全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (3): 292-297, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-01-08; 接受日期: 2007-05-29
基金项目: 国家林业重点科学技术研究计划林业新技术开发与储备专项(2006-12)、湖南省科技三项基金(No.00JZYZ115)和中南林业
科技大学青年基金(No. 0700913)
* 通讯作者。E-mail: tanx iaof engcn@126.com
.实验简报.
白梨和砂梨 S基因型确定及 S34新基因的分离
曾艳玲 1 , 谭晓风1*, 张党权 1 , 李秀根2 , 曾晓峰 1
1中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室, 长沙 410004
2中国农业科学院郑州果树研究所, 郑州 450009
摘要 梨是配子体型自交不亲和植物, 确定不同品种的S基因型是科学杂交授粉及提高梨产量和品质的基础。本文根据砂梨
S1-9等位基因一级结构特征, 设计特异引物PF和PR, 以白梨(Pyrus bretschneideri)品种鹅梨(Pyrus bretschneideri ‘El i’) 和砂
梨(Pyrus pyrifo lia)品种博多青(Pyrus pyri fo lia ‘Hakataao’) 的叶片基因组DNA为模板, 通过 PCR-RFLP系统检测、克隆测
序以及生物信息学分析, 分离鉴定了它们的片段大小相似的2条S等位基因, 从中获得1条新的S基因, 命名为S34-RNase基因, 并
确定了这2个梨品种的S基因型, 分别为鹅梨S13S34和博多青S22S34。
关键词 分离鉴定, 梨, S基因型, S34-RNase基因
曾艳玲 , 谭晓风 , 张党权 , 李秀根 , 曾晓峰 (2008). 白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离. 植物学通报 25, 292-297.
迄今为止, 研究较多的配子体自交不亲和植物主要
为茄科、蔷薇科和玄参科植物, 它们都是由单一位点的
复等位基因(S 基因)控制自交不亲和反应(陈晓流等,
2004 )。梨属于蔷薇科(Rosac eae )苹果亚科(M al oi -
deae)梨属(Pyrus L.)。如果 S基因型相同的 2个梨品
种相互授粉则会发生不亲和现象, 座果率一般低于30%,
严重影响果实产量。因此, 确定各品种的 S基因型是开
展自交不亲和研究的基础, 可为科学配置授粉树提供理
论依据, 并可为梨品种的遗传改良奠定基础。
我国梨品种资源丰富, 虽然通过杂交授粉、PCR-
RFLP以及花柱S糖蛋白电泳等方法分离鉴定了部分新
的S等位基因, 确定了部分中国梨品种的S基因型(徐国
华等, 2004; 谭晓风等, 2005a, 2005b, 2005c, 2006;
乌云塔娜和谭晓风, 2005; 乌云塔娜等, 2006a, 2006b;
张妤艳等, 2006; 曾艳玲等, 2007), 但是仍然有很多梨
品种的 S 基因型需要探究。白梨品种鹅梨( P y r u s
bretschneideri ‘Eli’)和砂梨品种博多青(Pyrus pyrifol ia
‘Hakataao’)是很多优良杂交梨品种的亲本, 通过研究它
们的S等位基因可以间接了解其相关子代品种的S基因
型, 为自交不亲和性研究提供科学依据。本研究采用分
子生物学方法确定鹅梨和博多青 S基因型, 并从中分离
得到一条新的 S 等位基因(S 34)。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
供试品种鹅梨(Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Eli’)和博多
青(Pyrus pyrifolia Nakai ‘Hakataao’)取自中国农业科学
院郑州果树研究所。采集新梢嫩叶约 1 g, -75°C超低
温冰箱保存备用。其中, 鹅梨为中国白梨( P y r u s
bretschneideri Rehd.)品种, 博多青为日本砂梨(Pyrus
pyrifolia Nakai)品种(蒲富慎和王宇霖, 1963)。
1.1.2 菌种及药品
大肠杆菌DH5a为中南林业科技大学经济林育种与栽培
国家林业局重点实验室保存菌种。T 载体 p UC m - T
Vector购自上海申能博彩生物科技有限公司, PCR产物
293曾艳玲等: 白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离
回收试剂盒 Puprep Gel Extrac tion Kit (Spin Column)
购自安比奥生物技术有限公司, 引物由上海英俊生物技
术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA的提取
根据改良 CTAB 法(乌云塔娜等, 2003)抽提梨叶片基因
组DNA, 并且对提取的DNA进行进一步纯化(奥斯伯等,
1998 )。
1.2.2 引物设计
根据已报道的日本梨 S1-S9基因的相关信息, 获知梨S
基因的一级结构由 5个保守区(conserved region)、1个
高频可变区(hyper-variable region, HV)及 1个内含子
(intron)组成(Ishimizu et al ., 1998)。高频可变区(HV
区)是花粉识别的部位。S 基因多态性主要源于 HV 区
的差异, 通常根据 HV 区的差别判断不同的S基因。因
此, 本实验设计合成的正向引物PF(5-TGCCTCGCTCT-
TGAACAA-3)位于信号肽上游-32 bp左右, 反向引物
PR(5-AC(A/G)TTCGGCCAAATAATT-3)位于 HV 区下
游保守序列区段。
1.2.3 PCR扩增、产物克隆及测序
PCR扩增反应体系及循环条件参照谭晓风等(2006)的方
法。根据试剂盒使用说明书进行PCR产物回收, 参考
pUCm-T Vector使用说明进行 TA克隆。委托上海博亚
生物技术有限公司进行序列测定。
1.2.4 PCR-RFLP系统检测
日本学者(Ishimizu et al., 1999)采用特异引物 P1(5-
TTTACGCAGCAATATCAG-3)和P2(即本实验中的引物
PR)进行 S基因特异的 PCR扩增, 并在此基础上建立了
识别日本梨S1-9等位基因的PCR-RFLP系统, 通过PCR
产物的酶切情况初步判定不同梨品种的 S 基因型。
1.2.5 梨新 S 等位基因的生物信息学分析
首先通过 Blast初步确定所测S基因是否为新的S等位
基因, 然后从GenBank中下载已登录的S基因序列和氨
基酸序列, 运用 DNAMAN软件进行 S基因同源性分析,
并用GeneDoc软件将待分析的DNA序列转化成氨基酸
序列进行一一比对, 再进一步分析其一级结构特点。
2 结果与分析
2.1 PCR-RFLP系统分析
分别以鹅梨和博多青的叶片基因组DNA为模板, 扩增特
异引物 PF 和 PR之间的 S基因片段。结果显示这 2个
品种 PCR产物的电泳谱带大小均为 500 bp左右(图1)。
利用 PCR-RFLP 分析系统中的限制性核酸内切酶对特
异PCR产物进行酶切, 结果2个品种的S基因都无法被
消化分离, 说明这 2个品种都不含有S1-9 等位基因。
2.2 S基因克隆测序及S34新基因的确定
将鹅梨和博多青的 S基因特异 PCR产物分别进行克隆,
各随机挑取 1个阳性克隆进行测序。测序结果显示, 鹅
梨和博多青所测阳性克隆中所含 S 基因片段大小均为
465 bp, 且序列完全相同。根据梨 S等位基因引物 P1/
P2之间的序列, 利用DNAMAN软件对该S基因与已登
录GenBank 的梨 S 等位基因进行序列相似性比较(图
2)。结果发现该S基因与 S17序列相似性为99%, 因此
将该 S 基因与 S17 单独进行比较, 结果显示它们之间外
显子有 3处不同, 而且该 S基因内含子区域有 1处碱基
缺失(图 3)。去除该 S 基因的内含子序列, 推导 HV 区
及其周边区的氨基酸序列, 并与 S17 推导氨基酸序列进
行比对分析, 发现该 S 基因仅 1处氨基酸残基与 S17 的
不同, 即 S17的脯氨酸(P)在该 S基因中被替换为亮氨酸
(L) (图 4 )。差异之处恰好位于HV 区, 而 HV 区为 S -
RNase的特异识别区, 通常根据该区的差别来判断不同
的 S 基因型(乌云塔娜和谭晓风, 2005)。因此确定该S
基因为新的 S 基因, 命名为 S 34-RNase 基因, 提交
GenBank, 登录号为 DB269500。
2.3 S基因型的确定
应用 DNASIS软件对 S34的序列进行酶切位点分析。选
294 植物学通报 25(3) 2008
择酶切位点单一且较特异的限制性核酸内切酶EcoRI(图
5), 分别对鹅梨和博多青其它阳性克隆的S 基因产物进
行酶切分析。各选取一个特异产物酶切不消化的阳性
克隆进行测序。鹅梨所测阳性克隆中所含 S 基因片段
大小为 474 bp, 与 S13相似性为 99%。将该序列与S13
序列中的内含子去除, 推导氨基酸序列, 两者的氨基酸序
列相似性为 100%, 因此认为鹅梨所含另一条 S 基因为
S13。博多青所测阳性克隆中所含 S 基因片段大小为
469 bp, 与S22序列相似性为100%, 因此认为博多青所
含另一条 S 基因为 S 22。
2.4 PF/PR间S基因片段一级结构分析
正向引物PF位于信号肽上游-32 bp左右, 反向引物PR
位于 HV区下游, 经PCR扩增能获得S基因起始密码子
序列 +信号肽序列+保守区 C1+保守区C2+高变区HV
(图 6), 以及起始密码子上游的部分序列。S13、S22 及
新 S 基因(S34)在 PF/PR区间的片段大小分别为 474、
469和465 bp, 内含子大小分别为150、148和141 bp,
外显子大小分别为 297、294和 297 bp, 分别编码 99、
98和99个氨基酸。根据相关文献分析(Ushijima et al.,
1998; Tamura et al. , 2000), S13、S22和 S34 信号肽均
由 27个氨基酸组成, 保守区C1编码11个氨基酸, 保守
区 C2编码 9个氨基酸。S13 和 S34 HV 区编码 15个氨
基酸, 而S22 HV区第7位缺失1个氨基酸, 共编码14个
氨基酸。这 3个 S基因的内含子插入位点均处于 HV区
图 1 鹅梨和博多青S基因特异PCR扩增
M: 100 bp标准分子参照物; 1: 博多青; 2: 鹅梨
Figur e 1 Specif ic PCR of S-alleles of Pyrus bretschnei deri
‘Eli’ and Pyrus pyr ifolia ‘Hakataao’
M: 100 bp marker ; 1: Pyrus pyr ifol i a ‘Hakataao’; 2: Pyrus
bretschneideri ‘Eli’
图 2 S34基因与已登录梨S基因的同源性比较
Figur e 2 Comparatively c lus tering of S34-allele and pear S-
alleles from GenBank
295曾艳玲等: 白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离
个氨基酸, 其中信号肽为 27个氨基酸, C1区为 11个氨
基酸, C2区为 9个氨基酸, HV 区为 15 个氨基酸。在
实验过程中, 白梨品种鹅梨和砂梨品种博多青的 S基因
均无法通过已建立的PCR-RFLP系统进行分离鉴定, 说
明中国的梨品种丰富, S 等位基因蕴藏量大。日本学者
以日本砂梨 S1-9等位基因为基础建立的 PCR-RFLP系
统已经不能适用于我国梨 S 基因型的鉴定。因此本实
验采用了克隆分离大小相近基因片段的方法来逐步确定
图 3 S34基因与S17基因核苷酸序列比较
Figure 3 Nucleotide sequence alignment of S34-allele and
S17-allele
图 4 S34基因与S17基因编码氨基酸序列比较
Figure 4 Putative amino acid sequence alignment of S34 -
allele and S17-allele
图 5 鹅梨和博多青PCR产物的EcoRI酶切分析
酶切产物大小为268 bp和197 bp. M: 100 bp标准分子参照物; 1:
博多青; 2: 鹅梨
Figur e 5 EcoRI digestion pattern of specif ic PCR products of
Pyrus bretschneideri ‘Eli’ and Pyrus pyr ifolia ‘Hakataao’
The band size of digested products: 268 bp+197 bp. M: 100 bp
marker; 1: Pyrus pyr ifolia ‘Hakataao’; 2: Pyrus bretschneideri
‘Eli’
图 6 引物 PF和 PR间鹅梨和博多青S基因编码氨基酸序列
Figur e 6 Putative amino acid sequence of S-alleles of Pyrus
bretschnei der i ‘Eli’ and Pyrus pyri fol ia ‘Hakataao’ betw een
PF and PR倒数第 6 和第 7 位氨基酸之间。
3 讨论
本实验通过 PCR-RFLP 系统检测、克隆测序以及生物
信息学分析, 确定了 2个梨品种的S 基因型, 分别为鹅
梨 S13S34和博多青 S22S34。其中 S34-RNase基因为梨
的新 S 基因, 其核酸序列及推导氨基酸序列已经登录
GenBank, 登录号为 DB269500。通过生物信息学分
析, 确定 S34-RNase基因在引物 PF/PR区间共编码 99
296 植物学通报 25(3) 2008
梨品种的 S基因型。除此方法外, 作者认为还可以采用
分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 S 基因片段。此
外, 也可以在已有信息的基础上构建梨 S基因的芯片进
行探针杂交确定其它梨品种的 S基因型。另外, 本实验
在白梨品种鹅梨和砂梨品种博多青中同时发现编码
S34-RNase的基因, 本实验结果也为白梨和砂梨具有很
近亲缘关系的观点(滕元文等, 2004) 提供了间接证据。
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297曾艳玲等: 白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离
Identification of S-genotypes of Pear Cultivars and Cloning
of S34-allele
Yanling Zeng 1, Xiaofeng Tan 1*, Dangquan Zhang 1, Xiugen Li 2, Xiaofeng Zeng1
1Ke y L aborato ry of Non -woo d Fore st Prod uct of Fo restry Min ist ry, Ce ntra l South Unive rsi ty of Forestry a nd
Te chn olog y, Cha ngsh a 4 100 04, Chi na; 2Zh eng zho u Frui t Rese arch Inst itute, CAAS, Zhe ngzhou 45 000 9, Chi na
Abstr act Pear is a typical fruit tree of gametophy tic self-incompatibility. Identifying the S-allele genotype of different pears is an
important scientif ic foundation f or arranging varieties f or pollination and c rossbreeding. It also es tablishes the f oundation f or
inher iting and improv ing pear cultivars. On the basis of the reported primary struc ture of pear S1-S9, the primers PF and PR w ere
designed. With the primers and leaf genomic DNA of cultivars Pyrus bretschneideri ‘Eli’ and Pyrus pyrifoli a ‘Hakataao’, w e used
PCR-RFLP, c loning, sequencing and bioinf ormatic analysis to isolate and identify the tw o S-alleles of amplif ication segments w ith
similar size. One of the S-alleles w as new ly identif ied and named S34-allele. S-genotypes of the tw o cultivars w ere identif ied as
Pyrus bretschneideri ‘Eli’ S13S34 and Pyrus pyrifoli a ‘Hakataao’ S22S34.
Ke y w ords isola te a nd ide nti fy, pea rs, S-gen otyp e, S34-a lle le
Ze ng YL, Tan XF, Zhang DQ, Li XG, Ze ng XF (2 008). Ide ntif icat ion of S -gen otyp es o f pe ar culti vars and clo ning of S34-all ele. Chin Bull
Bo t 25 , 29 2-29 7.
(责任编辑: 孙冬花)
* Author for correspondence. E-mail: tanx iaofengcn@126.com
第一届“植物器官发生的信号转导”学术研讨会
第一届“植物器官发生的信号转导”学术研讨会将于 2008年7月4-5日在北京中国科学院植物研究所召开。本届会
议由中国科学院植物研究所光合作用与分子生理学重点实验室和中国细胞学会植物分子细胞生物学分会主办, 中国科学院植
物研究所文献与信息管理中心学术交流与培训部承办。
本次会议主题是植物如何从单细胞的受精卵发育成为一个具有复杂结构和功能的个体, 这也是生物学研究领域最重要的
问题。此过程涉及器官发生的细胞水平调控、器官发生的启动和干细胞维持、组织结构的建立和精细调控、细胞之间的
信号转导和协作等一系列关键科学问题。“植物器官发生的信号转导”学术研讨会将在分子、细胞和生化水平上探讨这些
重大理论问题, 展现这一领域的最新研究成果。本次会议的特邀嘉宾均为国内外从事植物器官发生研究的知名华人学者。
欢迎对该领域感兴趣的研究人员、研究生和大学生参加。
联系地址: 北京市海淀区香山南辛村 20号 中国科学院植物研究所文献中心学术交流与培训部 邮编: 100093
电话: 010-62836216; E-mai l: fyf@ibcas .ac.cn, hsq50@ibcas.ac.cn