类型和修饰位点的准
确分析。(3)对花粉发育与萌发过程中关键时期差异表达
蛋白质的分析有限。由于很难获得大量花粉发育各个
时期的材料, 因此缺乏对单细胞花粉、双细胞花粉、
三细胞花粉、成熟花粉和萌发花粉(包括花粉管生长的
不同阶段)差异表达蛋白质组的全面分析。
随着蛋白质组学技术的完善并开始与其它分子生物
学技术结合, 我们可以在以下几方面深入分析花粉表达
327戴绍军: 花粉蛋白质组学研究进展
蛋白质的定性和功能特征。(1)花粉发育与萌发过程差异
表达蛋白质的功能分析。选择合适的材料(如百合或裸
子植物的花粉), 通过控制花粉萌发和花粉管生长过程,
利用蛋白质组学技术体系全面解析花粉萌发过程中不同
阶段的差异表达蛋白质, 继而利用分子遗传学策略分析
关键蛋白质的功能。比如, 通过构建超表达载体或者
RNAi载体, 利用转化技术获得某种基因超表达或者缺陷
的稳定表达株系; 利用基因枪技术获得特定基因在花粉
中瞬时表达系统, 并结合荧光染色和超微结构观察, 通过
分析花粉萌发和花粉管生长过程的形态学和生理学特征,
获得单个蛋白质的功能信息和亚细胞定位信息; 利用酵
母杂交技术或蛋白质芯片技术, 获得蛋白质间相互作用
信息。(2)花粉发育关键事件调控蛋白质分析。目前我
们只获得了花粉中高丰度表达蛋白质的信息, 而很多参
与关键事件调控的蛋白质为低丰度表达。我们可以通
过分离花粉细胞器(如细胞核、线粒体和内膜系统)富集
并定位低丰度表达蛋白质, 继而利用多维蛋白质鉴定技
术(MudPIT), 或者通过使用窄pH范围 IPG胶条结合荧
光染料染色提高2-DE的分辨率和检测灵敏度, 从而解析
参与花粉关键事件调控蛋白质, 并利用遗传学手段分析
其功能。(3)深入分析同工型蛋白质的序列特征、修饰
类型和修饰位点。利用亲合纯化技术、荧光染色技术
与串联质谱技术确定翻译后修饰类型和准确的修饰位点,
从而阐明蛋白质功能特征和亚细胞定位机制。总之, 花
粉蛋白质组研究刚刚起步, 随着基因组信息的丰富和蛋
白质组技术平台的完善, 花粉蛋白质组学研究方向将是
不断深入地分析花粉蛋白质的定性和功能特征, 为解析
花粉发育与花粉管生长的分子机制提供更多信息。
致谢 感谢中国科学院植物研究所王台研究员对本
文提出的宝贵建议。
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(责任编辑: 孙冬花)
Research Advances on Pollen Proteomics
Shaojun Dai1,2
1College of Biology Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
2College of Life and Environmental Sciences, Harbin Normal University, Harbin 150080, China
Abstract Pollen is a highly reduced organism that plays a great role in plant sexual reproduction as the male gametophyte. Much
research has focused on the molecular mechanism of pollen development, the interaction with the pistil, germination, and pollen
tube growth. In recent years, high-throughput proteomic approaches allowing for proteomic investigation of the pollen of rice,
Arabidopsis and gymnosperms have led to characterization of a functional category of proteins expressed in pollen. Proteins
involved in wall remodeling and metabolism, protein metabolism, cytoskeletal dynamics and signal transduction are highly repre-
sented in pollen, and 25% of proteins appear as multi-isoforms. This paper gives an overview of recent pollen proteomic investigations.
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《发育神经生物学 ( 第二版 ) 》
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发育神经生物学是神经科学的一个重要分支学科。本书在参阅国际出版相关专著的基础上, 结合近年发育神经生物学的
进展, 着重介绍了神经系统从发育至老化中的有关问题及其分子调控与研究方法, 在第一版基础上增加了新的内容。全书共
19章, 由多位专家教授编纂而成。本书适合从事神经科学的教研人员和研究生使用, 也可供生命科学相关专业的学者及医学
院校师生参考。
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因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、抗体工程、组织工程和生物芯片 7 篇, 共 33 章。本书可作为高等院校生物
学专业学生的教材, 也可供综合性大学、师范、农林、医药院校相关专业本科生、研究生及教师使用。
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