全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 407-414, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-10-10; 接受日期: 2007-12-11
基金项目: 国家自然科学基金(No.30670204)、国际科学技术合作项目(No.2004DFB00300, No.2006DFB63400)和教育部科技重点项
目(No.104151)
* 通讯作者。E-mail: qxb_2003@163.com
.研究论文.
麻疯树 curcin启动子的分离及其在转基因烟草中
的功能分析
秦小波, 高继海, 徐莺 *, 张金平, 邵彩霞, 林莎, 张淑文, 江璐玎, 李月琴, 陈放
四川大学生命科学学院, 成都 610064
摘要 核糖体失活蛋白是一类可以使核糖体28S rRNA的保守a茎环结构域脱嘌呤的蛋白质。麻疯树毒蛋白(curcin)前体基
因编码麻疯树胚乳I 型核糖体失活蛋白。从麻疯树基因组中克隆得到其5侧翼区0.6 kb长的片段, 将该片段插入pBI121载体置
换其中的CaMV 35S启动子并在相应的转基因烟草中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现, 该0.6 kb
长的片段能够启动报告基因在种子中的表达, 并且其在种子不同发育阶段的表达活性存在差异。同时, GUS组织化学染色定位
分析表明, 在双子叶植物中该启动子片段是胚乳特异性表达的, 它从心形胚时期开始持续地在烟草的胚乳中发挥启动活性。
关键词 curci n, 麻疯树, 启动子, 核糖体失活蛋白
秦小波 , 高继海 , 徐莺 , 张金平 , 邵彩霞 , 林莎 , 张淑文 , 江璐玎 , 李月琴 , 陈放 (2008) . 麻疯树curci n启动子的分离及其在转基因烟草
中的功能分析. 植物学通报 25, 407-414.
在植物发育和遗传工程中, 研究者总是希望目的基
因在特殊的组织和器官里能够达到期望的表达水平。
基因的不同表达模式, 例如组织和器官的特异性、植物
发育中的独立性等, 在植物的生长发育中非常重要。由
于分子调控元件是建立生物反应器所需要考虑的一个重
要前提, 因此研究植物中能够调控外源基因表达的分子
元件非常必要 , 而启动子正是其中一种重要的类型
(McElroy and Brettel l, 1994)。
在植物中, 核糖体失活蛋白具有十分重要的生物学
功能。麻疯树毒蛋白(curc in)作为一种核糖体失活蛋白,
主要贮存在含油植物麻疯树种子的胚乳中(王小行等,
2006), 并且含量很高(Mourgue et al., 1961)。它具有
和巴豆毒蛋白(crot in)相似的动物毒性和蛋白质合成抑制
能力(Stirpe et al., 1976), 其半抑制系数仅略低于美洲
商陆蛋白(Barbieri et al., 1993)。许多研究表明该类蛋
白可能具有多种生物学功能, 如参与植物的防御体系等
(Barbieri et al. , 1993; Stirpe, 2004)。因此, 研究它的
表达模式将有助于其在医药上的开发应用。启动子是
调控基因表达的一项重要因素, 是帮助基因在恰当的时
间和地点实现功能的前提之一。目前, 本实验室已克隆
得到编码一种curcin蛋白的基因序列(Lin et al. , 2003),
但对该基因的表达模式尚未开展研究, 同时在以往有关
核糖体失活蛋白研究的报道中也未发现对其启动子的相
关研究。因此, 本研究针对 curc in基因 5上游长度为
620 bp的序列进行分析研究, 通过生物信息学和转基因
的方法鉴定了该片段的启动子活性及其强度和组织特异
性, 为进一步了解 curcin在麻疯树生长发育中的作用以
及构建胚乳特异型基因工程载体奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
麻疯树(Jatropha curcas L.)成熟种子采自四川攀枝花地
区。采收暖房中萌发后生长 2个月的叶片, 根据Wang
等( 1 99 6 )的方法提取麻疯树核基因组 D NA。烟草
(Nicot iana tabacum) 品种为NC98, 由本实验室保存并
繁殖。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 JM109、根癌
农杆菌(Agrobacterium tumefac iens) 菌株 EHA105及
408 植物学通报 25(4) 2008
质粒 pBI121 等均由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩增 curcin 5 端序列
根据 curc in 全长基因(GenBank No. AF469003)设计
PCR 反应引物, 序列如下: 引物 P1F, 5-CCAAAGCTT
(HindIII)-AATATTGGAATAGAAGACTTTG-3; 引物
P2R, 5 -CCA GG ATCC(B am HI) -CA AA TATCA -
TTATACGAATACG-3。扩增所用酶为 Vent DNA 聚合
酶(New England Biolabs)。PCR程序如下: 95°C 5分
钟; 94°C 40秒, 56°C 40秒, 72°C 2分钟, 循环 35 次;
72°C 8分钟。在 PCR产物 3末端加腺嘌呤核苷酸后,
连接入 pMD18-T 载体, 转化大肠杆菌 JM109 感受态细
胞, 获得阳性转化子后经专业公司测序鉴定正确性。
1.2.2 植物表达载体的构建
将含有 curc in基因启动子的重组质粒(pMD18-CP1)经
HindIII和 BamHI双酶切, 回收目的片段。将 pBI121载
体(Chen et al. , 2003)进行同样的双酶切, 去除花椰菜
花叶病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)35S启动子
片段, 回收载体大片段, 与目的片段连接, 转化JM109感
受态细胞。在含 100 mg.L-1卡那霉素(Kan)的 LB 培养
基上进行初步筛选, 提取阳性克隆的质粒进行酶切鉴定,
得到重组质粒 pBI121-CP1(图 1)。
1.2.3 烟草的转化
分别将pBI121和pBI121-CP1质粒用直接法导入农杆菌
EHA105感受态细胞中(Hoekema et al. , 1983; Komari
et al. , 1996), 然后采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法
(Horsch et al. , 1985), 获得转基因烟草植株。烟草培
养温度均为 28°C, 相对湿度为 70%。
1.2.4 转基因烟草的 PCR鉴定和 Southern杂交检
测
取转基因烟草植株的叶片, 用改良的 CTAB法(Wang et
al., 1996)提取总 DNA。根据 pBI121的序列(GenBank
No . A F 485 783 ) , 设计如下引物: 引物 P 3F , 5 -
AGAGGCTTACGCAGCAGGTCTC-3; 引物 P4R, 5-
GG AA GG GTCTTGCGA AG GATAG -3 , 用于检测
pBI121质粒的转化植株。此外, 引物 P1F和 P2R用于
检测 pBI121-CP1质粒的转化植株。选取 PCR检测为
阳性的植株, 用HindIII对其基因组DNA 进行消化, 0.8%
琼脂糖凝胶电泳分离, 再转移到尼龙膜上固定(Sambrook
and Russell, 2002)。采用 PCR-DIG探针标记试剂盒
以引物对(5-CAGGAAGTGATGGAGCATCAG-3和 5-
TCGTGCACCATCAGCACGTTA-3)制备地高辛标记的
b-葡萄糖醛酸酶基因(GUS ) 探针片段(638 bp)。最后
采用地高辛标记和检测试剂盒进行杂交和显色处理。
1.2.5 GUS 活性荧光分析
采用荧光分析法(Jefferson et al., 1987)测定转基因烟草
各组织器官的 b-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性。以单位时
间内单位蛋白产生4-methylumbelliferone(MU)的量比较
各启动子对GUS表达的影响。取 5 组数据的平均值作
为本次实验的结果。实验设 3次重复, 取 3次实验数据
的平均值进行比较。分别取根、幼叶(5 c m)、幼茎、
花(花后 2天, 2 DAF)、种子(20 DAF)、叶片(20 cm)、
茎和成熟种子(35 DAF)作为材料。取 0.5 g样品置于
预冷的研钵中, 加0.5 mL预冷的研磨缓冲液(0.05 mol.
L-1 NaHPO4 pH 7.0, 0.1% SDS, 0.01 mol.L-1 EDTA
pH 8.0, 20%甲醇, 0.1% Triton X-100, 0.1% b-巯基乙
醇), 迅速研磨成匀浆后转入预冷的 1.5 mL离心管中,
2 800×g, 4°C离心 10分钟, 上清液即为GUS 蛋白粗提
取液。按照 Jefferson等(1987)的方法进行酶促反应, 在
365 nm激发光下测定酶反应产物的 455 nm荧光强度。
同时采用 B ra d fo r d 法测定蛋白质含量(B r ad fo rd ,
1976 )。
1.2.6 GUS活性的组织化学染色分析
根据 Jefferson等(1987)的方法, 将待测烟草样品与含X-
gluc底物的染色反应液(0.5 g.L-1 X-gluc , 0.075 mol.
L-1 Na2HPO4, pH 7.0, 0.05 mmol.L-1 K3Fe(CN)6,
0.05 mmol.L-1 K4Fe(CN)6, 0.01 mol.L-1 EDTA, pH
8.0, 20% 甲醇, 0.1% Triton X-100)于 37°C保温过夜,
409秦小波等: 麻疯树 curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析
用 75% 乙醇脱色, 观察并照相。
2 结果与分析
2.1 麻疯树毒蛋白(curcin)基因5调控区的分离
及分析
利用引物 P1F和 P2R, 从麻疯树基因组 DNA 中扩增得
到一条长度为 620 bp 的片段CP1(GenB ank No .
E F 6 1 27 3 9 )。分析该序列发现, 它与之前登录到
GenBank 上的一条序列(No. AF469003)有90%以上的
相似性, 其差异主要表现在一些零散的单核苷酸多态位
点以及短的重复序列插入或缺失。在植物启动子元件
预测数据库中对该序列进一步分析显示, 该片段含有 1
个 TATA 盒和 3个 CAAT盒。同时, 还存在一些与胚乳
特异性表达调节相关的功能元件, 例如 DO F CO RE
(Yanagisawa, 2000)、DPBFCORE (Finkelstein and
Lynch, 2000) 和 E-box (Hartmann et al., 2005)等。
其中, DOFCORE 是 Yanagisawa和 Schmidt(1999)用
DNA结合位点筛选实验研究一种玉米胚乳特异性 DNA
结合蛋白(prolamin-box binding factor, PBF)的DNA结
合位点时发现的。其共有的特征序列是 N N N A /
TAAAGNGN, 主要位于麻疯树CP1片段中。E-box 的
保守基序为 CANNTG, 是控制贮藏蛋白 napA在油菜种
子中表达的启动子顺式作用元件, 在CP1片段中则位于
预测的 DOFCORE 元件下游。另外, CP1中还存在与
胚乳特异性表达相关的功能基序 P r o l a m i n b o x
(TGCAAAG)(Wu et al. , 2000)。其它光诱导、激素
诱导、病原体诱导以及脱水应答相关的启动子基序也
普遍存在于该启动子中(Higo et al. , 1999), 例如GT-1
结合位点(G RW A A W, R=A / G , W = A /T)、I -box
(GATAA)、MYB识别位点(YAACKG, Y=C/T, K=G/T)
和W-box(TTGAC)等。
根据上述分析结果, 该CP1片段极有可能就是驱动
curc in表达的特异性启动子片段。因此将 CP1片段插
入 pBI121载体中, 置换其中的CaMV 35S 启动子, 构
建成为一个植物表达载体(图 1), 同时用 pBI121质粒本
身作为对照进行后续分析。
2.2 转基因烟草的再生及检测分析
通过农杆菌的浸染和卡那霉素筛选, 共获得28株转化重
组质粒pBI121-CP1的卡那霉素抗性烟草和25株转化质
粒 pBI121的卡那霉素抗性对照烟草。用 PCR方法初
步鉴定这些抗性烟草植株。对于转化重组质粒 pBI121-
CP1的卡那霉素抗性烟草, 使用引物 P1F 和 P2R, 经
PCR反应后, 转化成功植株DNA 可以扩增到一条 620
bp长的片段, 从而得到鉴定。同样对于转化质粒pBI121
的卡那霉素抗性对照烟草, 使用CaMV 35S启动子特异
引物P3F和P4R, 可以从阳性植株中扩增到一条0.7 kb
长的片段, 从而鉴定出含有质粒 pBI121的对照烟草植
株。通过该步骤, 进一步筛选得到了 21 株含重组质粒
pBI121-CP1的转基因烟草和 18株含质粒 pBI121的对
照烟草(图 2 )。
图 1 表达载体构建模式图
Figur e 1 Strategy for cons truction of express ion vectors
410 植物学通报 25(4) 2008
为进一步鉴定阳性转基因植株并确定其转入片段的
拷贝数, 选取GUS上一段长度为 638 bp的片段作为探
针, 进行 Southern杂交分析。由于所构建的质粒载体
上只含有 1个 HindIII 限制性内切酶的识别位点, 在用
HindIII对转基因烟草基因组DNA进行酶切后, 探针应该
与含有完整整合片段的酶切片段相结合。而且由于片
段在基因组中整合的位置不同会产生不同长度的酶切片
段, 因此杂交分析中的条带数即可以代表转基因植株中整
合的目的片段的拷贝数。通过分析, 确定阳性植株中被
整合入烟草基因组中的目的片段有 1-3个拷贝(图 3)。
2.3 GUS活性定量分析和启动子活性比较
在 T0代转基因烟草中, 对每一转基因系的10株PCR阳
性植株进行 GUS 活性定量分析。根据 Southern杂交
结果, 为避免转基因烟草中目的片段插入位置不同造成
的影响, 从每一转基因系中GUS活性值相近的多数植株
中选取 3株进行 T1和 T2代的培育并进一步分析。在T1
代中, 选取每个转基因系中的 5株 PCR阳性植株进行
GUS活性检测, 以检测到的平均 GUS 活性值来衡量每
个启动子的活性。
图 4A显示了 T0代转基因烟草茎、叶和种子组织中
的GUS活性情况。从中可以看出, 在 CP1转基因烟草系
中, 种子的GUS活性(84.23 nmol 4-MU.min-1.mg-1protein)
最高, 而叶片(0.19 nmol 4-MU.min-1.mg-1protein)和茎
(0.12 nmol 4-MU.min-1.mg-1protein)中的GUS活性很
图 2 转基因烟草的部分PCR分析结果
(A) pBI121转基因烟草株系的PCR分析; (B) pBI121-CP1转基因
烟草株系的PCR分析
M: DL2000 DNA marker; C1: 相应的转染质粒阳性对照; C2: 野生
型烟草; 35S-1-35S-8: 含有CaMV 35S启动子的各转基因烟草植
株; CP1-1-CP1-8: 含有CP1启动子的各转基因烟草植株
Figur e 2 Partial results of PCR analys is of transgenic plants
(A) PCR analys is of putative transgenic tobacco plants trans-
formed w ith pBI121; (B) PCR analysis of putative transgenic
tobacco plants trans formed w ith pBI121-CP1
M: DL2000 DNA marker ; C1: The cor responding plasmid used
for transf ormation as posit ive control; C2: Non-transgenic to-
bacco plants as negative control; 35S-1-35S-8: Transgenic
tobacco plants containing CaMV 35S promoter ; CP1-1-CP1-8:
Transgenic tobacco plants containing CP1 promoter
图 3 转基因烟草的Southern杂交分析
WT: 野生型烟草; 35S-3、35S-4、35S-7和 35S-8: pBI121转
基因烟草植株; CP1- 1、CP1- 4、CP1 -6、CP1- 8和 CP1- 9:
pBI121-CP1转基因烟草植株
Figure 3 Southern hybr idization analysis of transgenic to-
bacco plants
WT: Non- transgenic tobacco plants ; 35S-3, 35S-4, 35S-7 and
35S-8: Transgenic tobacco plants trans formed w ith pBI121;
CP1-1, CP1-4, CP1-6, CP1-8 and CP1-9: Transgenic tobacco
plants transformed w ith pBI121-CP1
411秦小波等: 麻疯树 curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析
低, 可以忽略不计。而在含有CaMV 35S 启动子的转
基因烟草系中, 各组织中的 GUS 活性都较高。通过对
CP1和CaMV 35S启动子的活性进行比较, 发现前者在
烟草种子中的活性略低于后者。
在T1代转基因烟草中, 进一步对CP1和CaMV 35S
启动子进行了时空表达方面的检测(图 4B)。结果发现,
除种子外, CP 1 转基因烟草植株的根、幼茎、幼叶、
花瓣、花萼、雄蕊、柱头、子房、叶片和茎组织
中的GUS活性都非常低, 可以忽略不计。T1代 CP1转
基因烟草系开花后20天的种子中表现出较低的GUS活
性, 但开花后 35天则显示出很高的 GUS活性。在含有
CaMV 35S 启动子的对照烟草株系中, 除幼茎外, 其它
各组织中的GUS 活性都较高。由此表明 CP 1启动子
的种子偏好性表达起始于转基因烟草种子发育的某个时
期。与 CaMV 35S 启动子在几乎所有的组织和发育阶
段都能表达的特点相比, CP1启动子片段的表达更加独
特和专一。
2.4 组织化学染色分析
为进一步了解 CP1片段在种子发育过程中具有的时空
表达驱动特性, 将 T1 代转基因烟草在开花前一天套袋,
使其自花授粉。然后收集授粉后不同发育时期的果实,
进行GUS 表达的组织化学定位分析。分析发现, GUS
组织化学染色的蓝色斑点首次出现于胚胎发育进入心形
胚后, 然后一直持续到成熟种子时期, 并且严格定位于
胚乳区域(图 5)。这表明CP 1启动子在麻疯树自身体
系中的时空表达模式及发育中的调控机制与在异源植
物体系烟草中的情况非常相似。因此, CP1片段应该
是一个胚乳特异性的启动子, 并包含了至少大部分的顺
式调控元件。
3 讨论
在本研究中首次对麻疯树 curcin基因的 5上游 CP1序
列进行了克隆和分析。结果显示, 该片段富含胚乳和种
子特异的启动子元件, 不仅在转基因烟草植株中具有启
动子活性, 同时还严格地将其下游基因的表达限制在转
基因植株心形胚时期以后的种子胚乳中, 这种情形与
curcin在麻疯树种子中的表达积累情况相吻合, 因此该
片段应该就是调控 curc in基因表达的启动子。同时研
究也证实麻疯树中的启动子在烟草等其它异源植物中也
能发挥作用。但还需进一步开展更深入的研究工作。
本实验室早期的研究数据显示, 麻疯树中 curcin毒
蛋白的含量至少可占种仁总蛋白含量的 13.5%, 这表明
图 4 转基因烟草中的启动子活性分析
(A) 启动子在T0代转基因烟草中的活性比较; (B) 启动子在T1代
转基因烟草中的时空表达分析
WT: 野生型烟草; 35S: 转入 35S 启动子的阳性对照烟草; CP1: 转
入 curci n基因启动子片段(0.6 kb)的烟草
1: 根; 2: 幼茎; 3: 幼叶; 4: 花瓣; 5: 花萼; 6: 雄蕊; 7: 柱头; 8: 子房;
9: 成熟叶片; 10: 茎; 11: 花后 20天的种子; 12: 花后 35天的种子
Figur e 4 A nalysis of promoter ac tiv ity in transgenic plants
(A) Compar ison of promoter ac tiv ity in f ir st generation of
transgenic plants (T0) ; (B) Temporal and spatial analys is of
promoter ac tiv ity in next generation of transgenic plants (T1)
WT: Wild type tobacco plants as negative control; 35S:
Transgenic plants integrated 35S promoter as a nominally con-
stitutive control; CP1: Transgenic plants integrated 5 f lanking
fragment of curci n gene(0.6 kb)
1: Root; 2: Y oung s tem; 3: Young leaf; 4: Petal; 5: Calyx; 6:
Stamen; 7: Stigma; 8: Ovary; 9: Mature leaf; 10: Mature s tem;
11: 20-DAF seed; 12: 35-DAF seed
412 植物学通报 25(4) 2008
图 5 烟草种子的GUS活性组织化学染色纵切图
em: 胚; en: 胚乳
(A) 转入CaMV 35S启动子的转基因烟草种子, 胚和胚乳均染上
蓝色;
(B) 野生型烟草成熟种子, 均不能染上蓝色;
(C) 转入CP1 启动子的转基因烟草成熟种子, 仅胚乳被染上蓝色;
(D) 野生型烟草心形胚时期的种子, 均不能染上蓝色;
(E) 转入CP1启动子的转基因烟草心形胚时期的种子, 仅胚乳被染
上蓝色
Figur e 5 His tochemical analys is of GUS activity in tobacco
seed pod longitudinal sec tions
em: Embryo; en: Endosperm
(A) Seed of transgenic tobacco containing CaMV 35S promoter,
w ith both embryo and endosperm s tained in deep blue;
(B) Wild- type tobacco seed at mature embryo period, no blue is
visible;
(C) Seed of transgenic tobacco containing CP1 at mature em-
bryo period, the full of the endosperm is the only main region
w hich show s GUS activity;
(D) Wild-type tobacco seed at hear t-shape embryo period, no
blue is vis ible;
(E) Seed of transgenic tobacco containing CP1 at heart-shape
embryo per iod, only the main region of developmental en-
dosperm is stained in blue
CP1启动子在内源体系中的活性应强于 CaMV 35S 启
动子。然而本实验通过对GUS 活性分析表明, 在转基
因烟草中 CP1启动子的表达活性不及 35S 启动子。造
成这种现象的原因可能有 2个。其一是 curc in的表达
除了现有 CP 1片段之外, 在其上游、下游或其它位置
还存在另外的表达增强元件, 能够提高 curcin的表达水
平; 或者由于烟草和麻疯树本身的差异, 导致在烟草胚乳
细胞中缺乏促进 curcin表达的反式调控因子, 因此使得
其表达未达到应有的水平。其二, 本实验中 35S启动子
启动的GUS 表达水平相对高于之前报道的在烟草中的
表达水平(Jefferson et al., 1987), 可能也存在一定影响。
此外, 各种生物和非生物胁迫条件对CP1片段表达
的影响还有待研究。早期的关于其它植物核糖体失活
蛋白的研究报道以及本实验室的前期研究结果表明, 一
些核糖体失活蛋白基因的表达与胁迫条件息息相关, 而
尽管预测分析显示CP1片段中有一些病原诱导、脱水
诱导的应答元件(Higo et al., 1999), 但它是否真正参与
了这种调控还不得而知。
分析还显示其它植物基因启动子中与胚乳特异性表
达相关的顺式元件也出现在 cu rc in 基因的启动子中。
因此, 为了进一步研究该启动子中与胚乳特异性表达相
关的顺式元件的功能特征, 更加深入的启动子缺失和突
变分析以及对其它远端调控因子和相关反式转录因子的
研究是必要的。
由于CaMV 35S启动子不能满足启动目的基因在特
定组织中表达的要求, 而在植物生物反应器的研究中种
子是作为反应器的重要器官。因此, 能有效启动基因在
种子中进行特异表达的启动子和顺式调控元件显得尤为
重要。此外, 分离和比较种子特异性表达的启动子还有
助于揭示组织特异性、相对启动活性和发育进程中的
时空调节与序列之间的关系, 同时有助于发现顺式调控
序列的新特性, 从而满足遗传工程的特定要求。
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Isolation of Curcin Promoter from Jatropha curcas and Analysis in
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Co lle ge o f L ife Sci ences, Sichua n Universi ty, Ch engd u 6 100 64, Chi na
Abstr act Ribosome- inactivating proteins (RIPs ) represent a type of proteins that universally depur inate the conserved a-sarcin
loop of ribosome 28S rRNA. A 0.6-kb fragment of the 5 f lanking region preceding the curci n gene, encoding a type I RIP of Jatropha
curcas, w as cloned, and its express ion pattern w as s tudied by b-glucuronidase (GUS) assay in transgenic tobacco. The result
show ed that this fragment w as suff icient to drive the repor ter gene expression in seeds. Histochemical analys is revealed that the
promoter w as expressed specif ically in endosperm in the dicoty ledonous sys tem of tobacco, star ting from the embryo at the hear t-
shape s tage.
Ke y w ords cu rci n, Ja tro pha cu rca s, prom ote r, ribo som e-i nact iva tin g prote in
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* Author for correspondence. E-mail: qxb_2003@163.com
(责任编辑: 刘慧君)